L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

Cette thèse de doctorat présente 3 études reliées à l’hybridation d’ADN fixée à un support solide et les phénomènes qui y sont associés. L’hybridation d’ADN en phase aqueuse est bien caractérisée, cependant plusieurs phénomènes et paramètres restent encore à déterminer lorsqu’un des brins est fixé sur un support solide. Un de ces paramètres est l’influence du brin complémentaire en fonction de la longueur de l’extrémité d’ADN cible immobilisée exposée à la phase aqueuse. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons établi une méthode pour digérer spécifiquement le brin d’ADN complémentaire pour simplifier l’hybridation sur support solide. La combinaison d’une molécule favorisant la digestion du brin complémentaire et d’une molécule bloquant la digestion du brin cible a permis de produire un ADN cible simple brin à l’aide de l’exonucléase Lambda, permettant d’obtenir des signaux d’hybridation supérieurs à ceux obtenus avec des ADN doubles brins. Ensuite, l’observation en temps réel de l’hybridation d’amplicons simples brins et doubles brins a permis de mieux comprendre les phénomènes de compétition entre le brin complémentaire et la cible. Finalement, les conclusions des deux premières études nous ont permis d’inventer une technologie tirant profit de la compétition entre le brin complémentaire et la sonde de capture et de l’activité exonucléase pour réaliser l’amplification PCR et l’hybridation sur biopuce en un seul site réactionnel et dans un seul tampon réactionnel. La combinaison de ces techniques aura pour effet une simplification des dispositifs et une diminution du nombre de réactifs permettant la fabrication de tests diagnostiques automatisés à moindre coûts. Les travaux de cette thèse ont permis d’approfondir nos connaissances sur les phénomènes reliés à l’hybridation sur support solide et de concevoir une technologie faisant l’objet d’une demande de brevet. La suite logique de ces travaux serait de poursuivre le développement et l’optimisation de la technologie pour augmenter ses capacités de multiplexage tout en l’intégrant à un dispositif microfluidique et à un instrument de détection qui combine amplification PCR et hybridation sur biopuce dans une seule réaction réalisée en une seule étape. / This thesis presents three studies related to the phenomenon related to DNA hybridization onto capture probes attached to solid support. The work was carried out in the context of infectious diseases detection, but the conclusions are of interest to any test based on the recognition of genetic material by solid support immobilized capture probes. DNA hybridization in aqueous phase is well characterised, however several parameters and phenomena related to hybridization onto solid supports are still to be determined. One of these parameters is the influence of the complementary strand in relation with the length of the solvent-exposed immobilized target strand. To better understand this phenomenon, we established a method to specifically digest the complementary DNA strands to simplify hybridization onto solid support. The presence of a molecule favorising digestion on the complementary strand and a blocking molecule on the target strand enabled selective digestion of the complementary strand using Lambda exonuclease in PCR buffer. Hybridization of single-stranded target DNA generated this way resulted in significantly higher fluorescence signals than those obtained with double stranded hybridization. Afterwards, observation of real-time hybridization of single-stranded amplicons and double-stranded amplicons to capture probes fixed onto solid support allowed for a better understanding of the competition phenomena between the complementary strand and the capture probe. Finally, the knowledge gained with the first two studies was used to invent a technology taking advantage of the competition between the complementary strand and the capture probe and exonuclease activity to perform single vessel and single buffer PCR amplification and microarray hybridization. The combination of these techniques will simplify devices and require fewer reagents storage and handling, facilitating production of automated diagnostic tests at lower costs. The works of this thesis have expended our understanding of the phenomena associated with hybridization onto a solid support and also resulted in the creation of a new technology covered by a patent application. The logical progression of this work is to further develop and optimize this technology by integrating it into a microfluidic device and an instrument compatible with the detection of microarrays to increase the multiplexing capabilities of molecular diagnostics.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / De toutes les lésions qui menacent l'intégrité du génome, les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont l'une des plus délétères, puisque toute cassure mal réparée suffit à induire des mutations et des translocations chromosomiques pouvant mener au cancer. La recombinaison homologue (RH) est un processus permettant aux cellules de réparer les CDBs de façon fidèle sans créer de mutations. Chez les eucaryotes supérieurs, ce mode de réparation repose en grande partie sur les fonctions catalytiques de la recombinase RAD51 et des évidences génétiques démontrent que ses paralogues, RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3, sont également des acteurs clés dans ce processus. Jusqu'à présent, les paralogues de RAD51 n'ont été que très peu caractérisés sur le plan cellulaire et moléculaire si bien que leurs fonctions précises demeurent mal définies. Dans cette étude, nous apportons des évidences implicant les paralogues de RAD51 humains dans les étapes précoces de la RH. Plus précisément, nous démontrons que le paralogue RAD51C interagit avec la recombinase RAD51 et qu'il est requis pour l'assemblage de cette dernière en foyers de réparation. De plus, nous établissons par des immunoprécipitations de chromatine que les paralogues sont recrutés à proximité d'une CDB unique en phase S-G2 du cycle cellulaire et nous montrons par immunofluorescence que RAD51C s'y accumule en foyers, une signature des enzymes de réparation. Par ailleurs, nous avons découvert que les paralogues de RAD51 jouent un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire. Tandis que l'inhibition par ARN interférence de RAD51B ou RAD51C provoque un arrêt prolongé en G2-M, celle de XRCC3 favorise l'entrée en mitose par le phénomène d'adaptation. La microscopie en temps réel a démontré que la perte de XRCC3 engendre un délai mitotique qui s'accompagne d'une fréquence élevée d'anomalies de centrosomes et de défauts de ségrégation chromosomique (micronoyaux et ponts anaphases). Des phénotypes mitotiques comparables sont obtenus suivant la depletion de la résolvase GEN1. Conséquemment, nous proposons qu'une fonction tardive de XRCC3 et de GEN1 dans la RH, soit au niveau de la résolution des jonctions de Holliday, puisse être à l'origine de ces aberrations mitotiques. L'ensemble de ces données permet d'éclaircir les fonctions distinctes et communes des paralogues de RAD51 lors de la RH ainsi que leur rôle dans le maintien de la stabilité du génome en mitose.

Les intégrons sont des éléments génétiques permettant la capture et l'expression de gènes sous la forme d'unités fonctionnelles nommées cassettes. Une cassette d'intégron est généralement constituée d'un gène suivi d'une séquence de recombinaison nommée site attC. Les cassettes sont mobilisables par un mécanisme de recombinaison spécifique de site qui est catalysé par une intégrase d'intégron. Les intégrons présents sur des éléments mobiles (les intégrons mobiles) sont grandement impliqués dans l'acquisition, l'expression et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries à Gram négatif. Malgré toutes les informations dont nous disposons sur les intégrons, les origines des gènes codant pour les intégrases d'intégrons (intl) retrouvés dans les intégrons mobiles demeurent imprécises. De plus, le mécanisme de formation des cassettes reste inconnu. Plusieurs indices suggèrent que les gènes intl retrouvés dans les intégrons mobiles proviennent de ceux présents dans les intégrons retrouvés dans les chromosomes de bactéries environnementales (les intégrons chromosomiques). D'autre part, des éléments génétiques mobiles ciblant les sites attC, nommés introns du groupe UC-attC, pourraient contribuer au recrutement des gènes en les associant avec des sites attC. Les objectifs principaux des travaux de cette thèse ont été divisés en deux volets : i) l'étude des activités de recombinaison d'une intégrase d'intégron chromosomique et ii) l'étude des introns bactériens du groupe UC-attC, dans le cadre de l'évolution des intégrons. L'objectif du premier volet de cette thèse consistait en l'étude des activités d'excision et d'intégration de l'intégrase IntINeu de l'intégron chromosomique de la bactérie environnementale Nitrosomonas europaea ATCC 19718 à l'aide d'un test de recombinaison in vivo. Les objectifs du deuxième volet consistaient en l'étude des introns du groupe UC-attC afin a) de caractériser les promoteurs internes permettant l'expression de cassettes de résistance aux antibiotiques, b) de définir les principes de base de la reconnaissance des séquences cibles (les sites attC), et c) de déterminer leur rôle potentiel dans la formation des cassettes d'intégrons. Les résultats obtenus dans le premier volet ont révélé que l'intégrase IntINeu peut capturer plusieurs cassettes de résistance aux antibiotiques retrouvées dans des intégrons mobiles. Ces résultats suggèrent que les gènes intl retrouvés dans les intégrons mobiles proviennent de ceux présents dans les intégrons chromosomiques de bactéries environnementales. Les résultats obtenus dans le deuxième volet ont révélé que les introns du groupe UC-attC possèdent potentiellement un ou deux promoteurs conservés permettant, à l'occasion, l'expression de cassettes de résistance aux antibiotiques. Ensuite, les études de mobilité de l'intron du groupe UC-attC S.ma.12 provenant d'un isolât clinique de Serratia marcescens ont révélé l'importance de la structure secondaire conservée des sites attC dans la reconnaissance des séquences cibles. Des expériences additionnelles de mobilité ont permis de démontrer que S.ma.12 peut cibler une variété de séquences correspondant à des sites attC, mais également à de possibles terminateurs de transcription. Des études in vitro ont révélé, pour certains des introns à l'étude, les produits d'épissage des exons, les activités de transcription inverse, de même que les activités ADN polymerase de protéines introniques purifiées. Les résultats obtenus dans le deuxième volet de cette thèse ont permis d'élaborer un modèle concret du mécanisme de formation des cassettes d'intégrons.

Les intégrons sont des éléments génétiques capables d'intégrer et de disséminer, par un mécanisme de recombinaison spécifique de site, des gènes de résistance aux antibiotiques trouvés sous la forme de cassettes. Ils contiennent un gène qui code pour une intégrase (intl) qui effectue la recombinaison en agissant sur deux sites cibles : le site attl en cis avec le gène d'intégrase et le site palindromique attC d'une cassette. Les intégrases d'intégrons sont donc directement impliquées dans l'accumulation et la formation de nouvelles combinaisons de cassettes de résistance dans la région variable des intégrons plasmidiques et il est donc important de mieux comprendre leur fonctionnement. Les travaux présentés à l'intérieur de cette thèse visent l'étude des interactions entre les intégrases d'intégrons et leurs sites d'attachement. Le premier objectif est de vérifier si la substitution de certains résidus peut permettre de modifier la capacité d'une intégrase d'intégron à exciser différentes cassettes. Pour ce faire, nous avons étudié l'intégrase chromosomique, SamlntLA, trouvée chez Shewanella amazonensis SB2BT afin de déterminer si cette enzyme est capable d'exciser différentes cassettes, de comparer son activité avec celles des intégrases SonIntIA et IntI2*179E et finalement de comparer les propriétés de l'enzyme sauvage avec celles de quelques enzymes mutantes. Nous avons donc testé la capacité de ces trois intégrases sauvages et de quelques mutantes à exciser plusieurs cassettes contenant différents sites attC. Les résultats démontrent que l'intégrase SamlntLA est beaucoup moins active que les intégrases SonIntIA et IntI2*179E pour effectuer l'excision des cassettes. Ils démontrent aussi que les substitutions V206R, V206K et V206H permettent d'augmenter l'efficacité de SamlntLA à exciser certaines cassettes mais que l'activité de ces intégrases mutantes est inférieure à celle montrée par les intégrases SonIntIA et IntI2*179E. Le deuxième objectif est d'analyser l'influence de l'identité des bases protubérantes et de l'espacement qui les sépare sur l'excision des cassettes par les intégrases d'intégrons. Nous avons ainsi effectué la mutagenèse du site attCdfrAi en amont de la cassette sat2 pour obtenir des variantes de séquences et d'espacement entre les bases protubérantes afin de déterminer comment ces modifications influencent la capacité des intégrases Intll, IntI2*179E, IntI3 et SonIntIA à exciser les cassettes. Nous avons ainsi démontré que l'intégrase Intll est plus efficace pour exciser les cassettes contenant des sites attC caractérisés par des bases protubérantes T et G séparées par 6 nucleotides tandis que l'intégrase IntI3 excise les cassettes contenant un nombre limité de sites attC. Nous avons aussi démontré que les intégrases IntI2*179E et SonIntIA tolèrent les changements de bases protubérantes et qu'elles excisent une plus grande variété de cassettes que les intégrases Intll et IntI3.

Durant la méiose, il se produit des échanges réciproques entre fragments de chromosomes homologues par recombinaison génétique. Les chromosomes parentaux ainsi modifiés donnent naissance à des gamètes uniques. En redistribuant les mutations génétiques pour générer de nouvelles combinaisons, ce processus est à l’origine de la diversité haplotypique dans la population. Dans cette thèse, je présente des résultats décrivant l’implication de la recombinaison méiotique dans les maladies chez l’humain. Premièrement, l'analyse statistique de données de génotypage de familles québécoises démontre une importante hétérogénéité individuelle et sexe-spécifique des taux de recombinaisons. Pour la première fois chez l’humain, nous avons observé que le taux de recombinaison maternel diminue avec l'âge de la mère, un phénomène potentiellement impliqué dans la régulation du taux d’aneuploïdie associé à l’âge maternel. Ensuite, grâce à l’analyse de données de séquençage d’exomes de patients atteints de leucémie et de ceux de leurs parents, nous avons découvert une localisation anormale des évènements de recombinaison chez les enfants leucémiques. Le gène PRDM9, principal déterminant de la localisation des recombinaisons chez l’humain, présente des formes alléliques rares dans ces familles. Finalement, en utilisant un large spectre de variants génétiques identifiés dans les transcriptomes d’individus Canadiens Français, nous avons étudié et comparé le fardeau génétique présent dans les régions génomiques à haut et à faible taux de recombinaison. Le fardeau génétique est substantiellement plus élevé dans les régions à faible taux de recombinaison et nous démontrons qu’au niveau individuel, ce fardeau varie selon la population humaine. Grâce à l’utilisation de données génomiques de pointe pour étudier la recombinaison dans des cohortes populationnelles et médicales, ce travail démontre de quelle façon la recombinaison peut affecter la santé des individus. / The intergenerational mixing of DNA through meiotic recombination of homologous chromosomes is, along with mutation, a major mechanism generating diversity and driving the evolution of genomes. In this thesis, I use bioinformatics and statistical approaches to analyse modern genomic data in order to study the implication of meiotic recombination in human disease. First, using high-density genotyping data from French-Canadian families, we studied sex- and age-specific effects on recombination patterns. These analyses lead to the first observation of a significant decrease in recombination rates with advancing maternal age in humans, with potential implications for understanding trisomic conceptions. Second, using next-generation sequencing of exomes from families of children with leukemia, we discovered unusual distributions of recombination breakpoints in some leukemia patients, which implicates PRDM9, a protein involved in defining the location of recombination breakpoints, in leukemogenesis. Third, using single nucleotide polymorphisms (SNPs) called from RNA sequencing data, we present a detailed comparison of the mutational burden between high and low recombining regions in the human genome. We further show that the mutational load in regions of low recombination at the individual level varies among human populations. In analysing genomic data to study recombination in population and disease cohorts, this work improves our understanding of how recombination impacts human health. Furthermore, these results provide insights on how variation in recombination modulates the expression of phenotypes in humans.

Plasmodium falciparum est un parasite protozoaire responsable de la forme la plus sévère de la malaria. Depuis quelques années, les cas de résistance aux antipaludiques sont devenus de plus en plus fréquents et de plus en plus répandus. En plus de sa résistance aux drogues actuellement disponibles, ce parasite reste jusqu' à aujourd'hui réfractaire aux vaccinations. L’identification de nouvelles approches basées sur l`inhibition spécifique de certaines de ses cibles moléculaires vitales est devenue une nécessité. La recombinase à site spécifique de P. falciparum (Pf-Int) est un enzyme qui a été récemment identifié dans le laboratoire à partir de PlasmoDB. Cette recombinase à site spécifique joue potentiellement un rôle clé dans le système de recombinaison nécessaire à la viabilité du parasite. Cette protéine de 490 acides aminés, soit ~57 kDa, contient une région C-terminale qui porte les résidus conservés du site catalytique des recombinases à tyrosine R-H-K-R-(H/W)-Y. La prédiction montre une région N-terminale qui ressemble à celle de l’intégrase du phage lambda avec un mélange de structures secondaires α et β.Lors de ces travaux, nous avons d’abord montré par RT-PCR que le gène (MAL13P1.42) qui code pour PF-Int est transcrit pendant le cycle intra-érythrocytaire avec un maximum pendant la phase schizont. Nous avons ensuite essayé de montrer l`implication de Pf-Int dans le cycle parasitaire. Ceci a été réalisé grâce à un parasite (KO: knock-out) dont le gène Pf-Int a été invalidé. Ces analyses montrent que Pf-Int n'a aucun impact apparent sur le cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite, en particulier sur la durée du cycle et le taux de croissance. Au niveau moléculaire, nous avons également procédé à la production d'anticorps anti-Pf-Int en utilisant le fragment C-162 (Résidus 162-490). La comparaison des profils de marquage, par cet anticorps, des extraits protéiques du KO et du parasite sauvage par la technique de Western blot n'a pas permis d'identifier la protéine endogène dans le parasite sauvage. Dans le but de déterminer la localisation sub-cellulaire de Pf-Int, nous avons réalisé des essais de sur-expression de différentes protéines de fusion dans le parasite. Nous avons essayé de déterminer l’impact de trois codons d’initiation différents ainsi que l’impact de la présence de la région N-terminale (1-190aa) de Pf-Int sur sa localisation subcellulaire en utilisant une chimère entre la partie N-terminale et la protéine GFP. Lors de ces travaux, nous avons réussi à sur-exprimer différentes régions de Pf-Int sous forme recombinante dans E. coli. Nous l’avons d’abord caractérisé par des études biophysiques. Ainsi nous avons pu déterminer, par dichroïsme circulaire (CD), le contenu en structures secondaires de Pf-Int, qui est proche de celui des autres membres de la même famille. Nous avons également démontré sa stabilité par CD couplé à la dénaturation thermique. Le spectre RMN-1D a aussi pu être enregistré. La troisième partie de nos travaux a concerné l’identification des cibles ADN de Pf-Int. Deux stratégies de recherche de cibles par affinité ont été utilisées au laboratoire en utilisant une première bibliothèque de séquences synthétisées chimiquement et une deuxième bibliothèque formée de fragments d’ADN génomique de P. falciparum. Ces deux approches ont permis l’identification de deux séries de cibles ADN. Grace aux cibles ADN identifiées, nous avons pu démontrer l’interaction de différents fragments de Pf-Int avec ces cibles par des expériences de retard sur gel natif (EMSA). Nous avons aussi pu démontrer que les protéines recombinantes sont actives in vitro. En effet, ces dernières sont capables de former des complexes covalents en présence de l’ADN cible. La conservation de la protéine, ainsi que son expression différentielle nous laisse à penser que son rôle est certes loin d’être élucidé, mais que Pf-Int reste une cible potentielle pour P. falciparum. / Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for the most severe form of malaria. In recent years, cases of resistance to antimalarial drugs have become increasingly frequent and common. In addition to its resistance to drugs currently available, there is no vaccine available against this parasite till now. The identification of new approaches based on the specific inhibition of some of its molecular targets has become vital.The identification of the Pf-Int site specific recombinase in Plasmodium falciparum by analysis of PlasmoDB is a new opportunity to study the role of genetic variation in this parasite as it needs to adapt to its hosts. This ~ 57 kDa protein contains a C-terminal domain carrying the putative tyrosine recombinase conserved active site residues R-H-K-R-(H/W)-Y, an N-terminus with a predicted alpha-helical bundle and a mixed alpha-beta domain resembling Lambda-Int. Here, we show that the sequence is highly conserved among members of the Plasmodia. It is expressed differentially during distinct life stages as estimated by RT-PCR, namely with a peak in the schizont phase. We then tried to show the involvement of Pf-Int in the parasitic cycle. We were able to create a parasite where the Pf-Int gene was knocked-out. The comparison test showed that Pf-Int has apparently no impact on the intraerythrocytic developmental cycle of the parasite, particularly in the cycle length and the growth rate.At the molecular level, we produced two sets of anti-Pf-Int antibodies using the purified recombinant fragment C-162 (residues 162-490). Comparison of protein extracts from KO and wild parasite by Western blot technique using our antibody has failed to identify the endogenous protein in the wild type parasite.We also tried to determine the subcellular localization of Pf-Int and the role of possible alternate initiation codons by over-expressing different constructs in the parasite Plasmodium falciparum. In order to determine the impact of the N-terminal region (1-190aa) of Pf-Int on its subcellular localization, we also created a chimeric protein using a fusion of Pf-Int(1-190aa) with the GFP. We successfully expressed a variety of the recombinant form of Pf-Int in E. coli. We have first determined its secondary structure content by circular dichroism (CD) and its solution stability by thermal denaturation-CD. An 1-D NMR spectrum was also recorded. The third part of our work has involved the identification of the DNA targets of Pf-Int. Two search strategies conducted in the laboratory using a library of chemically synthesized sequences and a second library made of fragments of genomic DNA of P. falciparum. Both approaches have allowed the identification of two sets of target DNA. Secondly, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were used to show its affinity and specificity for DNA. The recombinant proteins were shown to be functional as they form a covalent complex with DNA. Thus Pf-Int could be a potential agent that binds to and alters DNA, either in a specific or in random fashion. Its conservation and differential expression leads us to conclude that although its role is far from being understood, Pf-Int remains a key target for P. falciparum.

Durant la méiose, il se produit des échanges réciproques entre fragments de chromosomes homologues par recombinaison génétique. Les chromosomes parentaux ainsi modifiés donnent naissance à des gamètes uniques. En redistribuant les mutations génétiques pour générer de nouvelles combinaisons, ce processus est à l’origine de la diversité haplotypique dans la population. Dans cette thèse, je présente des résultats décrivant l’implication de la recombinaison méiotique dans les maladies chez l’humain. Premièrement, l'analyse statistique de données de génotypage de familles québécoises démontre une importante hétérogénéité individuelle et sexe-spécifique des taux de recombinaisons. Pour la première fois chez l’humain, nous avons observé que le taux de recombinaison maternel diminue avec l'âge de la mère, un phénomène potentiellement impliqué dans la régulation du taux d’aneuploïdie associé à l’âge maternel. Ensuite, grâce à l’analyse de données de séquençage d’exomes de patients atteints de leucémie et de ceux de leurs parents, nous avons découvert une localisation anormale des évènements de recombinaison chez les enfants leucémiques. Le gène PRDM9, principal déterminant de la localisation des recombinaisons chez l’humain, présente des formes alléliques rares dans ces familles. Finalement, en utilisant un large spectre de variants génétiques identifiés dans les transcriptomes d’individus Canadiens Français, nous avons étudié et comparé le fardeau génétique présent dans les régions génomiques à haut et à faible taux de recombinaison. Le fardeau génétique est substantiellement plus élevé dans les régions à faible taux de recombinaison et nous démontrons qu’au niveau individuel, ce fardeau varie selon la population humaine. Grâce à l’utilisation de données génomiques de pointe pour étudier la recombinaison dans des cohortes populationnelles et médicales, ce travail démontre de quelle façon la recombinaison peut affecter la santé des individus. / The intergenerational mixing of DNA through meiotic recombination of homologous chromosomes is, along with mutation, a major mechanism generating diversity and driving the evolution of genomes. In this thesis, I use bioinformatics and statistical approaches to analyse modern genomic data in order to study the implication of meiotic recombination in human disease. First, using high-density genotyping data from French-Canadian families, we studied sex- and age-specific effects on recombination patterns. These analyses lead to the first observation of a significant decrease in recombination rates with advancing maternal age in humans, with potential implications for understanding trisomic conceptions. Second, using next-generation sequencing of exomes from families of children with leukemia, we discovered unusual distributions of recombination breakpoints in some leukemia patients, which implicates PRDM9, a protein involved in defining the location of recombination breakpoints, in leukemogenesis. Third, using single nucleotide polymorphisms (SNPs) called from RNA sequencing data, we present a detailed comparison of the mutational burden between high and low recombining regions in the human genome. We further show that the mutational load in regions of low recombination at the individual level varies among human populations. In analysing genomic data to study recombination in population and disease cohorts, this work improves our understanding of how recombination impacts human health. Furthermore, these results provide insights on how variation in recombination modulates the expression of phenotypes in humans.

Plasmodium falciparum est un parasite protozoaire responsable de la forme la plus sévère de la malaria. Depuis quelques années, les cas de résistance aux antipaludiques sont devenus de plus en plus fréquents et de plus en plus répandus. En plus de sa résistance aux drogues actuellement disponibles, ce parasite reste jusqu' à aujourd'hui réfractaire aux vaccinations. L'identification de nouvelles approches basées sur l'inhibition spécifique de certaines de ses cibles moléculaires vitales est devenue une nécessité. La recombinase à site spécifique de P. falciparum (Pf-Int) est un enzyme qui a été récemment identifié dans le laboratoire à partir de PlasmoDB. Cette recombinase à site spécifique joue potentiellement un rôle clé dans le système de recombinaison nécessaire à la viabilité du parasite. Cette protéine de 490 acides aminés, soit ~57 kDa, contient une région C-terminale qui porte les résidus conservés du site catalytique des recombinases à tyrosine R-H-K-R-(H/W)-Y. La prédiction montre une région N-terminale qui ressemble à celle de l'intégrase du phage lambda avec un mélange de structures secondaires α et β.Lors de ces travaux, nous avons d'abord montré par RT-PCR que le gène (MAL13P1.42) qui code pour PF-Int est transcrit pendant le cycle intra-érythrocytaire avec un maximum pendant la phase schizont. Nous avons ensuite essayé de montrer l'implication de Pf-Int dans le cycle parasitaire. Ceci a été réalisé grâce à un parasite (KO: knock-out) dont le gène Pf-Int a été invalidé. Ces analyses montrent que Pf-Int n'a aucun impact apparent sur le cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite, en particulier sur la durée du cycle et le taux de croissance. Au niveau moléculaire, nous avons également procédé à la production d'anticorps anti-Pf-Int en utilisant le fragment C-162 (Résidus 162-490). La comparaison des profils de marquage, par cet anticorps, des extraits protéiques du KO et du parasite sauvage par la technique de Western blot n'a pas permis d'identifier la protéine endogène dans le parasite sauvage. Dans le but de déterminer la localisation sub-cellulaire de Pf-Int, nous avons réalisé des essais de sur-expression de différentes protéines de fusion dans le parasite. Nous avons essayé de déterminer l'impact de trois codons d'initiation différents ainsi que l'impact de la présence de la région N-terminale (1-190aa) de Pf-Int sur sa localisation subcellulaire en utilisant une chimère entre la partie N-terminale et la protéine GFP. Lors de ces travaux, nous avons réussi à sur-exprimer différentes régions de Pf-Int sous forme recombinante dans E. coli. Nous l'avons d'abord caractérisé par des études biophysiques. Ainsi nous avons pu déterminer, par dichroïsme circulaire (CD), le contenu en structures secondaires de Pf-Int, qui est proche de celui des autres membres de la même famille. Nous avons également démontré sa stabilité par CD couplé à la dénaturation thermique. Le spectre RMN-1D a aussi pu être enregistré. La troisième partie de nos travaux a concerné l'identification des cibles ADN de Pf-Int. Deux stratégies de recherche de cibles par affinité ont été utilisées au laboratoire en utilisant une première bibliothèque de séquences synthétisées chimiquement et une deuxième bibliothèque formée de fragments d'ADN génomique de P. falciparum. Ces deux approches ont permis l'identification de deux séries de cibles ADN. Grace aux cibles ADN identifiées, nous avons pu démontrer l'interaction de différents fragments de Pf-Int avec ces cibles par des expériences de retard sur gel natif (EMSA). Nous avons aussi pu démontrer que les protéines recombinantes sont actives in vitro. En effet, ces dernières sont capables de former des complexes covalents en présence de l'ADN cible. La conservation de la protéine, ainsi que son expression différentielle nous laisse à penser que son rôle est certes loin d'être élucidé, mais que Pf-Int reste une cible potentielle pour P. falciparum.

La recombinaison génétique est un processus biologique fondamental, ayant lieu au cours de la méiose et assurant la bonne ségrégation des chromosomes, ainsi que le maintien de la variabilité génétique grâce au brassage intrachromosomique. La recombinaison a été étudiée dans de nombreuses espèces, en particulier chez les Mammifères et les animaux d’élevage, comme les bovins, les porcs ou les ovins. Dans tous les cas, une variation du taux de recombinaison a été observée entre les individus et il a été démontré qu’elle était héritable et sous déterminisme génétique. Dans certaines espèces, des cartes génétiques ont également été construites, ce qui a permis de localiser les crossingovers et de détecter de très petites zones du génome où la recombinaison était importante : les points chauds. En race ovine Lacaune, de nombreuses données de génotypages sont disponibles, notamment grâce à l’existence de deux puces : une de moyenne densité avec 54 000 marqueurs et une de haute densité avec 600 000 marqueurs. Deux jeux de données étaient donc disponibles ; un jeu de données familial avec près de 6 000 individus apparentés et génotypés pour les 54 000 marqueurs et un jeu de données comportant 70 Lacaune non apparentés et génotypés pour les 600 000 marqueurs. Des cartes génétiques ont donc été créées pour ces deux jeux de données. Avec les animaux non apparentés, environ 50 000 points chauds ont été détectés. Le jeu de données familial a permis d’observer des motifs de distribution de la recombinaison communs aux autres Mammifères. Enfin, la combinaison des deux jeux de données a révélé la présence de signatures de sélection et a permis de créer une carte génétique de haute densité. De plus, une variation du taux de recombinaison a été observée entre les individus et a pu être liée à l’existence de 2 QTLs majeurs sur les chromosomes 6 et 7. Des gènes candidats plus ou moins bien connus ont pu être proposés, voire étudiés : RNF212 et HEI10. De plus, une comparaison avec une autre population ovine a permis de montrer que les cartes de recombinaison étaient quasiment identiques, mais que le taux de recombinaison individuel était soumis à un déterminisme génétique différent. Il a également été possible de proposer une application concrète pour l’utilisation des cartes génétiques en sélection génomique, grâce à la création de puces basse densité pouvant être utilisées pour l’imputation des reproducteurs et donc favoriser le génotypage et la sélection génomique à moindre coût. / Genetic recombination is a fundamental biological process, which occurs during the meiosis. It allows the good segregation of the chromosomes and contributes to maintain the genetic diversity. Recombination was already studied in a lot of different species, especially in mammals and in farm animals, such as the pig, the cattle or the sheep. In each case, a variation of the recombination rate between the individuals was observed. This variation was heritable and under genetic determinism. In some species, genetic recombination maps were also created, which allowed to localize the crossovers and to detect really tiny genomic regions where the recombination is huge: the recombination hotspots. In the Lacaune breed sheep, a lot of genotyping data are available thanks to two existing arrays: a first with a medium density of markers (about 54,000 markers) and a second with a high density of markers (about 600,000 markers). Two datasets were thus available: a familial dataset with about 6,000 animals genotyped for the 54,000 markers and a dataset of 70 unrelated Lacaune genotyped for the 600,000 markers. Genetic recombination maps were created for these two datasets. With the 70 unrelated Lacaune, about 50,000 hotspots were detected. The familial dataset allowed to observe the mammals common recombination patterns. Finally, when the two datasets were combined, selection signatures were revealed and a high density recombination map were created. Furthermore, a variation of the recombination rate within the individuals was observed and was associated to 2 main QTLs on the chromosomes 6 and 7. Already known, or not, candidate genes were proposed and sometimes studied: especially RNF212 and HEI10. Finally, a comparison with another sheep breed revealed that the genetic recombination maps were really similar, but the individual recombination rate was under a different genetic determinism. A concrete application of the genetic recombination map in genomic selection was also proposed thanks to the creation of lowdensity SNPs sets, which could be used to impute the animals and thus to improve the genotyping and the genomic selection for lessercosts.