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Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1997. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves : 144-159). Also available on the Internet.

La mucoviscidose est la maladie génétique létale la plus fréquente dans les populations d’origine Caucasiennes et résulte de mutations du gène CFTR. Bien que de nombreux travaux aient permis de comprendre le mode de synthèse et de maturation de la protéine ainsi que la fonction du canal CFTR, les mécanismes qui contrôlent l’expression de ce gène restent peu connus. En effet, le gène CFTR est finement régulé au niveau tissulaire et au cours du développement pulmonaire. Le contrôle de cette expression nécessite le recrutement d’éléments régulateurs qui modulent à la fois l’activité de son promoteur et la stabilité de son transcrit en contexte physiologique et lors de stress cellulaires induits par la pathologie. Le premier travail a été d’identifier en contexte physiologique des régulateurs, incluant des facteurs de transcription et des miARNs, qui participent à la répression de l’expression du gène CFTR dans des cultures pulmonaires fœtales et matures. La détermination d’éléments cis répresseurs a permis le développement d’outils capables de stabiliser les transcrits CFTR. Grâce à l’utilisation d’oligonucléotides modifiés bloquant la fixation des miARNs sur le transcrit CFTR, nous avons montré dans un modèle ex vivo issu de patients CF, une augmentation du taux d’ARNm et de la quantité de protéines CFTR (p.Phe508del) ainsi qu’une restauration de l’activité du canal muté. Le second travail fait suite à l’exploration du locus CFTR, par des séquenceurs de deuxième génération, des régions non codantes incluant les introns, séquences encore peu étudiées à ce jour. Sur une cohorte de patients CF chez qui une seule mutation avait été identifiée, nous avons détecté de nouvelles mutations affectant l’épissage à travers l’insertion d’un exon cryptique. L’utilisation d’oligonucléotides modifiés, spécifiquement localisés sur les introns ciblés, a permis de restaurer la séquence normale des transcrits. Enfin, dans le but d’identifier de nouveaux miARNs qui participent à la physiopathologie CF, le profil d’expression des miARNs a été évalué à partir de différents épithéliums respiratoires (polypes, nez, bronches) issus d’individus sains où atteints de mucoviscidose. La caractérisation d’éléments cis- et trans-régulateurs est essentielle pour poursuivre la compréhension des mécanismes impliqués dans l’expression du gène CFTR ainsi que pour déterminer de nouvelles cibles pour combattre la mucoviscidose. / Cystic Fibrosis is the most frequent lethal genetic disease in the Caucasian populations and results from CFTR gene mutations. Many studies improved the understanding of CFTR biogenesis and CFTR channel function, however the mechanisms driving the expression of this gene remains neglicted. CFTR gene displays a tightly regulated tissue-specific and temporal expression in the lungs. This regulation requires the recruitment of regulatory elements which modulate, the activity of CFTR gene transcription and the stability of its transcript, in both physiological and cellular stress conditions.Firstly, we identify regulators, including transcription factors and miRNAs, which contribute to the CFTR gene repression in pulmonary mature cells compared to fœtal cultures. Determination of cis-repressors elements led to the development of oligonucleotides that block specifically the binding of miRNAs on the CFTR transcrits and that stabilize it. Administration of these modified oligonucleotides, in a ex-vivo model taken from CF patients, increased CFTR mRNA level, p.Phe508del proteins amount, as well as restored CFTR channel activity.Secondly, by using a next generation sequencing approach, we explored the entire CFTR locus, including introns poorly studied. In CF patients in whom only one mutation had hitherto been identified, we found the second disease-causing CFTR mutation that results in aberrantly spliced transcripts due to the inclusion of a pseudoexon in the mature transcripts. We next tested the effect of pseudoexon skipping mediated by antisense oligonucleotides targeting splice sites on two of them. Our findings result in the restoration of the full-length, in-frame CFTR transcript, demonstrating the effect of antisense oligonucleotide-induced pseudoexon skipping in CF. Finally, in order to identify new miRNAs deregulated in CF and to determine their involvement in CF physiopathology, miRNA expression profiling was carried out in three airway epitheliums (polyps, nose, bronchi) taken from healthy individuals and CF patients.Characterization of cis- and trans-regulatory elements offers new understanding of the control of the CFTR gene regulation and new therapeutic targets for Cystic Fibrosis.

Inactivation of tumor supressor gene BRCA1 causes a life-long risk of breast carcinoma development. Genetic screenings of indicated individuals from high-risk families help to identify large number of sequence variants in known predisposing genes. Majority of discovered variants doesn't have clinical significance yet which causes a big problem for diagnostics. Some of these variants are found within regulatory non-coding regions of gene. A part of the clinical classification of variants is their functional characterization. The goal of this thesis was to create a model system for functional characterization of variants in non-coding regions and to verify its function. Model system was based on targeted gene manipulation by co-transfecting CRISPR-Cas9 construct and donor construct that contained a portion of BRCA1 gene sequence with analyzed modifications, into U2 OS cells. The cells have stably integrated DR-GFP system which allows the activity of homologous recombination (HR) to be determined. Monoallelic modifications were induced into U2 OS cells. These modifications were in a Kozak sequence region of BRCA1 gene. Expression level of BRCA1 mRNA was determined by qRT-PCR, which showed the same levels of mRNA in all cells with analyzed alterations. Next, expression level of BRCA1 protein was...

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request