L'anévrysme de l'aorte abdominale (AAA) est un problème de Santé Publique qui touche principalement les hommes de plus de 65 ans. L'AAA souvent asymptomatique évolue vers la rupture associée à un taux de mortalité élevé. Parmi les acides ribonucléiques (ARNs) non codants, les microARNs (miARNs), stables dans le tissu et les biofluides, sont des candidats intéressant dans la recherche de biomarqueurs. L'inflammation, la dégradation de la matrice extra-cellulaire (MEC) et la raréfaction de la média participent à l'AAA. De nombreuses cellules inflammatoires sont impliquées dans l'AAA. La raréfaction des cellules musculaires lisses (CML) est secondaire à l'anoïkis, apoptose par détachement cellulaire de la MEC. Une analyse protéomique différentielle de CML en culture, issues de patients porteurs d'AAA, réalisée au laboratoire a montré que la désintégrine et metalloprotéinase avec un motif de thrombospondine 5 (ADAMTS 5) est surexprimée dans les CML de patients présentant un AAA. L'isolement des cellules par la microdissection laser permet de conserver le phénotype des cellules isolées et de mettre en évidence des marqueurs potentiels de l'AAA masqués par l'analyse du tissu global. Mon travail de thèse a consisté à partir des cellules isolées de la paroi anévrysmale de l'aorte abdominale sous-rénale chez l'Homme: à effectuer une analyse globale des miARNS et une analyse ciblée de l'ADAMTS 5, métalloprotéase qui a une action enzymatique sur les protéines de la MEC. Les objectifs de ce travail sont une meilleure compréhension de l'AAA et l'identification de nouveaux biomarqueurs.La distribution des cellules dans la paroi anévrysmale est étudiée par immunohistochimie sur des biopsies anévrysmales et d'aortes saine obtenues chez l'Homme. Les cellules localisées sont isolées par microdissection laser. L'analyse par criblage de l'expression des miARNs des cellules isolées de l'AAA et des CML issues d'aorte saine est réalisée sur puce. L'expression différentielle de miARNs sélectionnés est analysée par PCR quantitative dans des cellules isolées de l'AAA et dans du tissu global. L'expression des miARNs sélectionnés est ensuite comparée dans le plasma des patients présentant un AAA et de patients athérosclérotiques sans AAA par PCR pour identifier de potentiels biomarqueurs. Dans l'AAA, les macrophages M1 proinflammatoires sont retrouvés dans l'adventice et les macrophages M2 anti inflammatoires dans le thrombus intraluminal, les lymphocytes de type B sont retrouvés organisé en organe lymphoïde tertiaire adventitielle ou ATLOs dans 11 échantillons sur 20 analysés. Les CML sont rares et strictement localises au niveau de la média. Sur 850 miARNs testés dans la puce, 205 miARNs sont exprimés dans les cellules isolées. Les miR-29b et let-7f sont augmentés dans le plasma de patients porteurs d'AAA et représentent de potentiel biomarqueurs.L'expression d'ADAMTS 5 dans les CML de la paroi anévrysmale est évaluée par immunohistochimie dans la paroi aortique saine et anévrysmale et quantifiée par Western-blot dans les CML isolées de la paroi aortique saine et anévrysmale.Deux morphotypes de CML anévrysmales ont été identifiés: un morphotype arrondi positif au marqueur de l'apoptose, caspase 3 et un morphotype allongé, similaire aux CML de l'aorte saine. Le profil d'expression des sous-unités d'ADAMTS 5 est diffèrent dans les CML arrondies et les CML allongées anévrysmales et saines. La mise en apoptose des CML a été mise au point in vitro pour étudier les mécanismes impliqués dans les modifications d’ expression d'ADAMTS 5 dans l'AAA et les conséquences sur son action enzymatique.L'approche systématique de l'expression transcriptomique des cellules anévrysmales isolées a identifié des marqueurs potentiels de l'AAA, les miR-29b et let-7f et l'analyse ciblée suggère l'implication d'ADAMTS 5 dans le profil évolutif des CML vers l'anoïkis dans l'AAA. Des études complémentaires permettront une meilleure compréhension de l'AAA. / Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a public health problem, which mainly affects men older than 65 year. AAA are usually asymptomatic with a natural evolution towards rupture associated with a high mortality rate. Among non coding ribonucleic acids (RNAs), microRNAs are stable in tissue and biofluids and are interesting candidates for the search of biomarkers. Inflammation, extracellular matrix (ECM) degradation and media rarefaction are involved in AAA. Many inflammatory cells are involved in AAA. Anoikis is an apoptosis secondary to a cell detachment from ECM and is responsible for rarefaction of smooth muscle cells (SMC). Differential proteomic analysis of cultured SMC from AAA patients was performed in the laboratory and highlighted the overexpression of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif of type 5 (ADAMTS 5) in SMC of AAA patients. Isolation of cells with laser microdissection allows to keep their phenotype and to find potential markers that may be masked by global tissue analysis.The aim of my PhD work was to perform a global miRNA screening of cells isolated from human aneurysmal wall and an analysis targeted on ADAMTS 5, a metalloprotease with an enzymatic activity on ECM proteins. The main objectives were a better understanding of AAA and the identification of new biomarkers.The distribution of cells in the aneurysmal wall was studied by immunohistochemistry in human aneurysmal and healthy aortic samples. Once located, the cells were isolated by laser microdissection and screened for miRNAs by microarrays. Differential expression of selected miRNAs was quantified by PCR in the cells isolated by laser microdissection and in whole aortas. They were then compared in plasma of AAA patients and atherosclerotic patients without AAA by quantitative PCR to identify potential biomarkers.In AAA, the M1 proinflammatory macrophages were located in the adventitia and the M2 antiinflammatory macrophages in the intraluminal thrombus; the type B lymphocytes were organized in tertiary lymphoid organs (ATLOs) in 11/20 of analysed samples. SMC were rare and restricted to the media. Among the 850 miRNAs tested on microarray, 205 miRNAs were detected in isolated cells. MiR-29b and let-7f were upregulated in plasma of AAA patients, and thus are potential biomarkers.The expression of ADAMTS 5 in aneurysmal SMC was evaluated by immunohistochemistry of healthy and aneurysmal aortic wall and quantified by Western blot in isolated SMC from healthy and aneurysmal wall.Two aneurysmal SMC morphotypes were identified: a rounded morphotype positive for caspase 3, an apoptotic marker, and a spindle-shaped morphotype similar to the healthy aortic SMC. The expression profile of ADAMTS 5 subunits was different in rounded SMC compared to aneurysmal and healthy spindle-shaped SMC. In vitro induction of apoptosis of SMC was established in order to study the mechanisms involved in ADAMTS 5 expression in AAA and their consequences on enzymatic actions.The global transcriptomic screening of aneurysmal cells isolated by laser microdissection has identified potential markers of AAA, miR-29b and let-7f. The targeted analysis suggested that ADAMTS 5 is involved in the evolution profile of SMC towards anoikis in AAA. Further investigations will allow a better understanding of AAA pathophysiology.

Le diabète de type 2 résulte d’un déséquilibre entre les capacités de sécrétion de l’insuline par les cellules bêta-pancréatiques et son action au niveau de ses tissus cibles. Dans le prédiabète, l’hypersécrétion d’insuline compense l’insulino-résistance et cet état est généralement associé à l’obésité et à l’accumulation de tissu adipeux.L’objectif de ma thèse a été d’étudier la biocommunication entre le tissu adipeux viscéral et la cellule bêta-pancréatique lors du prédiabète et du diabète de type 2, en me focalisant sur deux médiateurs originaux, les isoprostanes et les miARNs. Nous avons observé une diminution de la sécrétion d’isoprostanes par le tissu adipeux péripancréatique au cours de l’obésité chez le rat Zucker fa/fa. Spécifiquement observé dans ce tissu adipeux ectopique, ce résultat s’explique par une induction des principales enzymes antioxydantes et une réduction de l’expression de la sPLA2 IIA chez les animaux obèses. Remarquablement, une des isoprostanes, la 15-F2t-Isoprostane ainsi que son épimère aux concentrations de 10 nM et 10 μM inhibent la sécrétion d’insuline gluco-stimulée dans les îlots pancréatiques isolés de rat Wistar. Cet effet pourrait s’expliquer par la liaison de cette isoprostane avec le récepteur au thromboxane A2, dont l’expression génétique et protéique a été mise en évidence pour la première fois dans les îlots de Langerhans et les cellules bêta. La réduction de l’inhibition de la sécrétion d’insuline chez le rat Zucker fa/fa, par une biocommunication paracrine, pourrait favoriser les mécanismes de compensation bêta-cellulaire. Par ailleurs, la production de miARNs, contenus dans des vésicules extracellulaires, par le tissu adipeux omental a été analysée chez l’homme par small RNAseq. Chez des patients obèses, la production de miARNs est modifiée lors de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 avec des conséquences possibles sur la fonctionnalité des cellules bêta. Des miARNs différentiellement exprimés lors du diabète de type 2 pourraient ainsi participer à son apparition et représenter de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques. Pour conclure, ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux mécanismes de biocommunication entre le tissu adipeux et les cellules bêta-pancréatiques. / Type 2 diabetes occurs as a result of an unability of pancreatic beta-cells to meet the insulin demand in its target tissues. During prediabetes insulin hypersecretion compensate for insulin resistance and this state is usually associated with obesity and excess body fat.The aim of my thesis was to study the biocommunication between visceral adipose tissue and pancreatic beta-cells during prediabetes and type 2 diabetes, with a focus on two original mediators, isoprostanes and miRNAs. We observed a decrease in isoprostane secretion by peripancreatic adipose tissue during obesity in Zucker fa/fa rats. In this ectopic adipose tissue, this observation may be related to an induction of some antioxidant enzymes and a reduction of the expression of sPLA2 IIA in obese animals. Remarkably, 15-F2t-Isoprostane as well as its epimer used at concentrations of 10 nM and 10 μM inhibited glucose-stimulated insulin secretion in isolated pancreatic islets. This effect could be explained by the binding of isoprostanes to the thromboxane A2 receptor, whose gene and protein expression has been demonstrated for the first time in islets and beta-cells. In Zucker fa/fa rats, less inhibition of insulin secretion through a paracrine biocommunication, could favor beta-cell compensatory mechanisms. Furthermore, the production of miRNAs, contained in extracellular vesicles released by omental adipose tissue, was analyzed in humans by small RNAseq. In obese patients, miRNAs production is altered during insulin resistance and type 2 diabetes with possible consequences for beta-cell function. Differentially expressed miRNAs in type 2 diabetes may participate in its development and represent novel biomarkers and therapeutic targets. In conclusion, this thesis highlighted new biocommunication mechanisms between adipose tissue and beta-pancreatic cells.

La mucoviscidose est la maladie génétique létale la plus fréquente dans les populations d’origine Caucasiennes et résulte de mutations du gène CFTR. Bien que de nombreux travaux aient permis de comprendre le mode de synthèse et de maturation de la protéine ainsi que la fonction du canal CFTR, les mécanismes qui contrôlent l’expression de ce gène restent peu connus. En effet, le gène CFTR est finement régulé au niveau tissulaire et au cours du développement pulmonaire. Le contrôle de cette expression nécessite le recrutement d’éléments régulateurs qui modulent à la fois l’activité de son promoteur et la stabilité de son transcrit en contexte physiologique et lors de stress cellulaires induits par la pathologie. Le premier travail a été d’identifier en contexte physiologique des régulateurs, incluant des facteurs de transcription et des miARNs, qui participent à la répression de l’expression du gène CFTR dans des cultures pulmonaires fœtales et matures. La détermination d’éléments cis répresseurs a permis le développement d’outils capables de stabiliser les transcrits CFTR. Grâce à l’utilisation d’oligonucléotides modifiés bloquant la fixation des miARNs sur le transcrit CFTR, nous avons montré dans un modèle ex vivo issu de patients CF, une augmentation du taux d’ARNm et de la quantité de protéines CFTR (p.Phe508del) ainsi qu’une restauration de l’activité du canal muté. Le second travail fait suite à l’exploration du locus CFTR, par des séquenceurs de deuxième génération, des régions non codantes incluant les introns, séquences encore peu étudiées à ce jour. Sur une cohorte de patients CF chez qui une seule mutation avait été identifiée, nous avons détecté de nouvelles mutations affectant l’épissage à travers l’insertion d’un exon cryptique. L’utilisation d’oligonucléotides modifiés, spécifiquement localisés sur les introns ciblés, a permis de restaurer la séquence normale des transcrits. Enfin, dans le but d’identifier de nouveaux miARNs qui participent à la physiopathologie CF, le profil d’expression des miARNs a été évalué à partir de différents épithéliums respiratoires (polypes, nez, bronches) issus d’individus sains où atteints de mucoviscidose. La caractérisation d’éléments cis- et trans-régulateurs est essentielle pour poursuivre la compréhension des mécanismes impliqués dans l’expression du gène CFTR ainsi que pour déterminer de nouvelles cibles pour combattre la mucoviscidose. / Cystic Fibrosis is the most frequent lethal genetic disease in the Caucasian populations and results from CFTR gene mutations. Many studies improved the understanding of CFTR biogenesis and CFTR channel function, however the mechanisms driving the expression of this gene remains neglicted. CFTR gene displays a tightly regulated tissue-specific and temporal expression in the lungs. This regulation requires the recruitment of regulatory elements which modulate, the activity of CFTR gene transcription and the stability of its transcript, in both physiological and cellular stress conditions.Firstly, we identify regulators, including transcription factors and miRNAs, which contribute to the CFTR gene repression in pulmonary mature cells compared to fœtal cultures. Determination of cis-repressors elements led to the development of oligonucleotides that block specifically the binding of miRNAs on the CFTR transcrits and that stabilize it. Administration of these modified oligonucleotides, in a ex-vivo model taken from CF patients, increased CFTR mRNA level, p.Phe508del proteins amount, as well as restored CFTR channel activity.Secondly, by using a next generation sequencing approach, we explored the entire CFTR locus, including introns poorly studied. In CF patients in whom only one mutation had hitherto been identified, we found the second disease-causing CFTR mutation that results in aberrantly spliced transcripts due to the inclusion of a pseudoexon in the mature transcripts. We next tested the effect of pseudoexon skipping mediated by antisense oligonucleotides targeting splice sites on two of them. Our findings result in the restoration of the full-length, in-frame CFTR transcript, demonstrating the effect of antisense oligonucleotide-induced pseudoexon skipping in CF. Finally, in order to identify new miRNAs deregulated in CF and to determine their involvement in CF physiopathology, miRNA expression profiling was carried out in three airway epitheliums (polyps, nose, bronchi) taken from healthy individuals and CF patients.Characterization of cis- and trans-regulatory elements offers new understanding of the control of the CFTR gene regulation and new therapeutic targets for Cystic Fibrosis.

Dans les cancers du sein triple négatif sporadiques, BRCA1 est fréquemment inactivé au niveau transcriptionnel, et il a été rapporté que cette inactivation peut être réalisée par une méthylation du promoteur. Plus récemment, il a été constaté que BRCA1 peut également être régulée au niveau post-transcriptionnel par les microARNs. L'accumulation de preuves indique que les miARNs ont un rôle causal dans la tumorigenèse. Nos travaux se sont axés sur l'étude de l’expression et des fonctions des microARN in vitro, in silico et ex vivo.Basé sur nos résultats de profilage de l'expression, quatre miARN candidats (miR-10b, miR-26a, miR-146a et miR-153) ont été choisis comme étant potentiellement impliqués dans le développement du cancer du sein triple négatif. Des essais d'expression exogènes ont révélé que miR-10b et miR-26a, mais pas miR-146a, peuvent réguler négativement l'expression du gène BRCA1 dans les cellules cancéreuses triple négatif MDA-MB-231 et luminales MCF7, alors que miR-153 pourrait réguler négativement l'expression du gène BRCA1 uniquement dans les cellules MCF7. L'analyse in silico des données de Cancer Genome Atlas (TCGA) a confirmé que miR-146a est significativement plus exprimé dans les tumeurs du sein triple négatif par rapport à d'autres tumeurs (non triple négatif) mammaires. L’étude ex vivo a montré que le niveau élévé d’expression de miR-146a et de miR-26 est associé à l’absence des métastases ganglionnaires dans le cancer du sein triple négatif. Aussi une corrélation entre l’expression de 4 miARNs est révélée permettant l’identification de différentes voies de signalisations impliquées dans le cancer du sein triple negatif.Nos travaux fournissent des preuves de l'implication des miARNs spécifiques comme des biomarqueurs potentiels dans le développement du cancer de sein triple négatif. / In sporadic triple-negative breast cancers BRCA1 is frequently inactivated at the transcriptional level, and it has been reported that this inactivation may be brought about by promoter methylation. More recently, it was found that BRCA1 may also be regulated at the post-transcriptional level by miRNAs. Accumulating evidence indicates that miRNAs have a causal role in tumorigenesis. Our work focused on the study of microRNAs expression and functions in vitro, in silico and ex vivo.Based on our expression profiling results, four candidate miRNAs (miR-10b, miR-26a, miR-146a and miR-153) were selected as being potentially involved in triple-negative breast cancer development. Exogenous expression assays revealed that miR-10b and miR-26a, but not miR-146a, can down-regulate the expression of BRCA1 in both triple-negative MDA-MB-231 and luminal epithelial MCF7 breast cancer-derived cells, whereas miR-153 could down-regulate BRCA1 expression only in MCF7 cells. In silico analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) data confirmed that miR-146a is significantly higher expressed in triple-negative breast tumors compared to other (non triple-negative) breast tumors. The ex vivo study showed that the high level expression of miR-146a and miR-26 is associated with the absence of lymph node metastasis in triple negative breast cancer. Also a correlation between the expression of the 4 miRNAs was revealed, allowing the identification of different signaling pathways involved in the triple negative breast cancer.Our work provides evidence of the involvement of specific miRNAs as potential biomarkers in breast cancer triple negative development.