Chez les vertébrés, le système excréteur se développe de manière séquentielle sous la forme de trois types de reins différents :le pro-, le méso- et le métanéphros. Le pronéphros des embryons de xénope et de poisson zèbre se développe rapidement et présente une structure simple formée d’un unique néphron, ce qui en fait un excellent modèle d’étude de la néphrogenèse. Au cours du développement, le mésoderme pronéphrique est régionalisé en plusieurs domaines à l’origine des différents composants du néphron partagés par tous les reins des vertébrés :le glomus, les tubules proximaux, le tubule distal et le canal. Cette régionalisation fait appel à des mécanismes moléculaires encore peu connus. Parmi ceux-ci, le facteur de transcription WT1 inhiberait, dans les cellules à l’origine du glomus, l’expression des gènes caractéristiques des tubules proximaux. De plus, la voie de signalisation Notch est requise séquentiellement d’abord pour la formation du glomus et ensuite lors de la différenciation des tubules proximaux. <p>Le gène Evi1 code pour un facteur de transcription à doigts à zinc notamment exprimé dans le métanéphros des vertébrés supérieurs et jouant un rôle majeur mais mal compris dans le développement. Chez l’embryon de xénope, le gène Evi1 est exprimé dès la fin de la neurulation dans la région ventro-postérieure de l’ébauche pronéphrique à l’origine du tubule distal et du canal. Son expression est inhibée par le facteur de transcription xWT1 et l’activation de la voie de signalisation Notch. Via des expériences de surproduction de la protéine Evi1 sauvage ou d’une fusion Evi1-VP16, fonctionnant de manière antagoniste à la protéine sauvage, nous avons montré que la protéine Evi1 joue un rôle important dans la néphrogenèse précoce en inhibant la formation du glomus et des tubules proximaux dans les cellules à l’origine du segment distal du néphron.<p>Afin de déterminer l’importance du facteur de transcription xWT1 dans la régulation de l’expression du gène Evi1 ainsi que dans la formation du glomus, des expériences de sous-expression ont été réalisées. Ces expériences montrent que la sous-expression de xWT1 inhibe la formation du glomus mais n’induit cependant pas d’expansion de l’expression du gène Evi1 ni celle d’autres marqueurs du pronéphros, suggérant l’existence d’au moins un autre facteur répresseur exprimé au niveau de la couche médiane du mésoderme pronéphrique. <p>Ensuite, nous avons comparé les profils de gènes codant notamment pour des protéines spécialisées dans le transport de solutés dans les reins embryonnaires de xénope et de poisson zèbre. Nos résultats montrent que le pronéphros du poisson zèbre, bien que présentant une structure uniforme, peut être subdivisé en quatre différents segments. Ces observations suggèrent que les reins embryonnaires du xénope et du poisson zèbre présentent des organisations similaires. <p>Dans la dernière partie de ce travail, nous avons entamé l’étude du promoteur du gène CLC-K, codant pour un canal chlore exprimé dans du segment distal du néphron, par la réalisation d’embryons transgéniques de xénope. Les résultats préliminaires obtenus indiquent qu’un fragment de 11kb du promoteur du gène CLC-KB humain est suffisant pour diriger une expression correcte du transgène chez le xénope. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La greffe rénale est le meilleur traitement de l’insuffisance rénale terminale. Par contre, la perte prématurée du greffon est un problème majeur chez les greffés qui est due majoritairement au rejet. La classification de Banff reconnait 2 catégories de rejets : une réaction médiée par les anticorps (ABMR) et/ou une réaction cellulaire (TCMR). L’ABMR est caractérisé par le développement de novo d’anticorps contre le donneur (DSA) en circulation et des dommages histologiques, comme la glomérulopathie du transplant. De novo, les DSA anti-HLA-II sont plus fréquemment associés à la glomérulopathie du transplant que les anti-HLA-I et sont associés à un moins bon pronostic clinique. Toutefois, le mécanisme par lequel les anti-HLA-II sont plus dommageables demeure mal connu. Mon hypothèse est que les anticorps anti-HLA sont suffisants pour perturber l’hémostase de l’endothélium glomérulaire. Plus particulièrement, nous croyons que les anticorps anti-HLA-II, diminuent l’expression de la thrombomoduline (TBM), ce qui pourrait mener aux lésions endothéliales glomérulaires associées à la glomérulopathie du transplant. Pour évaluer cette hypothèse, j’ai utilisé un modèle in vitro d’endothélium glomérulaire humain et du sérum de patients transplantés rénaux. Nous avons observé que l’expression membranaire de la TBM augmentait de manière dosedépendante en présence d‘anti-HLA-I, mais pas anti-HLA-II. Toutefois, lors de la mesure intracellulaire nous avons observé une accumulation cytosolique en réponse à une stimulation par les anti-HLA-II. De plus, nous avons observé une association significative entre la présence de DSA circulants anti-HLA-II dans les patients transplantés rénaux et un faible taux de TBM sérique. Ces résultats indiquent que la liaison des anticorps anti-HLA-I et II produit des effets différents sur l’expression endothéliale de la TBM. Les anticorps anti-HLA-II pourraient être associés à un état prothrombotique qui pourrait expliquer l’occurrence plus élevée de lésions microangiopathiques dans l’allogreffe et la moins bonne condition observée chez les patients ayant ces anticorps. / Kidney transplant is the best treatment for end-stage renal disease. However, premature graft loss is an important problem in kidney allograft, mostly caused by rejection. Banff classification recognizes two allograft rejection categories: antibody-mediated rejection (ABMR) and/or cellular rejection (TCMR). ABMR is characterized by: development of circulating de novo antibodies against the donor (DSA) and histological damages like transplant glomerulopathy. De novo, anti-HLA-II antibodies are more frequently associated with transplant glomerulopathy than anti-HLA-I antibodies. However, the mechanistic of how anti-HLA-II antibodies are more damaging is still not fully understood. My hypothesis is that anti-HLA antibodies are sufficient to disrupt surface hemostasis (process which causes bleeding to stop) of glomerular endothelium. More importantly, we think that anti-HLA-II antibodies could decrease expression of thrombomodulin (TBM), which could lead to glomerular endothelial lesions associated with transplant glomerulopathy. To evaluate this hypothesis, I used an in vitro model of human glomerular microvascular endothelium and sera from transplant recipients. We observed that membrane TBM expression is up-regulated in a dose-dependent manner with anti- HLA-I, but not anti-HLA-II. However, when we measured intracellular TBM, we observed a cytosolic accumulation in response to anti-HLA-II stimulation. Furthermore, we observed a significant association between anti-HLA-II DSA in renal transplant recipients and low serum levels of TBM. These results show that anti-HLA I or II antibodies binding produce differential effects on TBM endothelial expression and on TBM serum levels in transplant recipients. Anti-HLA-II antibodies could be associated with prothrombotic state, which could explain the higher occurrence of microangiopathic lesions in the allograft and the poor outcomes observed in patients with these antibodies.

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

Le cancer superficiel de la vessie (CSV) présente un taux élevé de récidive (60%). De ces récidives 10 à 15% progresseront vers un cancer infiltrant beaucoup plus dangereux. La résection transurétrale (RTU) des tumeurs superficielles est souvent suivie d’immunothérapie intravésicale par le BCG (Bacille-Calmette-Guérin) afin de prévenir la récidive et la progression ; cependant ce traitement échoue dans 40% des cas. De plus, la sévérité des effets secondaires empêche plusieurs patients de tolérer un traitement complet. La prédiction de la réponse au BCG et le développement de traitements alternatifs s’avèrent donc nécessaires. Nous avons d’abord évalué la signification clinique de la présence de cellules dendritiques matures infiltrant la tumeur (CDIT) et de macrophages associés aux tumeurs (MAT) dans des CSV à bas risque, traités seulement par RTU. La présence de CDIT a permis d’identifier des patients à risque élevé de progression. Chez des patients à haut risque de récidive et de progression traités au BCG, nous avons observé que ceux qui ont un haut niveau d'infiltration par des CDIT ou des MAT ne répondaient pas efficacement au BCG. Dans un deuxième volet, j’ai exploré la possibilité d’utiliser d’autres agents théarapeutiques pouvant se combiner au BCG ou le remplacer pour stimuler la réponse antitumorale. Pour un tel rôle j’ai choisi les agonistes des Toll-like receptors (TLR). Les TLR, principalement exprimés par les cellules du système immunitaire et quelques cellules épithéliales, jouent un rôle important dans l’immunité innée en reconnaissant des motifs moléculaires conservés de pathogènes. J’ai d’abord montré que les TLR sont exprimés et fonctionnels dans des cellules urothéliales normales et tumorales. Par la suite, j’ai démontré que le poly(I :C), agoniste du TLR3, a un effet cytotoxique et antiprolifératif direct sur des lignées de cancer de vessie. Dans les cellules MGH-U3, il induit également la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et induit fortement l’expression des molécules du CMH de classe I alors que le BCG a très peu d’effet sur l’immunogénicité de ces cellules. Un essai d’inhibition de croissance tumorale utilisant le modèle de cancer de vessie murin MBT-2 a montré que l’utilisation combinée du BCG et du poly(I :C) inhibe très significativement la croissance tumorale alors que chacun des produits utilisés seuls n’avait pas d’effet significatif. Notre étude suggère que le poly(I :C) dû à ses effets anti-néoplasiques pourrait améliorer l’efficacité thérapeutique du BCG dans l’immunothérapie du CSV. / Non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) is characterized by a high rate of recurrence (60%). Ten to fiftheen % of the recurrences will progress toward muscle-invasive tumors, which are more dangerous. Transurethral resection (TUR) of non-muscle invasive tumors is frequently followed by intravesical immunotherapy using BCG (bacillus Calmette-Guérin) to prevent recurrence and progression but this treatment fails in 40% of cases. Moreover, the severity of the side effects prevents many patients to comply with the whole treatment. Tools to predict the response to BCG and the development of alternative treatments are therefore required. We first evaluated the clinical significance of the presence of tumor infiltrating mature dendritic cells (TIDCs) and of tumor-associated macrophages (TAMs) in low-risk NMIBCs treated only by TUR. The presence of TIDCs allowed the identification of patients that were at high risk of progression. In patients with NMIBCs at high risk of recurrence and progression treated with BCG, we observed that those with a high level of MAT or TIDC infiltration did not respond efficiently to BCG. In the second part of my work, I have explored the possibility to use other immunomodulatory agents to replace or complement BCG immunotherapy. I therefore selected toll-like receptors (TLRs) agonists for this purpose. TLRs, which are mainly expressed in immune cells but also epithelial cells, play an important role in the innate immunity by recognizing molecular patterns that are conserved between pathogens. I have first showed that TLRs are expressed and functional in normal and tumor urothelial cells. Then, I showed that poly(I:C), a TLR3 agonsist, has direct cytotoxic and antiproliferative effects on bladder cancer cell lines. In MGH-U3 cells, it induces the secretion of proinflammatory cytokines and expression of major histocompatibility class I molecules whereas BCG has little effect on the immunogenicity of these cells. A growth inhibition assay using the MBT-2 murine bladder cancer model showed that the combination of poly(I:C) and BCG inhibited very significantly the growth of bladder cancer cells whereas each product alone had no significant effect. Our study suggests that poly(I:C), due to its anti-tumoral effects, could improve the therapeutic efficacy of BCG for the immunotherapy of NMIBCs.

UNE EXPOSITION NÉONATALE À L’OXYGÈNE MÈNE À DES MODIFICATIONS DE LA FONCTION MITOCHONDRIALE CHEZ LE RAT ADULTE Introduction: L’exposition à l’oxygène (O2) des ratons nouveau-nés a des conséquences à l’âge adulte dont une hypertension artérielle (HTA), une dysfonction vasculaire, une néphropénie et des indices de stress oxydant. En considérant que les reins sont encore en développement actif lors des premiers jours après la naissance chez les rats, jouent un rôle clé dans le développement de l’hypertension et qu’une dysfonction mitochondriale est associé à une augmentation du stress oxydant, nous postulons que les conditions délétères néonatales peuvent avoir un impact significatif au niveau rénal sur la modulation de l’expression de protéines clés du fonctionnement mitochondrial et une production mitochondriale excessive d’espèces réactives de l’ O2. Méthodes: Des ratons Sprague-Dawley sont exposés à 80% d’O2 (H) ou 21% O2 (Ctrl) du 3e au 10e jr de vie. En considérant que plusieurs organes des rats sont encore en développement actif à la naissance, ces rongeurs sont un modèle reconnu pour étudier les complications d’une hyperoxie néonatale, comme celles liées à une naissance prématurée chez l’homme. À 4 et à 16 semaines, les reins sont prélevés et les mitochondries sont extraites suivant une méthode d’extraction standard, avec un tampon contenant du sucrose 0.32 M et différentes centrifugations. L’expression des protéines mitochondriales a été mesurée par Western blot, tandis que la production d’ H202 et les activités des enzymes clés du cycle de Krebs ont été évaluées par spectrophotométrie. Les résultats sont exprimés par la moyenne ± SD. Résultats: Les rats mâles H de 16 semaines (n=6) présentent une activité de citrate synthase (considéré standard interne de l’expression protéique et de l’abondance mitochondriales) augmentée (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), une diminution de l’activité d’aconitase (enzyme sensible au redox mitochondrial) (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondrie), ainsi qu’une augmentation dans la production de H202 (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg protéines mitochondriales) comparativement au groupe Ctrl (n=6 mâles et 4 femelles). Le groupe H (vs Ctrl) présente également une diminution dans l’expression de peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 unité relative, -23%; p<0.05), une protéine impliquée dans l’élimination d’ H202, de l’expression du cytochrome C oxidase (Complexe IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 unité relative, -15%; p<0.05), une protéine de la chaine de respiration mitochondriale, tandis que l’expression de la protéine de découplage (uncoupling protein)-2 (UCP2), impliquée dans la dispersion du gradient proton, est significativement augmentée (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 unité relative, +17%; p<0.05). Les femelles H (n=6) (vs Ctrl, n=6) de 16 semaines démontrent une augmentation significative de l’activité de l’aconitase (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondrie), de l’expression de l’ATP synthase sous unité β (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 unité relative, +25%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 unité relative, +20%; p<0.05) (superoxide dismutase mitochondriale, important antioxidant), tandis que l’expression de Prx3 est significativement réduite (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 unité relative, -24%; p<0.05). À 4 semaines, les mâles H (vs Ctrl) présentent une augmentation significative de l’expression de Prx3 (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 unité relative, +31%; p<0.05) et les femelles présentent une augmentation significative de l’expression d’UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 unité relative, +18%; p<0.05) et de l’expression de MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 unité relative, +14%; p<0.05). Conclusions: Une exposition néonatale à l’O2 chez le rat adulte mène à des indices de dysfonction mitochondriale dans les reins adultes, associée à une augmentation dans la production d’espèces réactives de l’oxygène, suggérant que ces modifications mitochondriales pourraient jouer un rôle dans l’hypertension artérielle et d’un stress oxydant, et par conséquent, être un facteur possible dans la progression vers des maladies cardiovasculaires. Mots-clés: Mitochondries, Reins, Hypertension, Oxygène, Stress Oxydant, Programmation / EVALUATION OF MITOCHONDRIAL FUNCTION IN A MODEL OF DEVELOPMENTAL PROGRAMMING OF HYPERTENSION ASSOCIATED WITH TRANSIENT NEONATAL OXYGEN EXPOSURE Introduction: Rats exposed to oxygen (O2) as newborns suffer complications in adulthood, including: arterial hypertension, vascular dysfunction, nephropenia and indices of oxidative stress. Although the rats are born at term, their organ development is equivalent to that of a preterm fetus, allowing organs of interest such as the kidney to be compared to premature infants. Given that impaired nephrogenesis or reduced nephron numbers has been shown to promote the development of hypertension and mitochondrial dysfunction is associated with increased oxidative stress, we hypothesised that exposure to high oxygen concentrations in the neonatal period would significantly impact the expression and activity of key proteins involved in renal mitochondrial function and lead to an excessive production of reactive oxygen species by the mitochondria. Methods: Sprague-Dawley rat pups were exposed to 80% O2 (Hyperoxic (H) group; O2 exposed) or 21% O2 (Control (Ctrl) group) from day 3 to day 10 of life. At 4 and 16 weeks of age, kidneys were rapidly excised and the mitochondria isolated following a standard protocol; with a buffer containing 0.32 M sucrose and differential centrifugations. Expression of mitochondrial proteins was assessed by Western blot, whereas the release of hydrogen peroxide (H202), activities of key citric acid cycle enzymes and mitochondrial swelling were assessed by spectrophotometry. Results are expressed as the means ± SE. Both male and female offspring were studied. Results: In male H rats at 16 weeks of age (n=6), citrate synthase activity (internal standard and measure of relative mitochondrial abundance) was significantly increased (12.4 ± 8.4 vs 4.1 ± 0.5 μmole/mL/min), whereas aconitase activity (sensitive to ROS) was significantly decreased (0.11 ± 0.05 vs 0.20 ± 0.04 μmoles/min/mg mitochondria) and H202 release was significantly increased (7.0 ± 1.3 vs 5.4 ± 0.8 ρmoles/mg mitochondrial protein) compared to the controls (Ctrl, n=6 males and 4 females). The H group (vs Ctrl) also demonstrated a reduction in the expression of peroxiredoxin-3 (Prx3) (H 0.61±0.06 vs. Ctrl 0.78±0.02 relative units, -23%; p<0.05), a protein involved in the elimination of H202 and in the expression of cytochrome C oxidase (Complex IV) (H 1.02±0.04 vs. Ctrl 1.20±0.02 relative units, -15%; p<0.05), a protein in the mitochondrial respiratory chain, whereas the expression of uncoupling protein-2 (UCP2), a protein involved in dissipating the proton gradient, was significantly increased (H 1.05±0.02 vs. Ctrl 0.90±0.03 relative units, +17%; p<0.05). Female H rats (n=6) (vs Ctrl, n=6) at 16 weeks of age demonstrated a significant increase in aconitase activity (0.33±0.03 vs 0.17±0.02 μmoles/min/mg mitochondria), in the expression of ATP synthase β subunit (H 0.73±0.02 vs. Ctrl 0.59±0.02 relative units, +25%; p<0.05) (involved in ATP production) and in the expression of MnSOD (H 0.89±0.02 vs. Ctrl 0.74±0.03 relative units, +20%; p<0.05) (mitochondrial antioxidant involved in scavenging superoxide), whereas Prx3 expression was significantly reduced (H 1.1±0.07 vs. Ctrl 0.85±0.01 relative units, -24%; p<0.05 ). In male H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age, the expression of Prx3 was significantly increased (H 0.72±0.03 vs. Ctrl 0.56±0.04 relative units, +31%; p<0.05). Female H rats (vs Ctrl) at 4 weeks of age demonstrated a significant increase in the expression of UCP2 (H 1.22±0.05 vs. Ctrl 1.03±0.04 relative units, +18%; p<0.05) and in the expression of MnSOD (H 1.36±0.01 vs. 1.19±0.06 relative units, +14%; p<0.05). Conclusion: The findings of this study demonstrate that transient oxygen exposure in the neonatal rat modifies protein expression, enzymatic activity and leads to indices of mitochondrial dysfunction (increase in ROS) in the adult kidney; these adverse changes in the mitochondria were more pronounced in adult males than in females. Overall, these findings, suggest that impaired mitochondrial function is associated with and could play a role in the development of arterial hypertension, oxidative stress and cardiovascular disease associated with transient neonatal hyperoxic stress. Keywords: Mitochondria, Hypertension, Kidneys, Developmental Programming, Oxygen, ROS

Résumé confidentiel / Confidential abstract

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La leptospirose, due aux bactéries Leptospira interrogans ou leptospires, est une zoonose ré-émergente de répartition mondiale et susceptible de se répandre en France en raison du réchauffement climatique. Les rongeurs, en particulier les rats, sont le réservoir asymptomatique des leptospires. Chez l’Homme, l’infection conduit soit à un syndrome pseudo-grippal bénin, soit à la maladie de Weil, qui se traduit par des déficiences hépatiques, rénales et pulmonaires sévères pouvant entraîner la mort. Le laboratoire a montré que les leptospires échappent à la détection par certains récepteurs de l’immunité innée de la famille des Toll-like (TLR). En effet, le lipopolysaccharide (LPS) des leptospires – composant majeur de la membrane externe – est atypique et n’est pas reconnu par le TLR4 humain, contrairement au LPS de la plupart des bactéries à Gram négatif. Cependant chez la souris, le LPS des leptospires est reconnu par le TLR4 et permet une élimination de la bactérie. Au cours de cette thèse, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme d’échappement des leptospires à la reconnaissance par les récepteurs de l’immunité innée Nod1 et Nod2, reconnaissant les fragments de dégradation du peptidoglycane bactérien, appelés muropeptides. Nous avons montré que la liaison au PG d’une lipoprotéine, la LipL21, spécifique de la membrane externe des leptospires, bloque la digestion en muropeptides et permet ainsi l’échappement des leptospires à la reconnaissance par les récepteurs Nods. Ceci constitue une nouvelle stratégie bactérienne d’échappement au système immunitaire inné. En effet, jusqu’alors seules des modifications des sucres ou de la chaîne peptidique du peptidoglycane entraînant le blocage de la reconnaissance par les récepteurs Nods avaient été mis en évidence. Par ailleurs, nous avons développé – grâce à la construction d’une souche de leptospires pathogènes bioluminescents – un nouveau modèle d’étude de la leptospirose aiguë et chronique chez la souris, qui à l’instar des rats et contrairement à ce que l’on pensait, est un porteur asymptomatique et chronique des leptospires dans les reins. Ce modèle biphasique de la leptospirose nous a permis de mettre en évidence que les leptospires sont protégés de l’action des antibiotiques lorsqu’ils sont dans les reins, alors qu’ils y sont sensibles lors de la phase aiguë. Ces résultats suggèrent deux mécanismes différents participant à l’échappement des leptospires au système immunitaire de l’hôte : d’une part, la lipoprotéine LipL21 joue un rôle dans le blocage de la reconnaissance du peptidoglycane par les récepteurs Nods et d’autre part, les leptospires échappent aux défenses de l'hôte par la colonisation rénale chez la souris. / Leptospirosis is a widespread zoonosis caused by the bacterium Leptospira interrogans (L interrogans). In humans, infection with L. interrogans can cause either a mild disease or in more severe cases, multi-organ failure potentially leading to death. Leptospires escape from the innate immune response by evading detection by Toll-like receptors (TLR). Indeed, the lipopolysaccharide (LPS) outer membrane component of Leptospira is atypical as, unlike most Gram-negative bacteria, it is not recognized by human TLR4. However, leptospiral LPS is recognized by murine TLR4, facilitating clearance of leptospires in mice. During my doctoral thesis, we revealed a new mechanism of leptospiral escape from recognition by Nod1 and Nod2 innate immune receptors. We have shown that a specific leptospiral outer membrane lipoprotein, LipL21, impairs muropeptides digestion and therefore avoids activation of Nod1 and Nod2 receptor-mediated pathways. This constitutes a new strategy of bacterial escape from Nod1 and Nod2 receptor recognition. Indeed, until now, only modification of the peptidoglycan sugar or peptide side-chain chemistry was shown to participate in evasion of Nod receptor recognition. Furthermore, through the construction of a bioluminescent pathogenic Leptospira strain, we were able to develop a new murine model to study acute and chronic leptospirosis. We found that, after the acute phase of leptospirosis, infected mice become asymptomatic, but exhibit chronic carriage of Leptospira in the kidneys, as in rat models of leptospirosis. This biphasic leptospirosis model allows us to highlight leptospiral renal colonization as a stealth escape strategy from the blood defenses and antibiotics. Our results reveal two new mechanisms that contribute to leptospiral escape from the host immune system: on one hand, LipL21 lipoprotein plays a role by facilitating evasion of peptidoglycan recognition through Nod1 and Nod2 receptors, and on the other hand, leptospires escape from host defenses by colonising a renal niche in mice. Together, these findings provide novel insight into the ability of Leptospira to cause serious and chronic morbidity in humans.

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished