As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

As doenças cardiovasculares representam a maior causa de mortalidade a nível mundial. Desde o conhecimento da importância da mitocôndria no metabolismo do cardiomiócito, alterações no funcionamento desta organela têm sido associadas a um dos principais causadores do infarto do miocárdio e consequente morte celular. O cofator de transcrição PGC-1alfa tem sido alvo de diversos estudos relacionados com o metabolismo celular devido à sua forte participação na biogênese mitocondrial. Considerando a limitação de material biológico para o estudo de doenças cardíacas, muito se tem investido no estudo de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Esta tese teve como principal objetivo a avaliação dos efeitos da variação da expressão de PGC-1alfa em iPSCs e na sua diferenciação em cardiomiócitos. Após estabelecimento de um protocolo de reprogramação celular, em que ocorre geração de iPSCs a partir de fibroblastos humanos, induzimos a inibição da expressão de PGC-1alfa em 50% e 70% pelo uso de vetores lentivirais, e analisamos o estado de pluripotência através da avaliação de expressão genica e proteica dos principais marcadores - SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA-1-81. Não observamos diferenças significativas no conteúdo destes marcadores entre os clones de iPSC controle e inibidos. Estabelecemos um protocolo de diferenciação de iPSCs em cardiomiócitos com elevada taxa de reprodutibilidade, através da adaptação de protocolos descritos na literatura, e submetemos estas iPSCs à diferenciação. As células geradas pela diferenciação do clone controle apresentaram características típicas de cardiomiócito: contratilidade e alta expressão molecular de troponina T e troponina I. Em contraste, as células com 70% de inibição de PGC-1alfa se mostraram incapazes de contrair e com baixa expressão de troponina. Através de uma análise dos níveis de expressão genica e proteica de diversos marcadores expressos durante o processo de diferenciação (T, NKX2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), observamos que o clone com maior inibição de PGC-1alfa apresentou sempre níveis de expressão diminuídos em relação aos clones controle. Em conclusão, podemos afirmar que o PGC-1alfa não interfere com as características de auto-renovação e pluripotência das iPSCs mas possui um papel essencial na diferenciação de células-tronco pluriotentes induzidas em cardiomiócitos. Os resultados obtidos contribuem para informações preliminares acerca do desenvolvimento de iPSCs com inibição da expressão de PGC-1alfa durante a diferenciação cardíaca, mas estudos relativos ao potencial papel deste cofator durante o desenvolvimento cardíaco in vivo ainda precisam ser aprofundados, utilizando outros modelos de estudo / Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality worldwide. Since the knowledge of the importance of mitochondria in the cardiomyocyte metabolism, changes in the functioning of this organelle has been associated with one of the main causes of myocardial infarction and subsequent cell death. The transcriptional cofactor PGC-1alpha has been subjected to several studies related to cell metabolism due to its strong involvement in mitochondrial biogenesis. Considering the limitations of biological material in the study of heart disease, there has been a lot of investment in the study of induced pluripotent stem cells (iPSCs). The main objective of this thesis was to evaluate the effects of the variation in expression of PGC-1alpha in iPSCs and it\'s differentiation in cardiomyocytes. After the estabilshment of a cellular reprogramming protocol, where iPSCs is generated from human fibroblasts, the expression of PGC-1alpha was induced by 50% and 70% with the use of lentiviral vectors and the state of pluripotency was determined by analyzing the gene and protein expression of the main markers - SSEA4, TRA- 1-60, OCT4, NANOG, SOX2, REX1, TRA- 1- 81. There were no significant differences observed in the content of these markers between the iPSC clones control and inhibited. A protocol for the differentiation of iPSCs into cardyomyocites was established with a high reproducibility rate, by adapting existing protocols in the general literature, submiting these iPSCs into diferentiation. The cells generated from the differentiation of the control clone showed typical characteristis of cardiomyocytes: contractility and high molecular expression of troponin T and troponin I. In contrast, the cells with 70% inhibition PGC-1alpha were unable to contract and had low troponin expression. Through an analysis of gene expression and protein levels of several markers expressed during the differentiation process (T, Nkx2.5, MIXL1, MYL7, ISL1), the clone with greater inhibition of PGC-1alpha always showed decreased expression levels compared to control clones. In conclusion, we can say that the PGC-1alpha does not interfere with the characteristics of self-renewal and pluripotency of iPSCs but has an essential role in the differentiation of pluripotent stem cells induced into cardiomyocytes. These results were obtained thanks an original approche based on iPSC technology enabling genetic modifications of the cells and controled differentiation into cardiomyocytes, but the potential role of PGC-1alpha on in vivo cardiac development or cardiomyocytes maturation remaisn to be evaluated using other models

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) tem origem genética e é caracterizada pela substituição de células miocárdicas por tecido fibroadiposo. A doença tem uma prevalência aproximada de 1:3500, sendo mais frequentemente diagnosticada em indivíduos jovens, atletas e do sexo masculino. Atualmente, várias alterações genéticas associadas a CAVD foram descritas em 12 genes diferentes. No entanto, existem poucos estudos na literatura que descrevem o espectro mutacional da doença usando um painel abrangente de genes potencialmente causais, em populações diferentes das coortes descendentes de europeus. O sequenciamento de nova geração (NGS) como ferramenta para o diagnóstico molecular da doença, permite um avanço na correlação entre alterações genotípicas e fenotípicas e tem aportado potenciais benefícios que crescem juntamente com os desafios na sua interpretação. Além disso, o uso de hiPSCs como modelo in vitro de determinadas doenças cardíacas, permite avaliar especificamente a relação do genótipo com as diferentes consequências fenotípicas celulares da CAVD. Entretanto, os mecanismos moleculares da doença ainda são pouco esclarecidos e não há na literatura estudos que englobem ao mesmo tempo o perfil mutacional (com um painel extenso de genes) e estudo funcional das alterações encontradas com o uso de hiPSC-CMs. Esta tese teve como objetivo descrever a prevalência de variantes causais em genes associados à CAVD na população brasileira, e caracterizar, do ponto de vista funcional, os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) de pacientes com mutações identificadas, a fim de associar o perfil mutacional e a expressão fenotípica celular. Quarenta e sete indivíduos, não aparentados, sendo 38 (80,85%) pacientes do sexo masculino, idade média 40,2 ± 15,56 anos, com diagnóstico clínico de CAVD, foram submetidos ao sequenciamento de um painel genético relacionado à cardiomiopatias hereditárias, compreendendo os 12 genes previamente descritos como causadores de CAVD, utilizando sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes foram interpretadas e classificadas de acordo com os critérios da ACMG. Variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas foram encontradas em dezoito probandos (38,3%), com maior número de ocorrências no gene PKP2 (38,8%). Entre os 18 casos positivos, treze variantes diferentes foram encontradas, quatro delas novas variantes em genes desmossomais, sem descrição prévia na literatura. Variantes de significado incerto (VSI) foram encontradas em 16 pacientes. A presença de uma variante causal ocorreu em todos os probandos assintomáticos e foi significativamente associada a probandos com histórico familiar de morte súbita cardíaca abaixo de 35 anos. Para a modelagem celular da CAVD, foram geradas hiPSCs de dois pacientes a partir de células progenitoras de urina (UPCs) e fibroblastos, por transfecção episomal. O primeiro paciente possuía alteração missense no gene PKP2 e o segundo, uma inserção no gene DSC2. As hiPSCs foram caracterizadas quanto ao seu potencial de pluripotência e posteriormente diferenciadas em cardiomiócitos (hiPSC-CMs). Nossos resultados demonstraram diferenças fenotípicas significativas entre os CAVD-CMs comparados com os controle-CMs, como: reduções significativas de expressão das proteínas desmossomais e desmossomos estruturalmente alterados; presença de marcadores do acúmulo de gotículas lipídicas e regulação aumentada do fator de transcrição proadipogênico PPAR-gama; aumento de duração do potencial de campo (FPD) e do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90); velocidade de condução mais lenta e uma força de contração menor. Em conclusão, este é o primeiro trabalho a caracterizar o perfil genético da CAVD, abrangendo todos os genes descritos até o momento relacionados à doença, na população brasileira. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que, pacientes com história familiar de MSC ( < 35 anos) têm maior probabilidade de portar uma variante causal. Além disso, nossos achados sugerem que pacientes com alteração causal no gene PKP2 têm uma maior gravidade da apresentação fenotípica de arritmia. Nosso modelo celular, que contemplou células paciente-específicas com diferentes alterações das estudadas até o presente momento,sugere ser possível o estudo do efeito das alterações genéticas na CAVD e pode ser um acréscimo às ferramentas disponíveis para estudar o mecanismo desta doença complexa / Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) has a genetic origin and is mainly characterized by the replacement of myocardial cells with fibroadipose tissue. The disease has a prevalence of approximately 1: 3.500, being more frequently diagnosed in young individuals, athletes and males. Currently, several mutations associated with ARVC have been described in 12 different genes. However, there are few studies in the literature that describe the mutational spectrum of the disease using a comprehensive panel of potentially causal genes in populations other than European-descent cohorts. Next Generation Sequencing (NGS) as a tool for molecular diagnosis of the disease allows an advance in the correlation between genotypic and clinical phenotypic aspects and has potential benefits that grow along with the challenges in its interpretation. In addition, the use of hiPSCs as an in vitro model of certain heart diseases, allows to specifically evaluate the relationship of the genotype with the different cellular phenotypic consequences of ARVC. However, the molecular mechanisms of the disease are still poorly understood and there are no studies in the literature that include both the mutational profile (with an extensive panel of genes) and functional study of different causal variants, with the use of hiPSC-CMs. The aim of this thesis was to describe the prevalence of causal variants in ARVC-associated genes in the Brazilian population, and to characterize, from a functional point of view, cardiomyocytes derived from hiPSC (hiPSC-CMs) from patients with identified mutations, in order to associate the mutational profile and cellular phenotypic expression. Forty-seven unrelated probands, 38 (80.85%) male, mean age 40.2 ± 15.56 years, with clinical diagnosis of ARVC, were submitted to a cardiomyopathy-related gene panel sequencing, comprising 12 genes, using next-generation sequencing (NGS). Variants were interpreted and classified according to the ACMG criteria. Pathogenic or Likely Pathogenic variants were found in eighteen probands (38.3%), with the largest number of occurrences in the PKP2 gene (38.8%). Among the 18 positive cases, thirteen different variants were found, four of them novel mutations in desmosomal genes, without previous description in the literature. Variants of uncertain significance (VUS) were found in 16 patients. The presence of a causal variant was present in all asymptomatic probands and was significantly associated with probands who have a family history of sudden cardiac death under 35 years. For the cellular modeling, from urinary progenitor cells (UPCs) and fibroblasts, hiPSCs from two patients were generated by episomal transfection. The first patient had a missense variant in the PKP2 gene, while the second had an insertion in the DSC2 gene. The hiPSCs were characterized for its pluripotency potential and subsequently differentiated into cardiomyocytes (hiPSC-CMs). Our results demonstrated significant phenotypic differences between the ARVC-CMs compared to the control-CMs, such as: significant reductions in the expression of desmosomal proteins and structurally altered desmosomes; presence of lipid droplet accumulation markers and increased regulation of the proadipogenic transcription factor PPAR-gamma; prolonged field potential duration (FPD) and action potential in 90% repolarization (APD90); slower conduction velocity and a lower active contraction force. In conclusion, this is the first work to characterize the genetic profile of ARVC, covering all genes described to date related to the disease, in the Brazilian population. The data obtained in this study suggests that patients with a family history of sudden cardiac death ( < 35 years) are more likely to carry a causal variant. In addition, our findings suggest that patients with causal variant in the PKP2 gene have a greater severity of the phenotypic presentation of arrhythmia. Our cellular model, which contemplated patient-specific cells with different causal variants of the previous studies, suggests that it is possible to study the effect of the genetic changes in ARVC, and may be an addition to the tools available to study the mechanism of this complex disease