Este projeto objetivou desenvolver um marcador molecular ligado ao gene de resistência a Tobacco mosaic virus (TMV), em vista da necessidade de aprimorar os métodos de melhoramento de plantas para atender crescentes demandas de produtividade. O outro objetivo deste trabalho foi a avaliação de uma população segregante F2 e de retrocruzamento (RC1F1) a Meloidogyne incognita raça 3, oriunda do cruzamento das cultivares comerciais Coker 176 (C176) e Coker 371 Gold (C371G). Para o desenvolvimento do marcador ligado ao gene de resistência a TMV, o gene N, foram desenvolvidos iniciadores específicos para regiões conservadas (TIR, NBS e LRR) deste gene com base em sua seqüência. Estes iniciadores foram utilizados para amplificar um marcador cuja ligação ao referido gene foi confirmada em 200 indivíduos de população segregante F2 oriunda do cruzamento entre uma linhagem resistente (Coker176) e outra suscetível ao vírus (Kentucky326). A proporção entre o número de plantas resistentes e suscetíveis (154:46) não diferiu estatisticamente daquela esperada no caso de segregação de um gene dominante de resistência, que seria de 3:1. Os resultados indicaram que o marcador e o gene estão proximamente ligados segundo taxa de recombinação, que foi de 1%. Na avaliação da hereditariedade a M.incognita utilizou-se 141 indivíduos da população segregante F2 oriunda do cruzamento entre uma linhagem resistente (Coker176) e suscetível (Coker 371G) e 138 indivíduos de RC1F1 ([C176 X C371G] X C371G). Os resultados obtidos entre a proporção entre o número de plantas resistentes e suscetíveis da população F2 (102:39) e da RC1F1 (67:71) não diferiu estatisticamente daquela esperada no caso de segregação de um gene dominante de resistência. / The aim of this study is to develop a molecular marker linked to the resistant gene to Tobacco mosaic virus (TMV) considering the necessity to improve plant breeding to meet growing demands of productivity. The other goal of this study is to evaluate the mode of inheritance of an F2 segregating population and backcross (BCF1) population of Meloidogyne incognita race 3 originated from cross breeding between commercial cultivars Coker 176 and Coker 371 Gold. For the development of the marker linked to the TMV resistant gene, the N gene, specific primers of this gene were developed for conserved regions (TIR, NBS and LRR) based on their sequence. These primers were used to amplify a marker whose connection with the aforementioned gene was confirmed in 200 individuals in a segregating F2 population originated from the cross breeding between a resistant cultivar (Coker176) and another cultivar which is susceptible to the virus (Kentucky326). The proportion between the number of resistant and susceptible plants (154:46) did not statistically differ from the one expected in the segregation of one dominant resistance, which would be a 3:1 segregation ratio. The results indicated that the marker and the gene are narrowly linked according to recombination ratio 1%. In the heredity evaluation of resistance to M.incognita 141 plants of the segregating F2 population originated from the cross breeding of a resistant (Coker176) and susceptible cultivar (Coker 371G) and 138 plants of backcross BC1F1 ([C176 X C371G) X C3371G) were used. The outcome of the proportion between the number of resistant and susceptible plants of segregating F2 (102:39) and BC1F1 population (67:71) were not statistically different from the ones expected for a monogenic dominant resistance.

O Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) é uma espécie do gênero Tospovirus, transmitido por tripes, que infecta diversas espécies da família Cucurbitaceae. Já foi constatado em diversos estados brasileiros e sua incidência tem aumentado significativamente nos últimos anos em algumas regiões. Por se tratar de uma virose em potencial para as cucurbitáceas, pouco se conhece sobre os danos causados e a reação das diferentes espécies de cucurbitáceas à infecção em campo. Esse trabalho teve por objetivos: estudar a eficiência da RT-PCR para a detecção rápida e especifica do ZLCV em cucurbitáceas; avaliar os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita em campo e a reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção natural A detecção do ZLCV por RT-PCR foi estudada utilizando um par de oligonucleotídeos iniciadores, desenhados com base na seqüência do S-RNA do ZLCV (AF067069). Quatro espécies de tospovírus (TSWV, TCSV, GRSV e CSNV) e outros vírus que infectam cucurbitáceas (PRSV-W-1, PRSV-W-C, ZYMV-M, ZYMV-Atibaia e CMV) foram incluídos no teste. Na reação de RT-PCR foi obtido um fragmento de aproximadamente 350 pb, amplificado somente a partir de RNA total extraído de planta infectada com o ZLCV. A seqüência obtida desse fragmento apresentou 98,2 % de identidade com a seqüência de nucleotídeos do S-RNA do ZLCV depositada no GenBank. Os danos causados pelo ZLCV em abobrinha de moita 'Caserta' foram avaliados em campo na ESALQ/USP, Piracicaba-SP, onde esse vírus é freqüente. As plantas foram monitoradas semanalmente quanto à infecção pelo ZLCV por meio dos sintomas e por PTA-ELISA. As plantas foram agrupadas em função da época de aparecimento dos sintomas do ZLCV, avaliando a produção de frutos comerciais (FC) e não comerciais (FNC) de cada grupo e comparando com a de plantas que permaneceram sem sintomas até o final do experimento. As plantas que apresentaram sintomas até os 23 dias após a emergência (DAE) não produziram qualquer tipo de frutos. FC foram colhidos de plantas que apresentaram sintomas a partir dos 42 DAE. Mesmo assim, houve redução de 78,5 % na produção de FC. Plantas que mostraram sintomas por ocasião da última colheita (55 DAE) apresentaram redução na produção de FC de 9,6 %. A infecção com o ZLCV até o início da frutificação inviabiliza a produção de FC de abobrinha de moita 'Caserta'. A reação de sete espécies/variedades de cucurbitáceas à infecção com o ZLCV foi avaliada em campo, por meio da infecção natural e em casa de vegetação, onde as plantas foram duplamente inoculadas mecanicamente com o ZLCV no estádio cotiledonar. A avaliação foi feita com base no monitoramento dos sintomas e por PTA-ELISA. A abobrinha de moita 'Caserta' e a abóbora híbrida 'Takaiama' apresentaram alta suscetibilidade ao ZLCV. O pepino 'Safira' apresentou baixa infecção em campo e intermediária em casa de vegetação. Enquanto que a melancia 'Crimson Sweet', o maxixe do Norte, a abóbora rasteira 'Menina Brasileira' e a moranga 'Alice' apresentaram valores menores de infecção. A moranga 'Exposição' foi altamente resistente, pois não foi infectada nos ensaios em campo e em casa de vegetação. / Zucchini lethal chlorosis virus is a specie of the Genus Tospovirus, transmitted by thrips (Frankliniella zucchini), which infects some species of the family Cucurbitaceae. The occurrence of this Tospovirus has already been reported for several Brazilian states and its incidence in cucurbit crops has increased in the last years in some regions. Considering the importance of this Tospovirus for cucurbit crops, very little is known about the damage caused by this virus and the reaction of the different species of cucurbits to infection. This work aimed: to study the efficiency of the RT-PCR for the fast and specific detection of ZLCV, to evaluate the damage caused by this virus on zucchini squash under field condition and the reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with this Tospovirus. The detection of ZLCV by RT-PCR was studied using a pair of primers designed based on the nucleotide sequence of the SRNA of ZLCV (AF067069). Four other Tospovirus species (TSWV, TCSV, GRSV and CSNV) and other virus that infect cucurbits (mild strain PRSV-W-1, wild strain PRSV-WC, mild strain ZYMV-M, wild strain ZYMV-Atibaia and CMV) were included in this test. The RT-PCR reaction generated a fragment of approximately 350 bp, only amplified from total RNA extracted from plant infected with ZLCV. The sequence of this fragment presented 98.2 % identity with the corresponding nucleotide sequence of the S-RNA of ZLCV deposited in the GenBank. The damage caused by ZLCV on zucchini squash (Cucurbita pepo cv. Caserta) was evaluated under field condition. Zucchini squash plants were weekly monitored for the presence of characteristic symptoms induced by ZLCV and PTA-ELISA for virus indexing. Plants were grouped based on the time the symptoms were first seen. Fruits harvested from each plant within each group were classified on marketable (M) and non-marketable (NM) based on the phenotype. Plants that did not show symptoms by the end of the crop were considered still healthy and their yield was used as control. Zucchini squash plants that showed symptoms of ZLCV infection up to 23 days after emergency (DAE) did not yield any fruit. Marketable fruits were first harvested only from plants that showed symptoms 42 DAE. However, the yield of marketable fruits was reduced by 78.5 %, as compared to that from asymptomatic plants. Plants that showed symptoms 55 DAE showed a reduction on the yield of marketable fruit of 9.6%. The reaction of seven species/varieties of cucurbits to infection with ZLCV was evaluated under field and greenhouse conditions. In the field experiment, ZLCV infection occurred naturally. In the greenhouse, plants were twice mechanically inoculated with ZLCV at the cotyledonal stage. Evaluations were based on symptoms expression and PTA-ELISA. Zucchini squash 'Caserta' and hybrid squash 'Takaiama' were highly susceptible. The cucumber 'Safira' presented low percentage of infected plants in the field and intermediate in the greenhouse. Watermelon 'Crimson Sweet', northern gherkin, long neck squash 'Menina Brasileira' and winter squash 'Alice' presented lower values of infected plants. Winter squash 'Exposição' was highly resistant to infection under field and greenhouse conditions.

A atividade florestal apresenta-se como um vetor de desenvolvimento social, ambiental e econômico no Brasil. Em 2004 as exportações ligadas ao setor renderam US$ 7 bilhões e contribuíram com US$ 5,5 bilhões em impostos. No mesmo ano, no Brasil, dos 6 milhões de hectares de reflorestamento comercial, mais de 50% dos hectares são ocupados por eucalipto. Esta cultura pode ser utilizada para diversas funções, desde à produção de papel e celulose, até a produção de carvão vegetal. Mas a produtividade desta cultura atualmente tem uma série de fatores limitantes. Destes fatores, um dos mais severos é uma doença denominada ferrugem, causada pelo fungo Puccinia psiddii Winter. Este patógeno entre tanto, não é conhecido nos centros de origem do gênero Eucalyptus, mas, utiliza como hospedeiros vários gêneros das Mirtáceas, infectando folhas, flores e frutos em desenvolvimento. O controle da doença é normalmente realizado mediante o uso de fungicidas. Porém, a utilização de plantas resistentes é o método mais aconselhável por diversos motivos, como o baixo custo, a praticidade e o menor impacto ambiental. Neste trabalho a metodologia do SAGE - Serial Analysis of Gene Expression foi utilizada, para a análise da expressão gênica uma vez que permite detectar e quantificar, de maneira global, a expressão de genes conhecidos e desconhecidos, envolvidos no processo de resistência à ferrugem. Neste trabalho analisou-se a expressão do conjunto de genes diferencialmente expressos e 200 genes sem diferenças no padrão de expressão, em Eucalyptus grandis infectado com Puccinia psidii. Utilizou-se para esta análise, indivíduos susceptíveis e resistentes à infecção por Puccinia psidii Winter. A população amostrada constituída por meios irmãos, apresentava segregação para o carácter de resistência à ferrugem. Os resultados produzidos permitiram identificar 421 genes com expressão diferencial (p ≤ 0,05) nos dois fenótipos. Vários destes genes estavam relacionados a diversos mecanismos de defesa da planta, tais como genes envolvidos na formação de barreiras físicas e na resposta hipersensível, resistência sistêmica adquirida, bem como genes relacionados à polarização celular e resposta ao estresse oxidativo. Os dados em conjunto, corroboram a idéia de que são vários os mecanismos que atuam simultaneamente produzindo o fenótipo resistente. Estes genes apresentam-se para serem utilizados futuramente como marcadores moleculares na seleção de indivíduos resistentes, em cruzamentos naturais ou dirigidos e como fonte de genes para experimentos de transformação em estudos mais profundos de fitopatogênese. / In Brazil the forest activities represent a vector for social, ambiental and economic development. In 2004 the exportations produced US$ 7 billions and contributed with US$ 5,5 billion in taxes. In the same year, in Brasil, of 6 million hectares of commercial reforestation, around 50% is occupied by eucalyptus. This crop can be used as the raw material for several industrial processes, from cellulose and paper production to vegetable charcoal production. However, eucalyptus productivity has several limiting factors. One of the most severe diseases is called rust, caused by the fungus Puccinia psiddii Winter. This pathogen is unknown in the Eucalyptus center of origin; however, it has several Myrtaceae genera as its host, infecting leaves, flowers and developing fruits. Rust management normally involves the use of fungicides, but the use of resistant plants is a much better alternative due the lower costs and minimal ambient impact. In the current study SAGE - Serial Analysis of Gene Expression was used for gene expression analysis because it is a quantitative genome-wide method and that obtains expression profiles from known and unknown genes involved in the rust resistant process. This thesis analyzed the expression profile of the differentially expressed genes and 200 genes without significant statistical differences in their expression patterns, in Eucalyptus grandis infected with Puccinia psidii. For this analysis we used susceptible and resistant individuals to Puccinia psidii Winter infection taken from a population half siblings, which showed segregation for fust resistance. The results indicated 421 genes with differential expression (p ≤ 0.05), 239 were preferentially expressed in the susceptible library and 232 in the resistant. Several of these genes were associated with plant defense mechanisms, such as genes involved in formation of physical barriers, hypersensitive response, systemic adquired resistance, genes related to cellular polarization and oxidative stress responses. All the data support the idea that not one but several mechanisms are acting at the same time producing the resistant phenotype. These genes are future candidates for molecular markers useful in the selection of resistant individuals in breeding programs and a source of genes for transformation experiments or as molecular tools to dissect the phytopathogenic process.

O método sorológico \"tissue blot enzyme immunoassay\" foi utilizado para determinar a taxa de colonização dos vasos do xilema por Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) em colmos de 28 variedades de cana-de-açúcar, incluindo a CB47-355, CB41-76 e CB49-260 como padrão resistente, intermediário e suscetível, respectivamente. Para cada variedade, 16 gemas foram tratadas termicamente a 50,5ºC por 2 horas e, em seguida, submetidas a banho fungicida a base de benomyl na dose de 6,5 g do princípio ativo por 10 litros de água. Oito gemas foram imersas por 10 minutos em caldo da CB49-260 sabidamente colonizada por Lxx diluído em água destilada na proporção 1:5 (\"INOCULADO\") e a outra metade em água (\"SADIO\"). Após a inoculação, foram plantados três vasos (repetições) para o tratamento, sendo as plantas mantidas em casa-de-vegetação até a colheita durante 7 meses, quando então 2 colmos de cada vaso foram amostrados para determinar a taxa de colonização dos vasos. A variedade CB47-355 não apresentou nenhum vaso colonizado, enquanto na CB41-76 e CB49-260 a taxa de colonização foi igual a 17% e 76%, sendo classificadas como resistente, intermediária e suscetível, respectivamente, concordando com literatura prévia. Das variedades em teste, 12 comportaram-se como intermediárias e 13 como suscetíveis. No primeiro caso, a %VC variou de 7 a 25 e, nas suscetíveis, de 25,7 a 76. Portanto, o aumento da taxa de colonização é praticamente linear da mais resistente para a mais suscetível, o que é característico de caráter quantitativo. Considerando que nenhuma variedade comercial mostrou-se resistente e que Lxx causa perdas significativas em todos os países produtores de cana-de-açúcar, sugere-se que os programas de melhoramento devem dirigir programas para a seleção de genitores e progênies para obter variedades resistentes. Enquanto isso não ocorre, atenção dever ser dada para o uso de mudas indexadas. / The tissue blot immunoassay (TBIA) for detecting Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) colonized vascular bundles (CVB) were used in determining the reaction of 28 brazilian sugarcane cultivars to ratoon stunting disease (RSD), including CB47-355, CB41-76 e CB49-260 as resistant, intermediate and susceptible standards. For each cultivar, 16 buds were hot water treated at 50,5 oC for 2 hours and protected against root rots with benomyl. Eight buds of each cultivar were than inoculated with infected sap of the CB49-260 diluted 1:5 in water, and the remaining 8 buds were inoculated with distilled water for planting the control plots. The reps of each cultivar were planted in plastic plots at green house. At harvesting, seven months after planting, two stalks were sampled from each plot. The rate of colonization of vascular bandles by Lxx in stalks of each cultivar was determined. Statistical analysis by the univariate clustering method (Scott-Knott) was reliable for grouping genotypes according to their levels of Lxx resistance by the percentage of CVB. The cultivar CB47-355 did not present any CVB, while CB41-76 and CB49-260 presented 17% and 76%, being classified as resistant, intermediate and susceptible, in agreement with previous literature. Among the varieties in test, 12 were intermediates and 13 susceptibles. The percent of CVB among the intermediate and susceptible cultivars varied from 7% to 25% and 25,7 to 76%, respectively. The knowledge of resistance of each cultivar is essential for advising the use of complementary phytossanitary measures to control the disease. Since all cultivars are intermediate or susceptible, the sugarcane breeding programs need specific works for selection and releasing of resistant cultivars. Before this, schemes of nurseries and the use clean seed cane are recommended.

A citricultura brasileira concentra-se principalmente no Estado de São Paulo que contribui com 80,4 % da produção nacional, sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais de citros. Um dos problemas enfrentados pela citricultura é a sua vulnerabilidade a pragas e doenças, devido principalmente a baixa diversidade genética nas variedades comerciais utilizadas, associada ao sistema de plantio em áreas extensas. Uma das doenças que vem causando crescentes prejuízos para a citricultura brasileira é a pinta preta ou mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely. O uso de conhecimentos de biologia molecular e métodos biotecnológicos devem ser considerados como importante alternativa para a produção de plantas geneticamente modificadas expressando genes de resistência. Para se obter plantas de citros resistentes a doenças, se faz necessário identificar genes que estejam relacionados com os mecanismos de defesa da planta. Na tentativa de identificar estes genes, o objetivo geral deste trabalho foi a identificação de genes in silico no banco de dados do Projeto Millenium CitEST e a análise de expressão diferencial de genes envolvidos na defesa. Mais de 7600 sequencias foram identificadas nas buscas no CitEST com similaridade aos genes R e genes envolvidos na HR e defesa, MAPKs e SNF1. Destes, foram selecionados 273 sequencias para experimentos de macroarranjo para análise da interação Citrus sinensis-Guignardia citricarpa. A análise estatística revelou que 171 genes (62,63%) apresentaram expressão diferencial significativa ao nível de 5% de probabilidade. Destes, 80 apresentaram expressão diferencial significativa maior do que duas vezes, dos quais 38 genes foram induzidos e 42 foram reprimidos no tecido infectado. Entre os genes induzidos estão MAPKs, genes de resistência (R), genes envolvidos na resposta de hipersensibilidade (HR) e na defesa da planta. Entre os transcritos reprimidos, há quatro similares a peroxidases e cinco similares a catalases, o que era esperado já que catalases e algumas peroxidases são capazes de remover H2O2, e assim a planta produz espécies reativa de oxigênio capaz de desencadear a ativação de genes de defesa. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq) de 9 genes. As análises confirmaram a expressão diferencial de 8 deles sendo que somente um apresentou resultado contrastante ao macroarranjo, o que demonstra a eficiência da metodologia de macroarranjos para estudo de muitos genes simultaneamente. Os genes diferencialmente expressos identificados na interação C. sinensis-G. citricarpa são de grande importância, pois são fortes candidatos para serem utilizados na transformação genética de plantas com o objetivo de obter novas variedades de plantas com resistência a patógenos. / The Brazilian citrus industry is concentrated mainly in the State of Sao Paulo which contributes with 80.4% of national production, with Brazil being a leading world producer of citrus. One of the problems facing the citrus industry is its vulnerability to pests and diseases, mainly due to low genetic diversity of the commercial varieties used, linked to the system of planting in extensive areas. A disease that is causing increasing damage to the brazilian citrus industry is the black spot of citrus caused by the fungus Guignardia citricarpa Kiely. The use of knowledge of molecular biology and biotechnological methods should be considered as an important alternative for the production of genetically modified plants expressing genes for resistance. In order to obtain citrus plants resistant to diseases it is necessary to identify genes that are related to the defense mechanisms of the plant. In an attempt to identify these genes, the general aim of this study was to identify genes in silico in the database of the Millennium CitEST Project and to perform differential expression analysis of genes involved in the defense mechanisms. More than 7600 reads were identified in the CitEST search with similarity to R genes, genes involved in HR and defense, MAPKs and SNF1. It was selected 273 reads for macroarray experiments to analysis of Citrus sinensis-Guignardia citricarpa interaction. Statistical analysis revealed that 171 genes (62.63%) showed significant differential expression at the level of 5% probability. From these, 80 showed significant differential expression higher than two fold, in which 38 genes were induced and 42 were repressed in infected tissue. Among the induced genes are MAPKs, resistance (R) genes, genes involved in hypersensitivity response (HR) and plant defense. Among the suppressed transcripts, there are four similar to peroxidases and five similar to catalases, which is expected because catalases and some peroxidases are able to remove H2O2, and so the plant produces reactive oxygen species capable of triggering the activation of defense genes. The macroarray data were validated by reverse transcription followed by quantitative real-time PCR (RT-PCRq) of 9 genes. The analysis confirmed the differential expression of 8 of them, and only one presented different result of macroarray which demonstrate the efficiency of the macroarray methodology to analyze several genes simultaneously. The genes differentially expressed in the interaction of C. sinensis x Guignardia citricarpa identified are of great importance because they are strong candidates for use in genetic transformation of plants with the objective of obtaining new varieties of plants resistant to pathogens.

O cancro bacteriano, causado por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), é uma das doenças mais importantes da cultura do tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), especialmente para tomateiros estaqueados. O controle está fundamentado na adoção de um conjunto de medidas preventivas, pois poucas são as informações sobre materiais resistentes à doença e não existe um produto químico que a controle eficientemente. Os objetivos desta tese foram determinar um método de inoculação adequado à seleção de genótipos de tomateiro resistentes ao cancro bacteriano; avaliar a reação de genótipos de tomateiro à inoculação com Cmm; e avaliar o efeito de acibenzolar-S-metil e outros produtos fitossanitários no controle da doença. Para o ensaio de metodologia, foram avaliados quatro métodos de inoculação (aspersão de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; aspersão, sob pressão, de suspensão bacteriana na face inferior das folhas; corte do sistema radicular, com tesoura, seguido de imersão na suspensão bacteriana; e ferimento na haste com alfinete entomológico transpassando uma gota de suspensão de inóculo depositada na axila foliar) e três concentrações de inóculo (108 ufc/mL, 107 ufc/mL e 106 ufc/mL). Posteriormente, foi avaliado o efeito da inoculação em plantas com diferentes idades, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a emergência. Foram utilizados os genótipos Kadá e Rotam-4 e um isolado bacteriano proveniente de Bragança Paulista, SP. A avaliação foi realizada através de uma escala descritiva, atribuindo-se notas que foram convertidas em índice de murcha bacteriana. A inoculação de Cmm, quatorze dias após a emergência das plantas, através da aspersão de suspensão bacteriana (108 ufc/mL) na face inferior das folhas, com avaliação aos 30 dias após inoculação, foi a metodologia mais apropriada para a avaliar a reação de genótipos de tomateiro. Estabelecida a metodologia, foram avaliados dez genótipos comerciais de tomateiro (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Júpiter, Olimpo, Fanny, Jumbo e Densus) para identificação de materiais resistentes ao cancro bacteriano, tendo-se Kadá e Rotam-4 como controles suscetível e resistente, respectivamente. Alambra e Jumbo apresentaram comportamento semelhante a Rotam-4, sendo materiais promissores para o plantio em áreas com histórico de ocorrência da doença. Para a avaliação de controle do cancro bacteriano foram testados os seguintes produtos: acibenzolar-S-metil (ASM), ASM + mancozeb, ASM + oxicloreto de cobre, mancozeb + oxicloreto de cobre, e oxitetraciclina. Três esquemas de aplicação dos produtos foram adotados: (E1) 4 aplicações (a primeira e a segunda realizadas seis e três dias antes da inoculação; a terceira e a quarta, aos três e seis dias após a inoculação); (E2) apenas as duas aplicações préinoculação; (E3) apenas as duas aplicações pós-inoculação. Esses produtos foram incorporados a meio de cultura para avaliação in vitro de seus efeitos sobre Cmm. Independente da forma de aplicação, o ASM, isolado ou em mistura com fungicidas, proporcionou reduções significativas na severidade da doença e não inibiu o desenvolvimento da bactéria in vitro. / Bacterial canker, caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), is one of the most important diseases of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Its control is based on a set of preventive measures, once there is a few information about resistant materials and the chemical control is not efficient. The objectives of this thesis were to determine a suitable inoculation methodology to bacterial canker resistance studies; to evaluate the reaction of commercial tomato genotypes to the inoculation with Cmm; and to evaluate the acibenzolar-S-methyl and other phytossanitary products effects on the control of that disease. To methodology trial, four inoculation methods were evaluated, including foliar pulverization with bacterial suspension; foliar pulverization under pressure with bacterial suspension; cutting of roots with scissor, followed by their immersion in bacterial suspension; and stem wounding with a pin passing over a drop of inoculum suspension deposited on the insertion point of leaf. Besides the inoculation methods, three inoculum concentrations were investigated: 108 cfu/mL; 107 cfu/mL and 106 cfu/mL. Later, it was evaluated the effect of inoculation on plants with different ages: 7, 14, 21 and 28 days after emergency. To those trials, genotypes Kadá and Rotam-4, and a bacterial isolate from Bragança Paulista, SP, were employed. The evaluation was accomplished through a descriptive scale, being attributed notes that were turned into bacterial wilt index. Inoculation of Cmm, fourteen days after emergency of plants, through aspersion with bacterial suspension (108 cfu/mL) over the inferior face of leaves, and evaluation 30 days after inoculation, was the most appropriated methodology to evaluate resistance to bacterial canker in tomato genotypes. After the establishment of the inoculation methodology, ten commercial tomato genotypes (Carmen, Débora max, IPA-6, Santa Clara, Alambra, Jupiter, Olimpo, Fanny, Jumbo and Densus) were investigated to identify resistant materials to the bacterial canker. Kadá and Rotam-4 were employed as susceptible and resistant controls, respectively. Alambra and Jumbo had a similar behavior to Rotam-4, being the most promising materials for the planting in areas with report of occurrence of bacterial canker. To evaluate the bacterial canker control following products were tested: acibenzolar-S-methyl (ASM), ASM + mancozeb, ASM + copper oxicloride, mancozeb + copper oxicloride, and oxytetracycline. Three schemes of application of the products were adopted: (E1) 4 applications (first and second ones were accomplished six and three days before inoculation; third and fourth ones, three and six days after inoculation); (E2) two applications before inoculation only; (E3) two applications after inoculation only. The effect in vitro of these products on Cmm was also evaluated. ASM, isolated or in mixture with fungicides, provided significant reductions in the disease severity independent of the scheme of application and had no effect on bacterial development in vitro.

O seqüenciamento em larga-escala e a aplicação da tecnologia de seqüências expressas (ESTs) permitiram a identificação de milhares de seqüências genômicas de vários organismos. Através de projetos como o de obtenção de ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST - Sugarcane EST Project), a tecnologia de macro e microarranjos de DNA pôde ser aplicada para o monitoramento da expressão gênica. O primeiro passo deste trabalho foi otimizar a técnica de macroarranjos utilizando-se colônias bacterianas. Os arranjos foram construídos com o auxílio do robô Q-Bot. Células bacterianas contendo clones de cDNA de cana-de-açúcar foram arranjadas em duplicata em membranas de náilon e crescidas por 6 e 12 horas. Como resultado, concluiu-se que é possível estudar a expressão gênica em larga-escala usando macroarranjos de colônias bacterianas crescidas por 6 horas. Na segunda parte, o objetivo foi identificar genes de defesa em duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), em resposta ao herbívoro Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). A cana-de-açúcar é de grande importância para a agricultura brasileira e para a economia geral de muitos países em desenvolvimento. Estas plantas são atacadas por D. saccharalis, a mais importante praga desta cultura, causando significativas perdas econômicas. Como é sabido, as plantas desenvolveram complexas estratégias para se protegerem do ataque de insetos-praga. As variedades SP80-3280 (susceptível) e SP81-3250 (tolerante) de cana-de-açúcar foram expostas à D. saccharalis. Plantas submetidas à lagarta e plantas controle foram coletadas em 0.5, 6, 12 e 24 horas de experimento. As análises permitiram a identificação de genes diferencialmente expressos em resposta à lagarta nas duas variedades. Foram analisados o tempo, dinâmica e regulação da expressão de 3.840 clones do SUCEST, os quais foram crescidos na membrana de náilon por 6 horas. Estes ESTs foram agrupados em dezesseis classes: metabolismo de aminoácidos, crescimento/desenvolvimento, metabolismo de proteínas, metabolismo de RNA, metabolismo secundário, resposta à diferentes condições de estresse, transporte, bioenergética, transdução de sinal, dinâmica celular, metabolismo de DNA, metabolismo de lipídios, elementos móveis, metabolismo de nitrogênio, sulfato e fosfato, metabolismo de nucleotídeos e função não determinada (ND). Estes resultados ajudam elucidar as estratégias de defesa desenvolvidas pela cana-de-açúcar para evitar os danos causados por esta praga. Neste estudo, os dados do macroarray revelaram 580 ESTs com expressão aumentada, oriundos das duas variedades. Estes resultados são importantes não somente porque este é o primeiro estudo em larga-escala da expressão gênica de uma monocotiledônea em resposta ao ataque de herbívoros, mas também porque permite a comparação dos perfis de expressão entre genótipos susceptível e tolerante de cana-de-açúcar. Este estudo abre possibilidades para a engenharia genética de plantas de cana-de-açúcar inseto-resistentes e também para o uso destes genes como marcadores moleculares em programas de melhoramento assistido. / Large-scale sequencing and the application of expressed sequence tag (EST) technology has led to the identification of hundreds of thousands of genomic sequences from various organisms. Through projects like the Sugarcane Expressed Sequence Tag (SUCEST), DNA arrays technology could be applied in monitoring gene expression. The first step of this work was to optimize the macroarray technique with bacterial colonies. Arrays were robotically constructed (Q-Bot). Bacterial cells carrying sugarcane cDNA clones were arrayed in duplicate onto nylon membrane and grown for 6 and 12 hours. As a result, we conclude that is possible to study the gene expression in large-scale using macroarray through bacterial colony that grown for 6 hours. The second part of this work was to study how different two sugarcane varieties (Saccharum sp.) are in response resistance against Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Sugarcane is of great importance for Brazilian’s agriculture and for the general economy of many tropical developing countries. These plants are attacked by D. saccharalis, the most important insect pest of sugarcane, causing significant economic losses. As it is well known, plants have evolved complex defense strategies to protect them in opposition to attack by insects. The varieties SP80-3280 (susceptible) and SP81-3250 (tolerant) were exposed to D. saccharalis. Plants materials from plants with the borer and control plants (without the borer) were collected at 0.5, 6, 12 and 24 hours time points. The analysis revealed genes differentially expressed in response to sugarcane borer in both varieties. We analyzed the timing, dynamics, and regulation of the expression of 3,840 SUCEST clones, which were grown on a nylon membrane for 6 h. These ESTs was grouped into 16 broad categories: amino-acid metabolism, plant grow and development, protein metabolism, RNA metabolism, secondary metabolism, stress response, transport, bioenergetics, signal transduction, cellular dynamics, DNA metabolism, lipid, fatty-acid metabolism, mobile genetic elements, nitrogen, sulphur and phosphate metabolism, nucleotide metabolism, and the group matched to unable to classify, which no indication of the function of the gene product are known. These results help to elucidate the defense strategies developed by sugarcane in order to prevent against insect damage. In this study, macroarray analyses revealed 580 ESTs with increased expression, from both varieties. These results are important not only because this is the first large-scale gene expression study of a monocot in response to insect attack, but also because it allows the comparison of the gene expression pattern between susceptible and tolerant genotypes. This study opens possibilities for genetically-engineering of insect-resistant sugarcane and for using these genes as molecular markers in conventional breeding programs.

A cultura do meloeiro é de grande importância econômica no Brasil, sendo a região Nordeste a principal produtora e exportadora do fruto. A baixa resistência aos principais patógenos é um dos fatores limitantes para a competitividade brasileira da cultura no mercado internacional. Uma das doenças mais importantes é o oídio, causado por Podosphaera xanthii. Geralmente, o controle de P. xanthii é obtido com o uso de fungicidas. Porém, é necessário empregar medidas mais econômicas e que não agridam o ambiente, como a utilização de cultivares resistentes. O objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares de vários tipos ligados ao gene Pm-1 de resistência à raça 1 de P. xanthii com o intuito de auxiliar programas de melhoramento genético. Para tanto foram utilizadas duas linhagens quase-isogênicas (LQI) de melão AF426pm1 (P1) e AF426Pm1 (P2), ambas pertencentes à variedade inodorus, que são contrastantes para ausência e presença, respectivamente, do gene Pm-1. Para a análise de co-segregação entre gene e marcadores candidatos, foi utilizada uma população de retrocruzamento RC1F1, fenotipada para resistência a raça 1 de oídio, obtida a partir do cruzamento entre linhagens. As técnicas de LM-PCR e AFLP resultaram em marcadores polimórficos, porém somente os encontrados com a técnica de AFLP puderam ser utilizados como marcadores no teste de co-segregação. Foram encontrados dois marcadores AFLP. No entanto, somente um, denominado HF155 mostrou-se ligado a uma distância de 4,9 cM do gene Pm-1. Devido à proximidade deste marcador ao gene este pode ser utilizado em programas de seleção assistida por marcadores, visando o melhoramento de linhagens com resistência ao P. xanthii. / Melon crop is of great economical importance in Brazil being the Northeast region the main producer and exporter of the fruit. The low levels of resistance to pathogens is one of the restricting factors for the Brazilian competitiveness worldwide. One of the most important diseases is powdery mildew caused by Podosphaera xanthii. Generally, the control of P. xanthii is achieved with the use of fungicides. However it is necessary to use less expensive control methods with a minimum environmental impact such as resistant cultivars. The objective of this work was to identify molecular markers linked to the Pm-1 gene which confers resistance to race 1 of P. xanthii with the purpose of assisting boding program. Two near isogenic lines (LQIs) of melon Agro AF426pm1 (P1) and AF426Pm1 (P2), both belonging to the inodorus variety, which are respectivally contrasting for abscence and presence of Pm-1 gene were analyzed. For the cosegregation analyses between gene and candidate markers, it was used the BC1F1 population was used screened for resistance to powdery mildew and obtained from a cross between the LQIs. The LM-PCR and AFLP techniques were efficient in the polymorphisms detection, however only those ones which were found using AFLP technique could be used as markers in the co-segregation test. It was found two markers with this technique but just the HF155 is located 4.9 cM of the Pm-1 gene. Due the proximity of the HF155 marker to the Pm-1 gene this one can be used in markerassisted selection aiming to develop melon cultivars resistant to P. xanthii.

A mancha foliar de Phaeosphaeria em milho (Zea mays L.) tornou-se uma preocupação no Brasil, nos últimos anos, por causa de sua ampla disseminação em áreas de cultivo. Estudos de herança da reação de genótipos de milho a essa doença foliar são necessários para dar suporte aos programas de melhoramento. Assim, o objetivo desta pesquisa foi mapear QTLs para estudar a herança e para identificar alelos favoráveis de reação à mancha foliar de Phaeosphaeria em uma população de milho tropical. Linhagens endogâmicas L 14- 04B e L 08-05F, altamente susceptível e altamente resistente à mancha foliar de Phaeosphaeria, respectivamente, foram utilizadas para gerar uma população F2. Duzentas e cinqüenta seis plantas F2 foram genotipadas com 143 marcadores microssatélites, e suas progênies F2:3 foram avaliadas em látices simples, 16 x 16, delineados em três estações experimentais, no ano agrícola de 2002/2003, e em quatro estações experimentais no ano agrícola de 2003/2004. A infecção artificial não foi usada, mas parcelas com o parental susceptível L-14-04B foram alocadas no início e no final de cada repetição, a cada dezesseis progênies, e como bordadura ao redor dos experimentos, para propiciar a disseminação dos esporos de P. maydis. Foram avaliadas dez plantas por parcela, aos 30 dias após o florescimento, por escala de notas de 1 (altamente resistente) a 9 (altamente susceptível). As médias de parcelas foram utilizadas para as análises de variância, e as médias dos ambientes foram usadas para mapear QTLs. A metodologia de mapeamento por múltiplos intervalos (MIM) foi utilizada para mapear QTLs. A análise de variância conjunta mostrou alta significância para as progênies e para a interação progênies x ambientes, mas a estimativa da variância genética foi significativamente maior que a estimativa da interação genética x ambientes, e o coeficiente de herdabilidade, no sentido amplo, foi alto (91,37%). Seis QTLs foram mapeados, um para cada dos seguintes cromossomos: 1 (Ph1), 3 (Ph3), 4 (Ph4), e 6 (Ph6); e dois para o cromossomo 8 (Ph8a e Ph8b). O grau médio de dominância foi de dominância parcial, mas a ação gênica dos QTLs variou de aditiva a dominância parcial, e a epistasia do tipo dominante x dominante foi também detectada entre os QTLs mapeados do cromossomo 8. A variância fenotípica, explicada pelos QTLs ( 2 R ), variou de 2,91% (Ph8b) a 11,86% (Ph8a), e os efeitos conjuntos dos QTLs explicaram 41,62% da variância fenotípica. Todos os alelos favoráveis para a reação à mancha de Phaeosphaeria; por exemplo, alelos de resistência, estavam na linhagem parental resistente L-08-05F. A correlação entre os valores de médias fenotípicas e os valores genotípicos preditos, baseados nos efeitos de QTLs das progênies, foi 70 , 0 = r ; a seleção, baseada em ambos os critérios (médias fenotípicas e valores preditos) para a intensidade de seleção de 10% (26 progênies) mostrou concordância de somente 46,15% (12 progênies). Todavia, os alelos favoráveis dos QTLs, mapeados da linhagem parental resistente L-08-05F, poderão ser transferidos para outras linhagens em programas de melhoramento via retrocruzamentos assistidos por marcadores moleculares, os quais poderão ser úteis para o melhoramento. / Phaeosphaeria leaf spot disease in maize (Zea mays L.) has becoming a concern in Brazil in the last years because of its increase spreading in maize growing areas. Inheritance studies of the reaction of maize genotypes to this foliar disease are necessary to support plant breeding programs. Thus, the objective of this research was to map QTLs to study the inheritance and to identify favorable alleles for reaction to the Phaeosphaeria leaf spot in a tropical maize population. Inbred lines L 14-04B and L 08-05F, highly susceptible and highly resistant to Phaeosphaeria leaf spot, respectively, were used to develop an F2 reference population. Two-hundred and fifty-six F2 plants were genotyped with 143 microsatellites markers, and their F2:3 progenies were evaluated in 16 x 16 simple lattice designs at three locations in the 2002/2003 growing season, and at four locations in the 2003/2004 growing season. Artificial infection was not used, but plots of the highly susceptible parental inbred L 14-04B were allocated at the beginning and at the end of each replication, at each set of sixteen progenies, and as a border all around the experiments, to provide the spread of P. maydis spores. Ten plants were evaluated per plot, 30 days after silk emergence, following a note scale; i.e., from 1 (highly resistant) to 9 (highly susceptible). The plot means were used for the analyses of variance, and the least squares means across environments were used to map QTLs. The multiple intervals mapping (MIM) was used for QTL mapping. The joint analysis of variance showed highly significance for progenies and for progenies by environment interaction, but the estimate of genetic variance was significantly greater than the estimate of the genetic by environment interaction, and the broad sense coefficient of heritability was high (91.37%). Six QTLs were mapped, one at each of the following chromosomes: 1 (Ph1), 3 (Ph3), 4 (Ph4), and 6 (Ph6); and two at chromosome 8 (Ph8a and Ph8b). The average level of dominance was partial dominance, but the gene action of the QTLs ranged from additive to partial dominance, and dominance x dominance epistasis was also detected between the QTLs mapped at chromosome 8. The phenotypic variance explained by the QTLs ( 2 R ) ranged from 2.91% (Ph8b) to 11.86% (Ph8a), and the joint QTLs effects explained 41.62% of the phenotypic variance. All the favorable alleles to reaction to Phaeosphaeria leaf spot; i.e., resistance alleles, were in the resistant parental line L- 08-05F. The correlation between mean phenotypic values and the predicted genotypic values based on QTLs effects of the progenies was 70 , 0 = r ; and the selection based under both criteria (phenotypic means and predicted values) at 10% selection intensity (26 progenies) showed an agreement of only 46.15% (12 progenies). Nonetheless, the favorable alleles of the QTLs mapped in the parental line L 08-05F could be transferred to other inbred lines by marker-assisted backcross breeding programs, which could make them useful for breeding purposes.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.