As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

As condições para uma eficiente transfecção pelo método de fosfato de cálcio podem variar substancialmente. Neste estudo foi estabelecido o tipo de célula apropriada para transfecção de herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5). Para atingir este objetivo foram testadas amostras de DNA de células infectadas com BoHV-1gE-, DNA purificado de BoHV-5, assim como DNA de 3 plasmídeos. Este material foi transfectado em células de rim de macaco verde africano (VERO), de rim de suíno (PKsC3), de testículo de terneiro (TT) e células de rim de bovino (MDBK) e células resistentes a vírus da diarréia viral bovina (CRIB). Os procedimentos da transfecção com DNA plasmideal expressando o gene repórter EGFP foram feitos para identificar as melhores células transfectadas. Os resultados mostraram um percentual de 0,5% de células fluorescentes para VERO, 2,9% para PKsC3, 4,5% para TT e 0,05% para MDBK. Foi averiguada a capacidade do BoHV-5 de se replicar nestes quatro tipos de células. Uma amostra de vírus foi titulada em células VERO, PKsC3, TT e MDBK. Células VERO e PKsC3 apresentaram um título de 103,3 TCID/mL, enquanto que as células MDBK mostraram um título de 106,8 TCID/mL, o mesmo encontrado para as células TT. Quando células PKsC3 e TT foram transfectadas com 0,5 µg de DNA purificado de BoHV-5, somente as células TT apresentaram resultado positivo com duas placas virais por poço em placa de seis poços. Para investigar a influência da concentração de DNA viral, células TT foram transfectadas com 0,5 µg e 1 µg de DNA purificado de BoHV-5, sendo verificadas 2 e 4 placas, respectivamente. Estes resultados indicam que as células TT são boas candidatas para serem utilizadas na transfecção de DNA de BoHV-5, no entanto, experimentos adicionais são necessários para melhorar a eficiência de transfecção neste tipo de célula. / The conditions for efficient transfection using the calcium phosphate technique may vary substantially. In this study it was the type of cell suitable for transfection of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5). To achieve this goal DNA samples from cells infected with BoHV-1gE-, purified DNA from BoHV-5, as well as three plasmid DNA were tested. This material was transfected into cells of African green monkey kidney (VERO), pig kidney cells (PKsC3), calf testicle cells (TT), bovine kidney cells (MDBK) and kidney cells resistant to bovine viral diarrhea virus (CRIB). The procedures of transfection with DNA plasmideal expressing the EGFP reporter gene were carried out to identify the best transfected cells. Results showed 0.5% of fluorescent cells for VERO, 2.9% for PKsC3, 4.5% for TT and 0.05% for MDBK cells. It was also investigated the ability of BoHV-5 to replicate in these four types of cells. A sample of virus was titrated in VERO, PKsC3, TT and MDBK cells. VERO and PKsC3 cells presented a titre of 103,3 TCID/mL, whereas MDBK cells reached a value of 106,8 TCID/mL, the same displayed by TT cells. When PKsC3 and TT cells were transfected with 0.5µg of BoHV-5 purified DNA, only TT cells gave positive result with two viral plaques per well in six-well plate. To investigate the influence of viral DNA concentration, TT cells were transfected with 0.5 µg and 1µg of BoHV-5 purified DNA, which yielded 2 and 4 plates, respectively. These results indicate that TT cells are good candidates for using in transfection of BoHV-5 DNA, however, additional experiments are needed to improve the efficiency of transfection in this type of cell.

A utilização do vírus adeno-associado recombinante (AAVr) como vetor de transferência gênica em células tumorais está crescendo. Neste trabalho, o promotor gênico de E2F-1, um promotor ativo durante a divisão celular, foi inserido no AAVr e utilizado para dirigir a expressão do HSV-tk ou luciferase e, simultaneamente, eGFP afim de direcionar a expressão viral para células em proliferação. Em paralelo, foram construídos vetores portadores do promotor constitutivo CMV para servir como controles. O promotor gênico de E2F-1 não foi eficiente em dirigir a expressão dos transgenes na linhagem celular HT1080, enquanto o promotor CMV apresentou uma alta expressão dos repórteres e do gene terapêutico. A baixa eficiência do promotor E2F-1 ainda não foi explorada, mas poderia ser relacionada com o desempenho intrínseco deste promotor, a biologia do vetor AAVr e especificidade celular. Contudo, o bom desempenho do vetor AAVr contendo o promotor CMV abre a possibilidade de realizar novos ensaios de transferência gênica para tratamento e visualização de células tumorais / The utilization of recombinant adeno-associated virus (AAVr) as a gene transfer vector in tumor cells is increasing. In this work, the promoter of the E2F-1 gene, active during cell division, was inserted in an AAVr vector and used to drive the expression of HSV-tk or luciferase and, simultaneously, eGFP with the intent of limiting viral expression to proliferating cells. Also, vectors with the constitutive CMV promoter were constructed to be used as controls. The E2F-1 promoter was not efficient in driving the expression of the transgenes in the HT1080 cell line, while the CMV promoter shows high level expression of the reporter and the therapeutic genes. The low efficiency of E2F promoter has not yet been explored, though this problem could be related to the intrinsic performance of this promoter, the biology of the vector AAV and cell-specific factors. However, the performance of the AAVr containing the CMV promoter creates the possibility of performing new gene transfer protocols for the treatment and visualization of tumor cells.

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFN<font face=\"Symbol\">b, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFN<font face=\"Symbol\">b pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma. / Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-<font face=\"Symbol\">b (IFN<font face=\"Symbol\">b) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFN<font face=\"Symbol\">b, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFN<font face=\"Symbol\">b could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.