Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTPm) joue un rôle majeur dans la mort cellulaire et dans la cardioprotection. Notre hypothèse est que le complexe I de la chaîne respiratoire est impliqué dans la régulation de l’ouverture du PTPm. Sur des mitochondries isolées de cœurs des rongeurs, nous avons pu démontrer que le PTPm est désensibilisé par la cyclosporine A, un inhibiteur de la cyclophiline D (CyP-D), et cet effet est largement amplifié en présence de la roténone, un inhibiteur du complexe I. Ces résultats ont été confirmés chez la souris CyP-D déficiente. L’étude de plusieurs types cellulaires a aussi confirmé l’effet de la roténone dans la régulation du PTPm. Ainsi, nous avons pu montrer que le flux d’électrons travers le complexe I est capable de réagir sur un site de régulation du PTPm cardiaque masqué par la CyP-D. De plus, les analogues de l’ubiquinone, élément de la chaîne respiratoire impliqué dans le transfert d’électrons entre les complexes I, II et III, modulent la susceptibilité du PTPm vis-à-vis du Ca2+. Par ailleurs, dans un modèle de cœur isolé du rat, le postconditionnement par le perindoprilate, un inhibiteur de l’enzyme de conversion, diminue la taille de l’infarctus après l’ischémie-reperfusion d’une façon NO-dépendant. L’ensemble de nos résultats ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la cardioprotection et montre l’importance du complexe I et de la CyP-D comme cibles moléculaires incontournables dans la cardioprotection / The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) plays an important role in cell death and cardioprotection. Our hypothesis is that the complex I of mitochondrial respiratory chain regulates the opening of mPTP. We showed that the opening of mPTP was inhibited by Cyclosporin A (CsA), a cyclophilin D (CyP-D) inhibitor, in mitochondria isolated from rodent heart, and this effect was largely amplified by rotenone, a complex I inhibitor. These results were confirmed in mitochondria devoid of CyP-D. A study realised in several cell lines also confirmed the effect of rotenone in mPTP regulation. We concluded that the electron flow through the respiratory chain complex I regulate mPTP opening and the regulatory site is masked by CyP-D in cardiac mitochondria. Moreover, two analogues of ubiquinone, mobile carrier of electrons between complex I, II and complex III, modulate the susceptibility of mPTP. In addition, in a model of isolated rat heart, postconditioning with Perindoprilat, an angiotensin converting enzyme inhibitor, protects the heart from ischemia-reperfusion injury in an NO-dependant manner. The findings of the present work put new therapic perspectives in cardioprotection

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem mitochondrialen Sco1-Protein der Hefe Saccharomyces cerevisiae sowie mit weiteren Vertretern der Sco-Proteinfamilie. Sco1p ist essenziell für die Assemblierung der Cytochrom c Oxidase (COX), dem terminalen Komplex der Atmungskette. Aufgrund von genetischen Daten wurde angenommen, dass es an der Insertion von Cu-Ionen in den COX-Komplex beteiligt ist. Dabei existieren zwei unterschiedliche Vorstellungen über seine Wirkweise: Einerseits könnte Sco1p als Cu-Chaperon selbst Cu-Ionen binden und anschließend auf die Cu-tragenden COX-Untereinheiten Cox1p und/oder Cox2p übertragen. Andererseits könnte es als Disulfidreduktase die in die Cu-Bindung involvierten Cysteinreste von Cox2p reduzieren und somit die Voraussetzung für eine Cu-Anheftung an Cox2p schaffen. In beiden Fällen wird den unter den Sco-Proteinen konservierten Aminosäuren Cystein(148), Cystein(152) und Histidin(239) eine Schlüsselrolle zugedacht. Es wurde gezeigt, dass diese Aminosäuren tatsächlich essenziell für die Funktion von Sco1p sind. Die Daten dieser Arbeit sprechen dafür, dass Sco1p als Cu-Chaperon fungiert: Sco1p zeigt keine Aktivität als Disulfidreduktase. Außerdem interagiert Sco1p mit Cox17p - dem Protein, das Cu-Ionen in die Mitochondrien importiert - und geht mit Cox2p eine Wechselwirkung ein. Im Rahmen der Interaktionsanalysen wurde weiterhin gezeigt, dass Sco1p homomere Komplexe ausbildet. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in Untersuchungen zum homologen Sco2p aus Saccharomyces cerevisiae, das im Gegensatz zu Sco1p nicht essenziell für eine funkionsfähige COX ist. Trotz seiner großen Ähnlichkeit ist Sco2p nicht in der Lage, die Funktion von Sco1p zu erfüllen. Im Rahmen dieser Arbeit konnt aber demonstriert werden, dass Sco2p zumindest teilweise Sco1p ersetzen kann. Somit kann für beide Proteine angenommen werden, dass sie überlappende Funktionen besitzen. Übereinstimmend wurde nachgewiesen, dass Sco2p - wie Sco1p - in der Lage ist, mit Cox17p und mit Cox2p zu interagieren und außerdem heteromere Komplexe mit Sco1p formiert. Es wurde ein Modell zur Wirkweise von Sco1p und Sco2p entwickelt.

Le domaine de la bioénergétique concerne l’étude des échanges et des transformations de l’énergie au sein des organismes vivants. Cette thèse propose une étude électrochimique et spectroscopique de protéines issues de la chaine respiratoire, les oxydases terminales, afin de comprendre l’influence de différentes propriétés de ces enzymes (potentiels des cofacteurs, dépendance pH…) sur leur mécanisme réactionnel. La première partie de ce travail décrit le développement d’une méthode d’immobilisation permettant de conserver l’intégrité et l’activité de ces enzymes. Cette technique a d’abord été utilisée pour étudier l’inhibition de la cytochrome aa3 oxydase de P. denitrificans et a permis de mettre en avant l’importance du transfert de protons sur la réaction de réduction de l’oxygène. Une deuxième étude propose de comparer deux isoformes de la cytochrome cbb3 oxydase dont aucune différence n’a été observée à ce jour. La spectroscopie IRTF couplée à l’électrochimie montre l’implication de résidus acides différents au cours de la réaction d’oxydoréduction suggérant des différences mécanistiques. La dernière partie propose une étude comparative d’oxydases terminales de différents types et met en perspective l’influence des potentiels relatifs des hèmes sur la réaction de réduction de l’oxygène. / The field of bioenergetics concerns the study of exchange and transformation of energy in living organisms. This manuscript proposes an electrochemical and spectroscopic study of the fourth complex of the respiratory chain, the terminal oxidases. The aim of this study was to understand the influence of some properties of these enzymes (potential of the cofactors, pH dependency…) on the catalytic mechanism. The first part describes an immobilization procedure which retains the protein activity and structure. This procedure has been applied for the study the inhibition of the proton pathways of cytochrome aa3 oxidase from P. denitrificans and shows the importance of proton transfer on the oxygen reduction. In a second study, two isoforms of cytochrome cbb3 oxidase were compared. No differences were observed between them until now. Our electrochemically induced FTIR spectroscopy study suggests the implication of different acidic residues during the redox reaction implying differences in the mechanism of these enzymes. The last part deals with the comparison of terminal oxidases of different types and shows the influence of the relative order of the midpoint potentials of the hemes on the oxygen reduction.

F1FO-ATPsynthase is a key enzyme in energy metabolism of the cell. Its deficit is caused usually by mutations in two structural genes MT-ATP6 and MT-ATP8 encoded by the mitochondrial DNA or in nuclear genes ATPAF2 and TMEM70 encoding the biogenesis factors and structural gene ATP5E. Deficiency of the F1FO-ATPsynthase leads to progressive and serious phenotype affecting organs with high energy demands. The first symptoms usually occurs in neonatal age and prognosis of the disease is fatal. Mutations in these genes result in both qualitative and quantitative defects of the F1FO-ATPsynthase. The study of molecular bases of mitochondrial disorders including F1FO-ATPsynthase deficiency uses large number of biochemical and molecular-genetic methods to determine a proper diagnosis which is essential for the symptomatic therapy and genetic counselling in affected families. The aim of the diploma thesis was to characterise the F1FO-ATPsynthase deficiency in isolated mitochondria from the lines of cultured cells by the determination oligomycin- sensitive ATP-hydrolytic activity of the F1FO-ATPsynthase, enzymatic activities of the respiratory chain complexes and to analyse changes in the steady-state levels of the representative subunits and whole complex of the F1FO-ATPsynthase in comparison with controls. 3...

Mitochondrial protein homeostasis is crucial for cellular function and integrity. It is ensured by many specific mitochondrial proteases with possible chaperone functions located across the various mitochondrial subcompartments. In the first part, we have focused on characterization of functional overlap and cooperativity of proteolytic subunits AFG3L2 and YME1L of the mitochondrial inner membrane complexes m- and i-AAA in HEK293 cells. The double AFG3L2/YME1L knockdown cells showed severe alteration in OPA1 protein processing, marked elevation in OMA1 protease and severe reduction in SPG7. Our results reveal cooperative and partly redundant involvement of AFG3L2 and YME1L in the maintenance of mitochondrial protein homeostasis and further emphasize their importance for mitochondrial and cellular function and integrity. The aim of the second part was to characterize the cellular function of LACE1 (lactation elevated 1) in mitochondrial protein homeostasis. LACE1 protein is a human homologue of yeast Afg1 (ATPase family gene 1) ATPase. We show that LACE1 is a mitochondrial integral membrane protein that exists as a part of three complexes of approximately 140, 400 and 500 kDa. We demonstrate that LACE1 mediates degradation of nuclear-encoded complex IV subunits COX4, COX5A and COX6A. Using affinity...