Memoria para optar al título de Ingeniero Civil Electricista / Memoria para optar al título de Ingeniero Civil Industrial / La detección automática de la patología oftalmológica denominada retinopatía diabética tiene el potencial de prevenir casos de pérdida de visión y ceguera, en caso de impulsar la exanimación masiva de pacientes con diabetes. Este trabajo apunta a diseñar y desarrollar un clasificador a nivel de prototipo que permita discriminar entre pacientes con y sin presencia de la enfermedad, por medio del procesamiento automático de imágenes de fondo de ojo digitales. Los procedimientos se basan en la adaptación e integración de algoritmos publicados. Las etapas desarrolladas en el procesamiento digital de las imágenes de retina para este objetivo fueron: localización de vasos sanguíneos, localización de disco óptico (DO), detección de lesiones claras y detección de lesiones rojas. Las técnicas utilizadas para cada una de las etapas fueron, respectivamente: Gabor wavelets y clasificadores bayesianos; características de los vasos y predicción de posición mediante regresores kNN; segmentación mediante fuzzy c-means y clasificación usando una red neuronal multicapas; y, operadores morfológicos ajustados óptimamente. La base de datos de imágenes para el entrenamiento y prueba de los métodos desarrollados cuenta con 285 imágenes de un centro médico local, incluyendo 214 normales y 71 con la enfermedad. Los resultados específicos fueron: 100% de precisión en la ubicación del DO en las 142 imágenes de prueba; identificación del 91,4% de las imágenes con lesiones claras, i.e., la sensibilidad, mientras se reconocieron 53,3% de las imágenes sin lesiones claras, i.e., la especificidad (84,1% de sensibilidad y 84,7% de especificidad a nivel de pixel) en las mismas 142 muestras; y, 97% de sensibilidad y 92% de especificidad en la detección de lesiones rojas en 155 imágenes. El desempeño en la ubicación de la red vascular es medido por el resultado del resto de los pasos. El rendimiento general del sistema es de un 88,7% y 49,1% en cuanto a sensibilidad y especificidad, respectivamente. Algunas medidas fundamentales son necesarias para la implementación a futuro. En primer lugar, acrecentar la base de datos de imágenes para entrenamiento y prueba. Además, es posible pulir cada una de las etapas intermedias de las cuatro grandes fases. Con todo, una ronda de implementación a nivel usuario de un prototipo general permitirá evaluación y mejora de los métodos diseñados y desarrollados.

Ingeniería Civil Industrial / El trabajo desarrollado en esta memoria consiste en dilucidar si realizar screening masivo a la población diabética en una etapa temprana de la patología oftalmológica Retinopatía Diabética con un método de bajo costo, como lo es la cámara fotográfica no midriática, aumentaría el número de casos confirmados con la enfermedad, disminuiría los costos por la prestación del servicio y mejoraría la calidad de vida de las personas. En Chile, se estima que al año 2010 existen alrededor de 1.200.000 diabéticos, de los cuales alrededor de 360.000 personas tendrían cierto grado de Retinopatía y a la fecha sólo se han atendido135.956 casos de RD. Con el método existente no es posible que la población diabética revise de forma periódica sus ojos para poder prevenir complicaciones a la visión. Las causas de este quiebre son la falta de conciencia existente sobre la enfermedad por parte de los pacientes; que el método actual de screening es costoso ya que es realizado por oftalmólogos que son escasos; y la creciente demanda de la población de diabéticos, que excede la capacidad de los Servicios de Oftalmología. Es aquí en donde MICROLÓGICA INNOVACIÓN S.A. pretende crear una oportunidad, dando una solución a la incapacidad existente de atender la demanda de pacientes basándose en una mejor tecnología. La metodología para el trabajo consistió en realizar una investigación bibliográfica, en efectuar una investigación en terreno y en desarrollar una Evaluación Económica de Intervenciones en Salud, con el fin de poder dimensionar el impacto de un nuevo método de screening en términos de costos, efectos y costo-efectividad en comparación con la forma tradicional de realizar el examen. El nuevo método se realiza con cámara fotográfica no midriática, que mediante un software puede discriminar imágenes de retina que presenten alta probabilidad de RD, para sólo derivar este porcentaje al oftalmólogo. De los resultados obtenidos se concluye que realizar esta intervención, a un horizonte de tiempo de 10 años, significaría un ahorro en costos de aproximadamente la mitad de recursos monetarios que se utilizarían con el método tradicional. También al cabo de ese período de tiempo, podrían ser evitados alrededor de 600 años de vida vividos con discapacidad. Además, la introducción de un nuevo método de detección de Retinopatía Diabética sería costo-efectivo, debido a que los resultados muestran una razón incremental de costo-efectividad (ICER) bajo el umbral establecido por la OMS. Estos efectos se logran ya que el método con cámara no midriática sería especialmente beneficioso en el caso de la Diabetes Mellitus tipo 2, que constituye la gran mayoría de la población diabética.

El presente trabajo de investigación con abordaje de estudio de caso, buscó caracterizar, comprender, analizar cómo fue el afrontamiento de los padres frente a la retinopatía del prematuro, el cual estuvo desarrollado a la luz de la Teoría de adaptación- Callista Roy. El instrumento de recolección de datos utilizado fue la entrevista semiestructurada aplicada a 8 padres de familia, delimitadas por saturación y redundancia. El estudio estuvo tutelado bajo los principios éticos según Sgreccia: Libertad y Responsabilidad, seguida de la subsidiaridad. Así también se puede mencionar los siguientes criterios de rigor científico: adecuación, fiabilidad, validez, credibilidad, transferibilidad y confortabilidad. Los datos adquiridos fueron analizados, obteniéndose cuatro categorías: Primera Categoría: Expresando manifestaciones fisiológicas como modo de afrontamiento. Segunda categoría: El afrontamiento bajo un enfoque interdependiente, de la cual se obtuvo dos subcategorías: El apoyo familiar frente a las dificultades y la relación significativa y esperanza en Dios. Tercera categoría: Expresando emociones frente a la realidad. Cuarta Categoría: Decisiones en el desempeño de rol de los padres frente a la situación vivida. Se concluyó lo siguiente: Los factores como: apoyo familiar, economía, nivel cultural, determinaron la eficacia o la ineficacia del afrontamiento ante la situación vivida. Los padres al recibir la noticia sobre la enfermedad de Retinopatía del prematuro (ROP) en su menor hijo, experimentaron reacciones fisiológicas y emociones negativas ocasionadas por el estrés, siendo Dios y la familia las principales fuentes de apoyo para ellos.

La inflamación es un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades de la retina que eventualmente terminan en la pérdida de la visión y ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética (RD), endolftalmitis bacteriana y la uveítis. En este contexto, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son esenciales para mantener la integridad estructural y funcional de la retina y se ha demostrado que, en estas condiciones patológicas, el EPR puede mediar importantes funciones inmunológicas y participar activamente de la respuesta inflamatoria. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR. En particular nos propusimos estudiar el rol de la vía de la fosfolipasa D (PLD), generadora de mensajeros lipídicos, en dos modelos de injuria inflamatoria: i) inducida por lipopolisacárido (LPS) y ii) por altas concentraciones de glucosa (HG), a modo de simular las hiperglucemias características de la diabetes. En el desarrollo de esta tesis utilizamos dos líneas celulares de EPR de origen humano, las líneas ARPE-19 y D407. Las PLD clásicas hidrolizan fosfatidilcolina (PC) para generar un segundo mensajero lipídico, el ácido fosfatídico (PA) y colina. El PA puede desfosforilarse por las lípido fosfato fosfohidrolasas (LPP) para generar diacilglicerol (DAG), otro lípido bioactivo. Por lo tanto, la vía de PLD/LPP puede modular la actividad de las proteínas que responden al DAG, como las proteínas quinasas C (PKC) y también de proteínas que son moduladas por el PA, como mTOR (del inglés, mammalian target of rapamycin), entre otras. Resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado la activación de la vía PLD y la participación de las isoformas clásicas (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del EPR expuestas a LPS. En el capítulo I estudiamos el rol de la vía PLD en la activación de la señalización por PKC en las células del EPR expuestas a LPS. Demostramos que ambas PLD clásicas son necesarias para la activación de isoformas convencionales de PKC (α y βII), mientras que la activación de la isoforma novel PKCε solo es dependiente de la PLD1. Evidenciamos además que la PKCε media la supervivencia de las células del EPR expuestas al LPS promoviendo una menor activación de la caspasa-3 y aumentando la expresión de Bcl-2 y la activación de Akt. Por otra parte, las PKCα y β no estarían involucradas en la pérdida de la viabilidad inducida por el LPS. En conclusión, la vía PLD1-PKCε media la supervivencia de las células del EPR previniendo las señales apoptóticas inducidas por el LPS. En el capítulo II caracterizamos el modelo de injuria celular inducido por HG. La exposición de las células del EPR a HG indujo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la activación de la caspasa-3 y la disminución de la funcionalidad mitocondrial (parámetro de viabilidad celular). Demostramos además que los niveles elevados de glucosa inducen en las células del EPR la activación temprana y concatenada de la vía PLD y de la quinasa regulada por factores extracelulares (ERK1/2), la fosforilación del inhibidor de κB (IκB) y la activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB). La activación del NFκB inducida por la HG se correlacionó con el incremento en la expresión de los ARNm de interleuquinas (IL) proinflamatorias (IL-6, IL-8) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Finalmente, demostramos que en las células del EPR expuestas a HG los inhibidores farmacológicos de PLD1 (VU0359595) y de PLD2 (VU0285655-1) previenen la expresión de los mediadores proinflamatorios, la activación de la caspasa-3 y la reducción en la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en las células expuestas a LPS y al modelo de injuria inducida por HG demuestran que el rol de las PLD en las células del EPR difiere según cuál sea el origen de la injuria inflamatoria. Estos hallazgos indican la importancia de conocer los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR desencadenada por distintos estímulos. Nuestros resultados postulan a las isoformas clásicas de PLD como posibles dianas terapéuticas para distintas enfermedades inflamatorias de la retina. / Inflammation is a key factor in the pathogenesis of several retinal diseases that eventually end in vision loss and blindness, such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR), retinitis pigmentosa (RP) and uveitis. In this context, retinal pigment epithelial (RPE) cells are essential to maintain the integrity and function of the retina and it has been shown that, under these pathological conditions, RPE cells can mediate important immunological functions and actively participate in the inflammatory response. The main objective of this Ph. thesis was to elucidate the molecular mechanisms involved in the inflammatory response of the RPE. In particular, we wanted to study the role of the lipid messenger generating phospholipase D (PLD) pathway in two inflammatory injury models: i) induced by lipopolysaccharide (LPS) and ii) by high glucose (HG) concentrations, in order to simulate the typical hyperglycemia of diabetes. To this end, we used two human RPE cell lines: ARPE-19 and D407. Classical PLDs hydrolyze phosphatidylcholine (PC) to generate the lipid second messenger, phosphatidic acid (PA), and choline. PA can be further dephosphorylated by lipid phosphate phosphatases (LPP) in order to generate diacylglycerol (DAG), another lipid messenger. Thus, the PLD/LPP pathway can modulate the activity of DAG-responding proteins, such as protein kinases C (PKCs) and PA-responding proteins such as mTOR (mammalian target of rapamycin), among others. Previous results from our laboratory demonstrated the activation of the PLD pathway and the participation of classical PLD isoforms (PLD1 and PLD2) in the inflammatory response of RPE cells exposed to LPS. In the first chapter of this thesis, we studied the role of the PLD pathway in the activation of LPS-induced PKC signaling in RPE cells. We demonstrated that both PLDs are necessary for the activation of conventional PKC isoforms (PKCα/βII) while the activation of the novel PKCε is dependent only on PLD1. We also showed that PKCε mediates the survival of RPE cells exposed to LPS by promoting less activation of caspase-3 and increasing Bcl-2 expression and activation of Akt. In contrast, PKCα and β may not be involved in the cell viability loss induced by LPS. In conclusion, the PLD1-PKCε pathway mediates RPE cell survival by preventing apoptotic signals induced by LPS. In chapter II we characterized the model of cellular injury induced by HG. RPE cell exposure to HG induced reactive oxygen species (ROS) generation, caspase-3 activation and reduced mitochondrial functionality (cell viability parameter). We also demonstrated that in RPE cells high glucose levels induce the early and concatenated activation of the PLD pathway and of extracellular signal regulated kinase (ERK1/2), the phosphorylation of inhibitor of κB (IκB) and the activation of nuclear factor κB (NFκB). The activation NFκB induced by HG was found to correlate with the increased expression of proinflammatory interleukins (IL-6, IL-8) and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA. Finally, we demonstrated that in RPE cells exposed to HG pharmacologycal inhibitors of PLD1 (VU0359595) and PLD2 (VU0285655-1) prevent the expression of proinflammation mediators, the activation of caspase-3 and the reduction in cell viability. The results obtained in RPE cells exposed to LPS and in the model of cellular injury induced by HG demonstrate that the role of PLD isoforms in RPE cells differs depending on the origin of the inflammatory injury. These findings indicate the importance of knowing the molecular mechanisms involved in the RPE inflammatory response elicited by different stimuli. Our results postulate classical PLD isoforms as possible therapeutic targets for several retinal inflammatory diseases. / TEXTO PARCIAL en período de teletrabajo