Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory condition of unknown etiology for which there is no cure. It is one of the most disabling diseases and affects about 1% of the world‟s population. Recent developments in the field of molecular biology have resulted in the production of new drugs used in the treatment RA. Despite these advancements, achieving optimal disease control and prevention of disease progression is still difficult in many patients, leading to a continued search for treatment methods that will improve patient outcomes. Non-biologic forms of treatment that are still being investigated include the use of statins as an adjunct therapy due to their reported antiinflammatory effects. Some studies have shown that the use of statins in patients with RA help in reducing disease activity and swollen joint count in addition to lowering cardiovascular risk. As evidence continue to increase on the anti-inflammatory effect of statins, researchers have started investigating possible benefits that may result from the use of statins in treatment of RA, a chronic disease marked by high levels of systemic and local inflammation. This study investigated the anti-inflammatory effect of statins in rheumatoid arthritis patients with associated risks for cardiovascular disease, using simvastatin as the investigational product. Patients with moderately active RA despite being on maximum disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) therapy and having associated risks for cardiovascular disease were screened for the study. Eligible patients were randomized into two groups, 1 and 2. Patients in group 1 received simvastatin treatment (20mg/day) for a period of 3 months in addition to their usual DMARDs after which they stopped simvastatin treatment and were followed up for a further 3 months off simvastatin treatment. Those in group 2 were allowed to continue on their usual DMARDs without simvastatin treatment for the first 3 months of the study after which they received 20mg/day simvastatin for a period of 3 months in addition to their usual DMARDs. The anti-inflammatory effect of simvastatin was assessed by monitoring the inflammatory variables; erythrocyte sedimentation rate (ESR) and c-reactive protein (CRP) and disease activity in the two groups at screening, at the crossover point and at end of the study. Disease activity was significantly reduced with simvastatin treatment in the two groups. The mean change in disease activity score with simvastatin treatment was 1.30 (p = 0.01) in group 1 and 1.74 (p = 0.01) in group 2. ESR was significantly reduced with simvastatin treatment in group 1 with a mean change of 19.0 (p = 0.005) and marginally reduced in group 2 with a mean change 26.0 (p = 0.09). There was no significant change in CRP with simvastatin treatment in the two groups. The mean change in CRP with simvastatin treatment was 7.0 (p = 0.24) in group 1 and 14.7 (p =0.20) in group 2. All the patients benefited from the lipid-lowering effect of simvastatin. These findings suggest that statins may have mild anti-inflammatory properties and will be good adjuvant in RA patients with associated risks for cardiovascular disease. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Pharmacology / unrestricted

Eine Dysregulation neuro-immunologischer Interaktionen und eine veränderte Stressantwort werden als Teil der Pathogenese der Rheumatoiden Arthrtitis (RA) diskutiert. Dabei könnte eine autonome Dysfunktion eine wichtige Rolle spielen. Um dem nachzugehen, wurde an Patienten mit unterschiedlicher Krankheitsaktivität die Aktivität des autonomen Nervensystems in Ruhe und in Reaktion auf minor Stress sowie erstmals deren Assoziation zu Gen-Polymorphismen β2- adrenerger Rezeptoren (β2ARs), welche sich u.a. auf Immunzellen befinden, untersucht. Zur Bestimmung autonomer Aktivität wurde an 112 RA- und 48 Osteoarthrose-Patienten die sympathische Hautantwort (SSR) sowie die Herzratenvariabilität (HRV) getestet. Standardisierte Stresstests kamen zur Anwendung. Eine Allel-spezifische Polymerase-Ketten-Reaktion diente zur Ermittlung der Varianten des β2ARs an Aminosäureposition 16, 27 und 164. Es konnte gezeigt werden, dass die autonome Aktivität bei RA in Ruhe durch eine signifikant erhöhte Herzfrequenz, ein Überwiegen des Sympathikus im Verhältnis zum Parasympathikus sowie eine signifikant erniedrigte Parasympathikusaktivität gekennzeichnet ist. Die Stressantwort bei RA war signifikant häufiger pathologisch als bei der Kontrollgruppe und durch signifikante Hypoaktivität und Hyporeaktivität des Parasympathikus sowie eine signifikant erniedrigte HRV charakterisiert. Das Zusammenspiel beider Schenkel des ANS erschien gestört. Die SSR-Werte befanden sich im Normbereich. Schlechtere Werte waren jedoch signifikant mit hohem CRP assoziiert. Desweiteren war Heterozygotie an allen Gen-Positionen der β2ARs signifikant mit RA assoziiert. Gln27Gln (signifikant häufiger für Gesunde) ging mit signifikant niedrigerer Krankheitsaktivität einher. Starkes Überwiegen des SNS in Ruhe sowie niedrige parasympathische Aktivität (HRV-Daten) waren signifikant mit hoher Krankheitsaktivität assoziiert. Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit auf eine autonome Dysregulation bei Patienten mit RA hin, was mit klinischen Parametern der RA assoziiert war. Weiterhin unterstreicht die Studie die Assoziation von β2AR Polymorphismen mit einer RA und liefert einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankung.

Die Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung, die mit grundlegenden Veränderungen im CD4+ T-Zellpool einhergeht. Viele Studien konnten zeigen, dass die Gruppe der T-Helferzellen bei erkrankten Personen vermehrt Anzeichen von replikativer Seneszenz und das adaptive Immunsystem deutliche Zeichen der Immunoseneszenz aufweisen. Als zum Teil ursächlich hierfür konnte ein reduzierter Thymusoutput festgestellt werden. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, aufbauend auf Erkenntnissen von Six und Kollegen anhand einer Lymphozytenvorläuferzelle, die im peripheren Blut zirkuliert, in vivo in der Lage ist, den Thymus zu besiedeln und sich in reife T-Zellen zu entwickeln, den Thymusinput abzuschätzen, um eine defiziente Thymusbesiedlung als eventuelle Ursache des reduzierten Thymusoutput festzustellen. Hierzu wurde das Blut von 28 Patienten mit Rheumatoider Arthritis und altersentsprechenden gesunden Kontrollen mittels Durchflusszytometrie auf mehrere relevante reife T-Helferzellpopulationen, naive CD4+ T-Zellen und benannte lymphozytäre Vorläuferzelle untersucht. Es konnten dann direkte Vergleiche des prozentualen Anteils bestimmter T-Helferzellgruppen zwischen Erkrankten und Gesunden gezogen sowie Korrelationen verschiedener Zellgruppen untereinander hergestellt werden. Die gewonnenen Ergebnisse wurden mit der hierzu vorliegenden Literatur verglichen und diskutiert.:Abkürzungsverzeichnis Tabellen Abbildungen 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis 1.2. T-Zellen in der Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis 1.3. Die T-Zellgenese 1.3.1 Entwicklung im Knochenmark: von der hämatopoetischen Stammzelle zum common lymphoid progenitor (CLP) 1.3.2 Lymphoide Vorläuferzellen in der peripheren Zirkulation 1.3.3 Die Entwicklung von CD4+ und CD8+ einfach positiven T-Zellen im Thymus 1.4. Immunoseneszenz und das periphere CD4+ T-Zellkompartiment bei Rheumatoider Arthritis 2. Material und Methoden 2.1. Patientengut und gesunde Kontrollen 2.2.1. Gewinnung der PBMCs 2.2.2. Gewinnung der PBMCs für das CD31-Experiment 2.3. Immunzytologische Färbung 2.4. Etablierung der Färbeansätze 2.5. Messung am Durchflusszytometer 2.6. Auswertung der Messergebnisse der Durchflusszytometrie 2.6.1 Messungen 1 bis 4 2.6.2. Messung 5 2.6.3. Messung 6 2.7. Erfassung der klinischen Daten der Patienten 2.8. Statistische Auswertung der Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Beschreibung des CD4+ T-Zellkompartiments in der peripheren Zirkulation 3.1.1. CD4+CD8+ doppelt positive T-Lymphozyten in der peripheren Zirkulation 3.1.2. Frequenz CD4+ CD28 negativer T-Lymphozyten in der peripheren Zirkulation 3.1.3. Untersuchung der CD85j positiven T-Helferzellpopulation 3.1.4. CD4+CD25+ T-Zellen: aktivierte T-Helferzellen und T-regulatorische Zellen 3.1.5. Quantifizierung von naiven versus Memory-T-Helferzellen 3.2. Recent thymic emigrants: CD31+ thymic naive T-Zellen 3.3. Zirkulierende lymphoide Progenitoren 3.4. CD34 positive hämatopoetische Stammzelle 4. Diskussion 4.1. Das periphere CD4+ T-Zellkompartiment bei der RA 4.2. RA-Patienten weisen eine verringerte Anzahl von RTEs auf 4.3. Die Frequenz von Präthymozyten im peripheren Blut von RA-Patienten ist erhöht 5. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Eigenständigkeitserklärung Danksagung

Rheumatic diseases are common, usually chronic, painful and to some extent invalidating medical conditions. Understanding of the disease pathogenesis is still very fragmentary. Hyperreactivity of the immune system and defect of autotolerance are probably contributed by local factors, which helps to explain, why some joints/muscles are more affected than others. All this results from a complex net of interactions between immune cells, synovial fibroblasts, chondrocytes, osteocytes, myocytes and other cells. In the submitted PhD thesis I have focused on three groups of molecules: regulatory RNAs, S100 proteins and autoantibodies. In the theoretical part, I sum up the current knowledge on their biogenesis, function and the role in rheumatology. In the investigative part, I present six original publications and one review on the role of those molecules in development of rheumatoid arthritis (RA) and idiopathic inflammatory myositis (IIM). One of the main studies was focused on expression of PIWI-interacting RNAs (piRNAs) in RA synovial fibroblasts (SF). piRNAs are small regulatory RNAs which in complex with PIWIL proteins regulate gene expression and silence transpozoms. piRNA expression was considered to be limited to germline and cancer cells. We have found 267 PIWI-interacting RNAs to be expressed...

To determine whether the three Siegesbeckia plants can all serve as the origins of HS, we compared their fingerprint chromatograms and inhibitory effects on inflammatory mediators. Chemical analyses showed that the three species have different profiles, although they have common peaks in their fingerprint chromatograms. Hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) of the common peaks demonstrated that all samples of the three species tend to be species-dependently grouped and separated. Ten components contributing to the species discrimination were identified, of which 8 are long-chain fatty acids/esters, and 2 are darutoside and hythiemoside A. Inhibitory effects of the three species on NO production and IL-6 secretion in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages are different, with SG being the most and SP the least potent. These chemical and bioactivity assays support the notion that the three Siegesbeckia species cannot be equally used as the plant origins of HS.;This work provides a chemical and pharmacological basis for determining whether the three Siegesbeckia genus herbs SP, SO and SG can all serve as the origins of HS; and also provides pharmacological justifications for the clinical application of HS in treating inflammatory disorders.

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Rheumatic diseases are common, usually chronic, painful and to some extent invalidating medical conditions. Understanding of the disease pathogenesis is still very fragmentary. Hyperreactivity of the immune system and defect of autotolerance are probably contributed by local factors, which helps to explain, why some joints/muscles are more affected than others. All this results from a complex net of interactions between immune cells, synovial fibroblasts, chondrocytes, osteocytes, myocytes and other cells. In the submitted PhD thesis I have focused on three groups of molecules: regulatory RNAs, S100 proteins and autoantibodies. In the theoretical part, I sum up the current knowledge on their biogenesis, function and the role in rheumatology. In the investigative part, I present six original publications and one review on the role of those molecules in development of rheumatoid arthritis (RA) and idiopathic inflammatory myositis (IIM). One of the main studies was focused on expression of PIWI-interacting RNAs (piRNAs) in RA synovial fibroblasts (SF). piRNAs are small regulatory RNAs which in complex with PIWIL proteins regulate gene expression and silence transpozoms. piRNA expression was considered to be limited to germline and cancer cells. We have found 267 PIWI-interacting RNAs to be expressed...

Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Systemerkrankung des Bindegewebes mit autoimmunem Charakter. In dieser Studie wurden 7 Kandidatengene, welche in zentrale Abläufe der Apoptose involviert sind (CFLAR, XIAP, NFKB1, RELA, BCL2L1, FAS, FASLG), selektiert. Innerhalb dieser Gene wurden 23 Einzel-Basen-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms bzw. SNPs) sowie ein Insertions-Deletions-Polymorphismus in 300 französich-kaukasischen Individuen (100 RA-Trio-Familien) mittels Einzelbasenverlängerung (Single Base Extension bzw. SBE) in einer massenspektrometrischen Analyse durch MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization–Time Of Flight Mass Spectrometry) genotypisiert. Die Auswahl der zu untersuchenden genetischen Polymorphismen erfolgte dabei unter Berücksichtigung einer möglichen funktionellen Bedeutung, bekannter Assoziationen mit RA oder anderer Autoimmunerkrankungen, der Lage im Gen sowie der genetischen Variabilität. Die Ergebnisse der Genotypisierung wurden genutzt um die Polymorphismen bzw. Kandidatengene mit Hilfe verschiedener statistischer Methoden auf ihre Assoziation mit RA hin zu untersuchen. Die statistischen Analysen des SNPs CFLAR-rs7583529 zeigten hierbei einen nicht signifikanten Trend, wobei das minor Allel A gehäuft in RA Patienten vorkam. Das Ergebnis des Genotypen-Tests (Lathrop) für FAS-rs1800682 belegte einen protektiven Effekt für homozygote Träger des major Allels C (Lathrop pval = 0.045). Unterstützung für die gefundenen Trends bzw. Assoziationen von CFLAR-rs7583529 und FAS-rs1800682 boten Vergleiche mit Daten genomweiter Studien (NARAC/EIRA- und WTCCC-Studie). In den Assoziationsanalysen von BCL2L1-rs3181073 zeigte sich ein protektiver Effekt des minor Allels A (TDT pval = 0.008, OR = 0.51 [0.3 – 0.9], OR pval = 0.014). Der Risikoeffekt des major Allels C spiegelte sich entsprechend im Lathroptest wider, welcher eine signifikante Anreicherung des homozygoten C/C-Genotyps in den Fällen anzeigte (Lathrop pval = 0.021). Die gefundenen Assoziationen von FAS und BCL2L1 mit RA gehen mit der Hypothese konform, dass veränderte Abläufe sowohl im intrinsischen mitochondrialen (BCL2L1) als auch im extrinsischen (FAS) Weg der Apoptose in die Ätiologie der RA involviert sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollten in einer zweiten unabhängigen Kohorte repliziert werden. In Folgestudien wäre es ebenfalls interessant, weitere SNPs der Kandidatengene zu genotypisieren, um die genetische Variabilität anhand der Haplotypen genauer zu analysieren. Sollten sich die o. g. Assoziationen bestätigen, sind im Weiteren funktionelle Studien bezüglich unterschiedlicher Genexpression oder verändertem Apoptoseverhalten von Zellen oder synovialem Gewebe von großem Interesse. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory systemic disease of the connective tissue with autoimmune character. In this study, 7 candidate genes that are known to be involved in key processes of apoptosis (CFLAR, XIAP, NFKB1, REAL, Bcl2l1, FAS, FASLG) were selected. Within these genes, 23 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and one insertion/deletion polymorphism were genotyped in a sample of 300 French Caucasian individuals (100 RA trio families) by means of Single Base Extension (SBE) and MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization–Time Of Flight) mass spectrometry analysis. The possible functional significance, known associations with RA or other autoimmune diseases, the location in the gene and genetic variability were taken into account during the selection of genetic polymorphisms. The SNP genotyping results were used to analyse associations of polymorphisms or candidate genes with RA by applying various statistical methods. Analysis of the SNP CFLAR-rs7583529 showed a non-significant trend toward increased frequency of the minor allele A in RA patients. The genotypic test (Lathrop) of FAS-rs1800682 revealed a protective effect for homozygous carriers of major allele C (Lathrop pval = 0.045). Data of genome-wide studies (NARAC/EIRA- and WTCCC study) provided further support for association of CFLAR-rs7583529 and FAS-rs1800682 like confirmed in this study. Association analysis of Bcl2l1-rs3181073 showed a protective effect of the minor allele A (TDT pval = 0.008, OR = 0.51 [0.3 - 0.9], pval OR = 0.014). The genotypic Lathrop-test in turn revealed a corresponding risk effect for homozygous C/C genotype carriers (Lathrop pval = 0.021). Within this study, associations of the apoptosis genes FAS and Bcl2l1 with RA were found out. These results further indicate that changes of the intrinsic mitochondrial (Bcl2l1) and extrinsic (FAS) apoptosis pathway are possibly involved in the etiology of RA. For confirmation, results of this study should be replicated in a larger independent cohort. It would also be of interest to analyze the genetic variability based on specific haplotypes of additional SNPs within candidate genes. If the aforementioned associations are confirmed, functional studies with regard to different gene expression or changed apoptosis initiation in cells or synovial tissue would be of interest.

-:INHALTSVERZEICHNIS I BIBLIOGRAPHISCHE BESCHREIBUNG II REFERAT III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1 EINLEITUNG 5 1.1 Rheumatoide Arthritis 5 1.2 Stellenwert von Biomarkern bei Rheumatoider Arthritis 5 1.3 Massenspektrometrie 6 1.3.1 Einführung in die Massenspektrometrie 6 1.3.2 MALDI MS Imaging 7 1.3.2.1 Vorteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.2.2 Nachteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.3 Massenspektrometrie in der Arthritisforschung 9 1.4 Histopathologie bei Rheumatoider Arthritis 9 1.5 Potentielle Biomarker bei Rheumatoider Arthritis 10 1.6 Fragestellung 11 2 PUBLIKATIONSMANUSKRIPT 12 3 ZUSAMMENFASSUNG 17 4 LITERATURVERZEICHNIS 20 5 ANHANG 27 5.1 Selbständigkeitserklärung 27 5.2 Lebenslauf 28 5.3 Danksagungen 30

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