Monocytes are no longer regarded as a homogenous cell population but can be divided, both phenotypically and functionally, into different subsets. In rheumatoid arthritis, the subpopulation of CD14bright/CD16+ monocytes is expanded and prone towards generation of Th17 cells. CD56+ monocytes represent a different subpopulation, which is also expanded in conditions associated with autoimmunity like inflammatory bowel diseases. The aim of the study was the quantification and functional characterization of the CD56+ monocyte subset in rheumatoid arthritis (RA). The work at hand shows that the frequency of CD56+ monocytes is also expanded in RA; moreover, this subpopulation seems to increase with age in healthy controls. This age association is completely lost in patients suffering from RA. Further functional investigations could demonstrate a dysregulated cytokine response to lipopolysaccharide (LPS) with an increased production of pro-inflammatory cytokines like TNFα as well as an increased spontaneous reactive oxygen intermediate (ROI) production. A longitudinal treatment study using Etanercept as an established TNFα-blocking agent revealed a decrease of the frequency of that cell population under therapy. This decrease was more pronounced in patients with a good treatment response as judged by the reduction of the disease activity score (DAS) 28. Summing up those results, the CD56+ monocyte subset might be involved in immunosenescence as well as in the pathogenesis of RA.

Regensburg, Univ., Diss., 2001.

Die Republik Moldova, ein Anrainerstaat der EU, gilt als ärmstes Land Europas. Trotz vieler gesellschaftlicher Umbrüche und wirtschaftlicher Errungenschaften steht vor allem der Gesundheitssektor immer noch vor großen strukturellen Problemen. Um die Entwicklung im Bereich Rheumatologie zu unterstützen wurde 2011 das Projekt „Curriculare Modernisierung und bessere Versorgung von Rheumapatienten in der Republik Moldau“ ins Leben gerufen. Ein zentraler Punkt ist dabei die Implementierung einer einheitlichen Kerndokumentation für rheumatische Erkrankungen, wie sie als Vorbild schon seit vielen Jahren in Deutschland besteht. Bisher war noch wenig über die genaue Situation der Rheumaerkrankten in Moldova bekannt. Die Auswertung der Datenerhebungen aus dem Jahr 2012 und 2013 soll daher erste Erkenntnisse hinsichtlich der Versorgungssituation der Patienten liefern. Es wurden die Daten von insgesamt 842 Patienten erhoben. Dabei wurden sowohl von den Patienten selbst, als auch von den betreuenden Ärzten vor Ort Fragebögen ausgefüllt. Die Formulare lehnen sich an die deutschen Exemplare der Kerndokumentation an. Neben der körperlichen Untersuchung und Anamneseerhebung wurden auch laborchemische Parameter bestimmt. Es nahmen zwei großen Kliniken sowie neun niedergelassene Rheumatologen am Programm teil. Ausgewertet wurden neben Krankheitshäufigkeiten und demografischen Daten aller Erfassten, vor allem die Krankheitsaktivität, Therapielatenz, medikamentöse Therapie und Lebensqualität der an folgenden Erkrankungen leidenden Patienten: Rheumatoider Arthritis Spondylitis ankylosans Arthritis psoriatica Gicht Systemische Sklerose Systemischer Lupus erythematodes In der Auswertung fallen im Gegensatz zu Deutschland vor allem sehr hohe Krankheitsaktivitäten bei allen betrachten Gruppen auf. Das Therapieziel der Remission oder niedrigen Krankheitsaktivität wird kaum erreicht. Dabei werden die Patienten oftmals nicht leitliniengerecht behandelt. Eine wesentliche Ursache ist dabei die fehlende Möglichkeit der Therapieeskalation mittels Biologika, welche in den Jahren 2012 und 2013 in Moldova gar nicht verfügbar waren. Ein weiteres Problem ist der eingeschränkte Zugang zu Rheumatologen. Zum einen mangelt es im Land an Fachärzten, zum anderen bestehen infrastrukturelle Schwierigkeiten, die eine Vorstellung beim Arzt erschweren. Damit verzögert sich die Therapie oder sie kann nicht rechtzeitig angepasst werden. Die hohen Krankheitsaktivitäten, wie auch die meist lange Therapielatenz führen zu deutlichen Einschränkungen der Lebensqualität. Ursächlich sind dabei vor allem chronische Schmerzen und funktionelle Einschränkungen durch Gelenkdestruktionen. Für ältere Patienten führt dies vor allem zu einem Versorgungsproblem, unter jüngeren Betroffenen sinkt die Arbeitskraft und die Teilhabe am Berufsleben. Mithilfe der Untersuchung konnten erhebliche Probleme und Defizite bei der Versorgung der Erkrankten identifiziert werden. Auf Grund der erhobenen Daten können zukünftig Lösungsstrategien zur Verbesserung der Versorgungssituation erarbeitet werden.

Eine Dysregulation neuro-immunologischer Interaktionen und eine veränderte Stressantwort werden als Teil der Pathogenese der Rheumatoiden Arthrtitis (RA) diskutiert. Dabei könnte eine autonome Dysfunktion eine wichtige Rolle spielen. Um dem nachzugehen, wurde an Patienten mit unterschiedlicher Krankheitsaktivität die Aktivität des autonomen Nervensystems in Ruhe und in Reaktion auf minor Stress sowie erstmals deren Assoziation zu Gen-Polymorphismen β2- adrenerger Rezeptoren (β2ARs), welche sich u.a. auf Immunzellen befinden, untersucht. Zur Bestimmung autonomer Aktivität wurde an 112 RA- und 48 Osteoarthrose-Patienten die sympathische Hautantwort (SSR) sowie die Herzratenvariabilität (HRV) getestet. Standardisierte Stresstests kamen zur Anwendung. Eine Allel-spezifische Polymerase-Ketten-Reaktion diente zur Ermittlung der Varianten des β2ARs an Aminosäureposition 16, 27 und 164. Es konnte gezeigt werden, dass die autonome Aktivität bei RA in Ruhe durch eine signifikant erhöhte Herzfrequenz, ein Überwiegen des Sympathikus im Verhältnis zum Parasympathikus sowie eine signifikant erniedrigte Parasympathikusaktivität gekennzeichnet ist. Die Stressantwort bei RA war signifikant häufiger pathologisch als bei der Kontrollgruppe und durch signifikante Hypoaktivität und Hyporeaktivität des Parasympathikus sowie eine signifikant erniedrigte HRV charakterisiert. Das Zusammenspiel beider Schenkel des ANS erschien gestört. Die SSR-Werte befanden sich im Normbereich. Schlechtere Werte waren jedoch signifikant mit hohem CRP assoziiert. Desweiteren war Heterozygotie an allen Gen-Positionen der β2ARs signifikant mit RA assoziiert. Gln27Gln (signifikant häufiger für Gesunde) ging mit signifikant niedrigerer Krankheitsaktivität einher. Starkes Überwiegen des SNS in Ruhe sowie niedrige parasympathische Aktivität (HRV-Daten) waren signifikant mit hoher Krankheitsaktivität assoziiert. Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit auf eine autonome Dysregulation bei Patienten mit RA hin, was mit klinischen Parametern der RA assoziiert war. Weiterhin unterstreicht die Studie die Assoziation von β2AR Polymorphismen mit einer RA und liefert einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankung.

Die Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung, die mit grundlegenden Veränderungen im CD4+ T-Zellpool einhergeht. Viele Studien konnten zeigen, dass die Gruppe der T-Helferzellen bei erkrankten Personen vermehrt Anzeichen von replikativer Seneszenz und das adaptive Immunsystem deutliche Zeichen der Immunoseneszenz aufweisen. Als zum Teil ursächlich hierfür konnte ein reduzierter Thymusoutput festgestellt werden. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, aufbauend auf Erkenntnissen von Six und Kollegen anhand einer Lymphozytenvorläuferzelle, die im peripheren Blut zirkuliert, in vivo in der Lage ist, den Thymus zu besiedeln und sich in reife T-Zellen zu entwickeln, den Thymusinput abzuschätzen, um eine defiziente Thymusbesiedlung als eventuelle Ursache des reduzierten Thymusoutput festzustellen. Hierzu wurde das Blut von 28 Patienten mit Rheumatoider Arthritis und altersentsprechenden gesunden Kontrollen mittels Durchflusszytometrie auf mehrere relevante reife T-Helferzellpopulationen, naive CD4+ T-Zellen und benannte lymphozytäre Vorläuferzelle untersucht. Es konnten dann direkte Vergleiche des prozentualen Anteils bestimmter T-Helferzellgruppen zwischen Erkrankten und Gesunden gezogen sowie Korrelationen verschiedener Zellgruppen untereinander hergestellt werden. Die gewonnenen Ergebnisse wurden mit der hierzu vorliegenden Literatur verglichen und diskutiert.:Abkürzungsverzeichnis Tabellen Abbildungen 1. Einleitung 1.1. Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis 1.2. T-Zellen in der Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis 1.3. Die T-Zellgenese 1.3.1 Entwicklung im Knochenmark: von der hämatopoetischen Stammzelle zum common lymphoid progenitor (CLP) 1.3.2 Lymphoide Vorläuferzellen in der peripheren Zirkulation 1.3.3 Die Entwicklung von CD4+ und CD8+ einfach positiven T-Zellen im Thymus 1.4. Immunoseneszenz und das periphere CD4+ T-Zellkompartiment bei Rheumatoider Arthritis 2. Material und Methoden 2.1. Patientengut und gesunde Kontrollen 2.2.1. Gewinnung der PBMCs 2.2.2. Gewinnung der PBMCs für das CD31-Experiment 2.3. Immunzytologische Färbung 2.4. Etablierung der Färbeansätze 2.5. Messung am Durchflusszytometer 2.6. Auswertung der Messergebnisse der Durchflusszytometrie 2.6.1 Messungen 1 bis 4 2.6.2. Messung 5 2.6.3. Messung 6 2.7. Erfassung der klinischen Daten der Patienten 2.8. Statistische Auswertung der Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Beschreibung des CD4+ T-Zellkompartiments in der peripheren Zirkulation 3.1.1. CD4+CD8+ doppelt positive T-Lymphozyten in der peripheren Zirkulation 3.1.2. Frequenz CD4+ CD28 negativer T-Lymphozyten in der peripheren Zirkulation 3.1.3. Untersuchung der CD85j positiven T-Helferzellpopulation 3.1.4. CD4+CD25+ T-Zellen: aktivierte T-Helferzellen und T-regulatorische Zellen 3.1.5. Quantifizierung von naiven versus Memory-T-Helferzellen 3.2. Recent thymic emigrants: CD31+ thymic naive T-Zellen 3.3. Zirkulierende lymphoide Progenitoren 3.4. CD34 positive hämatopoetische Stammzelle 4. Diskussion 4.1. Das periphere CD4+ T-Zellkompartiment bei der RA 4.2. RA-Patienten weisen eine verringerte Anzahl von RTEs auf 4.3. Die Frequenz von Präthymozyten im peripheren Blut von RA-Patienten ist erhöht 5. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Eigenständigkeitserklärung Danksagung

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Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Systemerkrankung des Bindegewebes mit autoimmunem Charakter. In dieser Studie wurden 7 Kandidatengene, welche in zentrale Abläufe der Apoptose involviert sind (CFLAR, XIAP, NFKB1, RELA, BCL2L1, FAS, FASLG), selektiert. Innerhalb dieser Gene wurden 23 Einzel-Basen-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms bzw. SNPs) sowie ein Insertions-Deletions-Polymorphismus in 300 französich-kaukasischen Individuen (100 RA-Trio-Familien) mittels Einzelbasenverlängerung (Single Base Extension bzw. SBE) in einer massenspektrometrischen Analyse durch MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization–Time Of Flight Mass Spectrometry) genotypisiert. Die Auswahl der zu untersuchenden genetischen Polymorphismen erfolgte dabei unter Berücksichtigung einer möglichen funktionellen Bedeutung, bekannter Assoziationen mit RA oder anderer Autoimmunerkrankungen, der Lage im Gen sowie der genetischen Variabilität. Die Ergebnisse der Genotypisierung wurden genutzt um die Polymorphismen bzw. Kandidatengene mit Hilfe verschiedener statistischer Methoden auf ihre Assoziation mit RA hin zu untersuchen. Die statistischen Analysen des SNPs CFLAR-rs7583529 zeigten hierbei einen nicht signifikanten Trend, wobei das minor Allel A gehäuft in RA Patienten vorkam. Das Ergebnis des Genotypen-Tests (Lathrop) für FAS-rs1800682 belegte einen protektiven Effekt für homozygote Träger des major Allels C (Lathrop pval = 0.045). Unterstützung für die gefundenen Trends bzw. Assoziationen von CFLAR-rs7583529 und FAS-rs1800682 boten Vergleiche mit Daten genomweiter Studien (NARAC/EIRA- und WTCCC-Studie). In den Assoziationsanalysen von BCL2L1-rs3181073 zeigte sich ein protektiver Effekt des minor Allels A (TDT pval = 0.008, OR = 0.51 [0.3 – 0.9], OR pval = 0.014). Der Risikoeffekt des major Allels C spiegelte sich entsprechend im Lathroptest wider, welcher eine signifikante Anreicherung des homozygoten C/C-Genotyps in den Fällen anzeigte (Lathrop pval = 0.021). Die gefundenen Assoziationen von FAS und BCL2L1 mit RA gehen mit der Hypothese konform, dass veränderte Abläufe sowohl im intrinsischen mitochondrialen (BCL2L1) als auch im extrinsischen (FAS) Weg der Apoptose in die Ätiologie der RA involviert sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollten in einer zweiten unabhängigen Kohorte repliziert werden. In Folgestudien wäre es ebenfalls interessant, weitere SNPs der Kandidatengene zu genotypisieren, um die genetische Variabilität anhand der Haplotypen genauer zu analysieren. Sollten sich die o. g. Assoziationen bestätigen, sind im Weiteren funktionelle Studien bezüglich unterschiedlicher Genexpression oder verändertem Apoptoseverhalten von Zellen oder synovialem Gewebe von großem Interesse. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory systemic disease of the connective tissue with autoimmune character. In this study, 7 candidate genes that are known to be involved in key processes of apoptosis (CFLAR, XIAP, NFKB1, REAL, Bcl2l1, FAS, FASLG) were selected. Within these genes, 23 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and one insertion/deletion polymorphism were genotyped in a sample of 300 French Caucasian individuals (100 RA trio families) by means of Single Base Extension (SBE) and MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption /Ionization–Time Of Flight) mass spectrometry analysis. The possible functional significance, known associations with RA or other autoimmune diseases, the location in the gene and genetic variability were taken into account during the selection of genetic polymorphisms. The SNP genotyping results were used to analyse associations of polymorphisms or candidate genes with RA by applying various statistical methods. Analysis of the SNP CFLAR-rs7583529 showed a non-significant trend toward increased frequency of the minor allele A in RA patients. The genotypic test (Lathrop) of FAS-rs1800682 revealed a protective effect for homozygous carriers of major allele C (Lathrop pval = 0.045). Data of genome-wide studies (NARAC/EIRA- and WTCCC study) provided further support for association of CFLAR-rs7583529 and FAS-rs1800682 like confirmed in this study. Association analysis of Bcl2l1-rs3181073 showed a protective effect of the minor allele A (TDT pval = 0.008, OR = 0.51 [0.3 - 0.9], pval OR = 0.014). The genotypic Lathrop-test in turn revealed a corresponding risk effect for homozygous C/C genotype carriers (Lathrop pval = 0.021). Within this study, associations of the apoptosis genes FAS and Bcl2l1 with RA were found out. These results further indicate that changes of the intrinsic mitochondrial (Bcl2l1) and extrinsic (FAS) apoptosis pathway are possibly involved in the etiology of RA. For confirmation, results of this study should be replicated in a larger independent cohort. It would also be of interest to analyze the genetic variability based on specific haplotypes of additional SNPs within candidate genes. If the aforementioned associations are confirmed, functional studies with regard to different gene expression or changed apoptosis initiation in cells or synovial tissue would be of interest.

-:INHALTSVERZEICHNIS I BIBLIOGRAPHISCHE BESCHREIBUNG II REFERAT III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1 EINLEITUNG 5 1.1 Rheumatoide Arthritis 5 1.2 Stellenwert von Biomarkern bei Rheumatoider Arthritis 5 1.3 Massenspektrometrie 6 1.3.1 Einführung in die Massenspektrometrie 6 1.3.2 MALDI MS Imaging 7 1.3.2.1 Vorteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.2.2 Nachteile von MALDI MS Imaging 8 1.3.3 Massenspektrometrie in der Arthritisforschung 9 1.4 Histopathologie bei Rheumatoider Arthritis 9 1.5 Potentielle Biomarker bei Rheumatoider Arthritis 10 1.6 Fragestellung 11 2 PUBLIKATIONSMANUSKRIPT 12 3 ZUSAMMENFASSUNG 17 4 LITERATURVERZEICHNIS 20 5 ANHANG 27 5.1 Selbständigkeitserklärung 27 5.2 Lebenslauf 28 5.3 Danksagungen 30

Peripheral CD4CD8 double positive (DP) T cells have been reported to play a role in several autoimmune diseases, virus infections and cancer. In rheumatoid arthritis (RA), both CD4 and CD8 single positive (SP) T cells are known to be involved in the pathogenesis, but the role of peripheral CD4CD8 DP T cells has not been investigated in detail. Anti cyclic citrullinated antibodies (ACPA) positive and ACPA negative RA patients, patients with systemic lupus erythematodes (SLE) and age matched healthy donors (HD) were enrolled in the analysis. The frequencies and phenotype of DP T cells in PBMC were investigated. In addition, DP T cells were quantified in biopsies from rheumatoid synovium. After in vitro restimulation, the cytokine production of DP T cells was investigated in cultures of PBMC. CMV specific cytokine secretion as well as proliferation was analyzed following antigen specific restimulation after an appropriate culture duration. DP T cells were found more frequently in RA patients than in healthy controls or patients with SLE. These DP T cells express ab TCRs, are of a memory phenotype and share features of both CD4 as well as CD8 SP T cells. Importantly, DP T cells were found to also be present in the rheumatoid synovium. Further characterization of DP T cells from RA patients revealed increased production of IL-21 and IL-4, implying a possible role as T helper cells. In addition, DP T cells in RA seem to contribute to the inflammatory process, because they produce significantly more IFNc than counterparts from HD and are increased in CMV+ RA patients. Given their capacity to produce a variety of cytokines (IL4, IL21 and IFNc), their association with ACPA positive RA and their presence in the synovium, we suggest an important role of double positive T cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.

In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von IL-1β sowie der Inhibierung von Il-1β bzw. seines Rezeptors auf die regulatorischen T-Helfer-Zellen (Tregs) gesunder Probandinnen, JIA- und RA-Patientinnen untersucht. Der größte Einfluss von IL-1β zeigte sich bei den untersuchten Zellen der gesunden Probandinnen. Unter IL-1β Stimulation wurde der Treg-spezifische Transkriptionsfaktor FoxP3 signifikant vermindert von den regulatorischen T-Helfer-Zellen, den induzierten regulatorischen T-Helfer Zellen und den Nicht-Tregs der gesunden Probandinnen exprimiert. Ebenfalls zeigte sich ein nicht-signifikanter Trend für eine gesteigerte IL-17 Produktion unter IL-1β Stimulation bei den Tregs der gesunden Probandinnen, der JIA- und der RA-Patientinnen und bei den Nicht-Tregs der gesunden Probandinnen. Dies war bei der IL-1β Inhibierung bzw. der Inhibierung des IL-1 Rezeptors nicht zu beobachten. / In this work, the influence of IL-1β or the inhibition of IL-1β or its receptor on regulatory T helper cells (Tregs) of healthy donors, JIA- or RA-patients was analysed. The biggest effect of IL-1β was observed in cells of healthy donors. After stimulation with IL-1β, expression of the Treg-specific transcription factor FoxP3 was significantly reduced in regulatory T cells, induced regulatory T cells and non-regulatory T cells of healthy donors. Also, a non-significant trend towards increased IL-17 production was found in Tregs of healthy donors, JIA- and RA-patients after IL-1β stimulation. This was not observed after inhibition of IL-1β or the IL-1β receptor.