Thesis (M.Sc.)--York University, 2004. Graduate Programme in Biology. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 87-115). Also available on the Internet. MODE OF ACCESS via web browser by entering the following URL: LINK NOT YET AVAILABLE.

Thesis (M. Sc.)--York University, 2001. Graduate Programme in Biology. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 128-145). Also available on the Internet. MODE OF ACCESS via web browser by entering the following URL: http://wwwlib.umi.com/cr/yorku/fullcit?pMQ66409.

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Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-23T18:34:17Z No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-23T18:34:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 livia_a_uehara_ioc_bcm_0025_2010.pdf: 1818827 bytes, checksum: 724191daedddb70c3dec8a0449f18b96 (MD5) Previous issue date: 2010 / instituro / A cruzipaína é a cisteína peptidase mais abundante do Trypanosoma cruzi, o qual é o agente etiológico da doença de Chagas. A cruzipaína é um importante fator de virulência do T. cruzi envolvida em várias etapas cruciais na interação com células de mamíferos. Essa enzima é expressa em níveis variáveis em todas as formas evolutivas e cepas do parasito, sendo abundantemente expressa nas formas epimastigotas, encontradas apenas no inseto vetor. Esse dado nos levou a investigar se a cruzipaína poderia estar envolvida na interação do T. cruzi com células do hospedeiro invertebrado. Para tal, foram analisados os efeitos do pré-tratamento do T. cruzi com um painel de diferentes inibidores de cisteína peptidases ou anticorpos anti-cruzipaína na adesão do parasito ao epitélio intestinal médio posterior dissecado de Rhodnius prolixus. Paralelamente, foi analisado o índice de adesão ao epitélio do T. cruzi que superexpressa a chagasina (pCHAG), um inibidor endógeno da cruzipaína. A taxa de adesão dos parasitos tratados com os inibidores de cisteína peptidase (iodoacetamida, leupeptina, antipaína ou E-64 a 10 µM, ou cistatina a 1 µg/mL) foi em média 70% inferior em comparação aos parasitos não tratados, com exceção do Ca074me (um inibidor de catepsina B) que não mostrou alteração significativa. O tratamento de parasitos com a cistatina apresentou um efeito dose-dependente sobre a taxa de adesão em relação aos parasitos não tratados. Além disso, o tratamento de epimastigotas com anticorpos anti-cruzipaína (1:1000) induziu uma redução significativa de 64% na adesão. Os parasitos pCHAG apresentaram baixa capacidade de ligação ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus, enquanto o pTEX ( plasmídeo sem o gene inserido) não apresentou mudanças significativas na taxa de adesão em relação ao controle. Nós também comparamos a habilidade de vários isolados de T. cruzi na adesão ao intestino do R. prolixus. A cepa G, que naturalmente apresenta baixíssimos níveis de cruzipaína ativa, apresentou baixa capacidade de interação em comparação às cepas Dm28c, Y e CL Brener. Os intestinos pré-tratados com cruzipaína ativa não produziram uma redução significativa no índice de adesão às células epiteliais do inseto vetor em relação ao controle indicando que o envolvimento da cruzipaína no processo de interação é independente de interação ligante-receptor. A cruzipaína ativa na concentração de 1,5 µg/µL restaurou parcialmente (30%) o nível de adesão do T. cruzi pCHAG ao epitélio intestinal dissecado de R. prolixus em relação a parasitos pCHAG. Ensaios de colonização in vivo revelaram que parasitos pCHAG são virtualmente incapazes de colonizar a ampola retal de R. prolixus. Além disso, a expressão da cruzipaína em células de T. cruzi teve um aumento drástico após a passagem em R. prolixus. Coletivamente, nossos resultados sugerem que a cruzipaína participa ativamente da interação entre T. cruzi e células epiteliais do hospedeiro invertebrado, através de um mecansimo distinto ao de ligante-receptor. / Cruzipain is the most abundant cysteine peptidase of Trypanosoma cruzi, which is the causative agent of Chagas’ disease. The cruzipain is an important virulence factor of T. cruzi, involved in several crucial steps in the interaction with mammalian cells. This enzyme is expressed at variable levels in all developmental forms and strains of the parasite, being abundantly expressed in epimastigotes forms, found only in the insect vector. This finding led us to investigate whether cruzipain could be involved in the interaction of T. cruzi with invertebrate host cells. To this end, we have analyzed the effects of the treatment of T. cruzi with a panel of different cysteine peptidase inhibitors or anti-cruzipain antibodies on the parasite adhesion to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut. In parallel, we have analyzed the adhesion rate of T. cruzi that superexpresses chagasin (pCHAG), an endogenous cruzipain inhibitor. The adhesion rate of parasites treated with cysteine peptidase inhibitors (iodoacetamide, leupeptin, antipain or E-64 at 10 µM or cystatin at 1 µg/mL) was, in average, 70% lower compared to untreated parasites, except for Ca074me (an inhibitor of cathepsin B) that showed no significant change. Parasites treated with cystatin showed a dose-dependent effect. Furthermore, epimastigotes treated with anti-cruzipain (1:1000) presented a significant reduction of 64% in adhesion. pCHAG parasites showed low ability to bind to intestinal epithelium. We also compared the ability of several T. cruzi isolates to adhere to R. prolixus. The G strain, which naturally possesses low levels of active cruzipain, adhered to a lesser extent in comparison to Dm28c, Y and CL Brener strains. The intestines pre-treated with active cruzipain did not produce a significant reduction in the adhesion rate to epithelial cells of the insect vector as compared to control, suggesting that the involvement of cruzipain in the interaction process is independent of a ligant-receptor interaction. The active cruzipain at 1,5 µg/µL partially restored (30%) the adherence level of T. cruzi pCHAG to Rhodnius prolixus posterior dissected midgut in comparsion to pCHAG parasites. In vivo infection assays, revealed that pCHAG parasites were virtually unable to colonize R. prolixus rectum. Furthermore, the expression of surface cruzipain in T. cruzi cells was drastically enhanced after the passage in R. prolixus. Collectively, these results suggest that cruzipain mediates actively the interaction between T. cruzi and epithelial cells of the invertebrate host through a distint mechanism of the ligant-receptor.

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Ureases são enzimas que catalisam a hidrólise de ureia para formar amônia e dióxido carbono, sendo produzidas por plantas, fungos e bactérias. A toxina de estudo, Jaburetox, é um peptídeo recombinante derivado de uma das isoformas de urease presentes em Canavalia ensiformis. Esta molécula mostrou toxicidade a insetos de diferentes ordens quando administrada oralmente ou por injeção e, além disso, apresenta atividades antifúngica e bacteriostática, não exibindo efeitos tóxicos para mamíferos, demonstrando um enorme potencial biotecnológico. Em estudos realizados com Rhodnius prolixus, um dos principais vetores da Doença de Chagas na América Latina, observamos que o Jaburetox é capaz de interagir com hemócitos, células do sistema imune. Concomitante a esta interação, também demonstramos que o peptídeo é capaz de induzir a agregação de hemócitos, característica da resposta celular, e também é capaz de aumentar a atividade da fenoloxidase (PO), enzima envolvida na resposta humoral dos insetos. Estes efeitos sugerem que o peptídeo é capaz de ativar o sistema imune dos insetos. Os insetos apresentam somente imunidade inata, sendo esta subdividida em resposta celular e humoral. A resposta celular, mediada por hemócitos, é caracterizada pela fagocitose, agregação e encapsulação de patógenos. Em contraste, a resposta humoral é representada pela produção de peptídeos antimicrobianos, melanização desencadeada pela enzima PO e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Recentemente, outro mecanismo de resposta imune inata tem sido estudado: as armadilhas extracelulares - Extracellular Traps (ETs), sendo bem caracterizadas em mamíferos, porém pouco estudadas em insetos. As ETs são armadilhas de ácidos nucleicos extracelulares associados a proteínas citoplasmáticas, que podem auxiliar na captura e na morte de patógenos. Essa resposta é desencadeada por receptores extracelulares de células granulares que induzem o aumento de Ca2+ intracelular, levando à produção de ROS, que parece ser parte fundamental para liberação dos ácidos nucleicos, permitindo com que estes passem para o citoplasma e associem-se com as proteínas. O presente estudo tem como objetivo avaliar o papel de ácidos nucleicos extracelulares na resposta imune e na proteção contra o peptídeo entomotóxico Jaburetox. As respostas imunológicas foram avaliadas por meio da contagem de agregados, através de hemocitômetro, e por ensaio colorimétrico para dosar alterações da resposta humoral, 6 e 18 h após injeção de Jaburetox e/ou RNA extracelular (RNAet). A liberação de RNA e DNA foi avaliada 6 h pós injeção de tratamentos para ensaios in vivo e 1 h pós incubação para ensaios in vitro, através do kit Qubit RNA HS e Qubit dsDNA HS. Para avaliar a liberação de ROS e viabilidade celular, realizamos culturas de hemócitos, que foram tratados por 24 h com Jaburetox. Por fim, avaliamos a imunocompetência dos insetos após tratamentos com Jaburetox, RNAet ou Jaburetox + RNAet e desafiamos o inseto contra uma bactéria patogênica. A hemolinfa dos insetos foi coletada e unidades formadoras de colônia foram mensuradas pelo método de drop-plate. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o RNAet é capaz de ativar as defesas do organismo, tanto celular quanto humoral e, quando associado à toxina, apresentam um efeito protetor. Jaburetox não foi capaz de induzir alterações na liberação de ácidos nucleicos em nenhuma das abordagens, mas modificou a liberação de ROS na dose de 6 M. A viabilidade celular não foi alterada em nenhuma das condições testadas. Nos ensaios de imunocompetência, observamos que o peptídeo modula a resposta do organismo, deixando-o mais susceptível a infecções. Os tratamentos com RNAet desencadeiam uma resposta protetora. Nossos dados sugerem que o RNAet modula as defesas do organismo de forma benéfica para combater patógenos, enquanto que o Jaburetox, nas condições testadas, não induz resposta imune através de ETs, mas torna o inseto mais susceptível a infecções por patógenos. Os presentes achados enfatizam a importância dos ácidos nucleicos extracelulares para as defesas imunológicas em insetos. Também elucidamos os efeitos desencadeados pelo peptídeo, aprimorando os conhecimentos referentes a esta toxina, enfatizando o potencial uso deste composto como um bioinseticida. / Ureases are enzymes that catalyze the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide, being produced by plants, fungi and bacteria. The studied toxin, Jaburetox, is a recombinant peptide derived from one of the urease isoforms present in Canavalia ensiformis. This molecule showed toxicity to insects of different orders when administered orally or by injection and, in addition, presents antifungal and bacteriostatic activities, not exhibiting toxic effects to mammals, demonstrating an enormous biotechnological potential. Studies with Rhodnius prolixus, one of the main vectors of Chagas' disease in Latin America, have shown that Jaburetox is capable of interacting with hemocytes, the cells of the immune system. Concomitant with this interaction, we also demonstrated that the peptide induces hemocyte aggregation, a characteristic of the cellular response, and is also capable of increasing the activity of phenoloxidase (PO), an enzyme involved in the humoral response in insects. These effects suggest that the peptide is able of activating the insect immune system. Insects present only innate immunity, which is subdivided into cellular and humoral responses. The cellular response, mediated by hemocytes, is characterized by phagocytosis, aggregation and encapsulation of pathogens. In contrast, the humoral response is represented by the production of antimicrobial peptides, melanization triggered by the PO enzyme and the production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). Recently, another mechanism of innate immune response has been studied: the Extracellular Traps (ETs), being well characterized in mammals, but little studied in insects. ETs consist of extracellular nucleic acids associated with cytoplasmic proteins that may aid in the capture and killing of pathogens. This response is triggered by extracellular granular cell receptors that induce the increase of intracellular Ca2+, leading to the production of ROS, which appear to play a key role in the release of nucleic acids, allowing them to pass into the cytoplasm and associate with proteins. The present study aims to evaluate the role of extracellular nucleic acids in the immune response and protection against the entomotoxic peptide Jaburetox. Immunological responses were evaluated by means of hemocytometer counting and by colorimetric assays to measure changes in the humoral response, 6 and 18 h after injection of Jaburetox and/or extracellular RNA (RNAet). The release of RNA and DNA was evaluated 6 h post injection of treatments for in vivo assays and 1 h post incubation for in vitro assays, using the Qubit RNA HS and Qubit dsDNA HS kits. In order to evaluate the release of ROS and 14 the cell viability, hemocyte cultures were treated for 24 h with Jaburetox. Finally, the immunocompetence was evaluated after treatment with Jaburetox, RNAet or Jaburetox + RNAet and challenging the insects with a pathogenic bacterium. Hemolymph of the insects was collected and colony forming units were measured by the drop-plate method. The results obtained in this work indicated that RNAet is able to activate the organism defenses, both cellular and humoral, and displays a protective effect when associated with the toxin. Jaburetox was not able to induce changes in the release of nucleic acids in any of the approaches, but modified the release of ROS at the dose of 6 μM. Cell viability was not altered in any of the conditions tested. In the immunocompetence assays, we observed that the peptide modulates response of the organism, making it more susceptible to infections. RNAet treatments elicit a protective response. Our data suggest that RNAet modulates the insect defenses in a beneficial way to fight pathogens, while Jaburetox, in the conditions tested, does not induce an immune response through ETs, but makes the insect more susceptible to pathogen infections. The present findings emphasize the importance of extracellular nucleic acids for immune defenses in insects. We also elucidate the effects triggered by the peptide, improving the knowledge regarding this toxin, reinforcing its potential use as a bioinsecticide.

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Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Resumo: Os membros da subfamília Triatominae são vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Eles compreendem 144 espécies agrupadas em 18 gêneros e são encontrados principalmente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Essencialmente a identificação desses insetos tem sido baseada na descrição comparativa da morfologia de indivíduos adultos incluindo as estruturas da genitália masculina e feminina, aspectos gerais do corpo como cabeça, tórax, antena e coloração, entre outros. Entretanto a distinção por critérios morfológicos apresenta limitações para caracterização de espécies do gênero Rhodnius devido às semelhança entre elas, especialmente entre R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, espécies conhecidas como "grupo prolixus". Nesse estudo as técnicas de biologia molecular, sequenciamento do gene 16S e PCR-RFLP, foram utilizados para caracterização de sete espécies de Rhodnius. Os produtos do sequenciamento do gene 16S das espécies R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, e R. sp geraram alinhamento de 380 pares de bases com 48 sítios polimórficos. A visualização das bandas geradas pelas enzimas de restrição BstUI, HhaI, RsaI and Mbol com as sete amostras de Rhodnius possibilitou distingui-las com exceção de R. prolixus, R. neglectus e R.robustus. Os dois métodos feitos para as mesmas amostras confirmaram a validade da utilização do método PCR-RFLP para identificação de R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, uma vez que o gene 16S já é um marcador estabelecido para as espécies de Rhodnius e as duas metodologias apresentaram os mesmos resultados, confirmaram também o trabalho realizado por Naegele et al. 2006 em que a técnica de PCR-RFLP distinguiu R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Abstract: The members of the subfamily Triatominae are vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, which is the etiologic agent of Chagas disease. They consist of 144 species grouped into 18 genera and are found mainly in the Americas, from the southern United States to southern Argentina and Chile. Essentialy, the identification of these insects has been based on the comparative description of the morphology of adult specimens, including the structures of both the male and female genitalia, general body features like head, thorax, antennae and color, among others. However, this method is not particularly useful in the characterization of species belonging to the genus Rhodnius because they are very similar morphologically, specially R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, which are known as "prolixus complex". In this study molecular biology techniques, such as sequencing of 16S gene and PCR-RFLP, was used to contribute to the characterization of seven species of Rhodnius. The products of the sequencing of the 16S species R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, and R. sp generated a alingment of 380bp with 48 polymorphic sites. The visualization of the bands arising from the use of restriction enzymes BstUI, HhaI, RsaI and Mbol with samples of seven species of Rhodnius possible to distinguish them except for R. prolixus, R. neglectus and R.robustus. The two methods performed in parallel for the same samples confirmed the validity of using the enzymatic method for specific identification of R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, since the 16S gene is already an established marker for it and the two methods showed the same results, confirmed too the work performed by Naegele et al.2006 that the PCR-RFLP technic distinguished R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / Mestre

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Embora os insetos sejam essenciais para a vida na Terra, alguns afetam negativamente a sociedade humana atuando como vetores de doenças, como por exemplo a doença de Chagas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, no Brasil, o método mais eficaz para prevenir a propagação do agente etiológico, Trypanosoma cruzi, é por controle vetorial. Rhodnius prolixus é um importante vetor de doença de Chagas no Brasil. Como outros insetos, seu comportamento depende de semioquímicos percebidos por um sistema olfativo sofisticado. As proteínas que realizam a comunicação entre ambiente externo e os receptores de odorantes são chamadas de proteínas ligadoras ao odorante (Odorant Binding Protein, OBPs), e são proteínas solúveis, extracelulares e pequenas (15-17 kDa). Visando aumentar o conhecimento sobre essas proteínas para possivelmente desenvolver estratégias de manipulação comportamental de R. prolixus, foram selecionados três genes putativos de OBPs, RproOBP 8, 11 e 19. Os genes foram selecionados através de ferramentas de bioinformática e foram clonados e expressos em diferentes vetores linhagens celulares de Escherichia coli. A proteína recombinante RproOBP 8 e 11 foram expressas em E. coli BL21(DE3). A RproOBP 19 obteve os melhores resultados quando expressa em E. coli BL21(DE3)pLysS. As proteínas recombinantes foram estudadas usando Espalhamento Dinâmico da Luz (DLS), cujos resultados sugeriram melhores soluções tamponantes para trabalhar e armazenar essas proteínas. Esses tampões também foram utilizados para rastrear as condições de cristalização. Embora não tenham sido obtidos cristais para serem usados em coleta de dados de difração de raios X, algumas condições se mostraram promissoras para serem refinadas posteriormente. A RproOBP11 apresentou uma cor vermelha quando purificada. O espectro de UV-Visível mostra um máximo de absorção em 413 nm, o que sugere a presença de um grupo heme no estado oxidado. Os espectros obtidos por Dicroísmo Circular (CD) para a RproOBP11, caracterizam uma proteína rica em α- hélice devido aos picos negativos em 208 e 222 nm. Na presença de 5 possíveis ligantes: pentanol, hexanol, heptanol, octenol e octanol, os espectros de CD não mostraram mudança, podendo representar falta de interação ou interações fracas. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) foi realizada com os mesmos compostos, nenhum deles mostrou interação com a RproOBP11 em tampão 20 mM fosfato pH 7,0. Os mesmos resultados de ITC foram obtidos para o RproOBP19 em tampão 20 mM HEPES pH 7,0. Os resultados do CD sugerirem que o RproOBP19 é uma proteína com regiões intrinsecamente desordenadas. Quando os espectros de CD foram obtidos na presença de TFE a RproOBP19 apresenta espectro mais semelhante às proteínas de α- hélice. Estes resultados representam a primeira investigação molecular de OBPs de R. prolixus. Testes adicionais são necessários para descobrir a estrutura e função dessas OBPs e assim, realizar uma abordagem direcionada do controle vetorial e a possibilidade de usar essas pequenas proteínas como ferramentas biotecnológicas. / Although insects are essential to life on earth, some can affect negatively human society acting as vectors of diseases. One of those is Chagas disease. According to the World Health Organization, in Brazil the most effective method to prevent the spread of the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, is by vector control. Rhodnius prolixus is important Chagas disease vector in Brazil. It is a blood-feeding triatomine whose behavior, like other insects, originally depends of signals given by the environment as semiochemicals perceived by a sophisticated olfactory system. The proteins that perform the communication between external environment and the odorant receptors are called Odorant Binding Proteins (OBPs), and are soluble, extracellular and small proteins (15-17 kDa). Aiming to increase knowledge about these proteins to possibly develop strategies for behavioral manipulation of R. prolixus , three putative OBP genes, RproOBP 8, 11 and 19, were selected. The genes were selected using bioinformatics tools and were cloned and expressed in different vectors of Escherichia coli cell lines. Recombinant protein RproOBP 8 and 11 were expressed in E. coli BL21(DE3). RproOBP 19 obtained the best results when expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS. Recombinant proteins were studied using Dynamic Light Scattering (DLS), whose results suggested better buffering solutions for working and storing conditions. Such buffers were also used to track crystallization conditions. Although no crystals have been obtained for use in X-ray diffraction data collection, some conditions have proved promising for further refinement. RproOBP 11 showed a red color when purified. The UV-Visible spectrum shows a maximum absorption at 413 nm, which suggests the presence of a heme group in the oxidized state. The spectra obtained by Circular Dicroism (CD) for RproOBP11, characterize an α-helix rich protein due to negative peaks at 208 and 222 nm. In the presence of 5 possible ligands: pentanol, hexanol, heptanol, octenol and octanol, the CD spectra did not show change, being able to represent lack of interaction or weak interactions. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) was performed with the same compounds, none of them showed interaction with RproOBP 11 in 20 mM phosphate buffer pH 7.0. The same ITC results were obtained for RproOBP19 in 20 mM HEPES buffer pH 7.0. CD results suggest that RproOBP19 is a protein with intrinsically disordered regions. When CD spectra were obtained in the presence of TFE RproOBP19 presents a spectrum more similar to the α-helix proteins. These results represent the first molecular investigation of OBPs of R. prolixus. Further tests are needed to uncover the structure of these OBPs and provide insight into the function allowing a more targeted approach of vector control and the possibility to use such small proteins as biotechnological tools.