Potomac Horse Fever (PHF) is a disease of great concern to many horse owners in the Potomac River area of Maryland and Virginia. It is caused by a rickettsia, Ehrlichia risticii. The involvement of an arthropod vector has been suspected because of the seasonal epidemiology of the disease. This research was an attempt to identify and evaluate potential arthropod vectors. A seasonal activity study of biting arthropods attacking horses in endemic areas of Maryland and Virginia identified five potential vectors: (1) Simulium jenningsi (Diptera: Simuliidae), (2) Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae), (3) Culicoides obsoletus (Diptera: Ceratopogonidae), (4) C. variipennis, and (5) Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae). These five arthropod species were given status as potential vectors because they were collected feeding on horses just prior to and throughout the PHF season. Simulium jenningsi and D. variabilis have the closest seasonal association with the occurrence of PHF as presented in this study. D. variabilis was determined to have the greatest potential due to its reported association with other rickettsial diseases. A series of laboratory and field studies were designed to examine the potential role of D. variabilis in the transmission of E. risticii. We first attempted to transmit E. risticii by feeding adult D. variabilis collected from an endemic farm on susceptible horses. Other laboratory studies included mouse to horse and mouse to mouse transmission attempts using ticks fed on mice inoculated with E. risticii. A serological survey of 105 trapped field rodents (host of immature D. variabilis) on endemic farms in Maryland showed all specimens collected to be negative for PHF antibodies. These studies and others gave no indication of D. variabilis's involvement in the transmission of the disease in nature. The other species mentioned above were not examined. / Ph. D.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T13:08:10Z No. of bitstreams: 1 Maria Fernanda Melo Monteiro.pdf: 639501 bytes, checksum: 8ac4c3c948754bb276d69058aaf30f8b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Fernanda Melo Monteiro.pdf: 639501 bytes, checksum: 8ac4c3c948754bb276d69058aaf30f8b (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Rickettsial diseases are zoonotic infections caused by gram-negative bacteria of the family Rickettsiaceae which are transmitted by several ectoparasites such as ticks belonging to the genus Amblymomma, however, the species Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) and Ctenocephalides felis felis have been reported as potential vectors.The aim of this study was to detect Rickettsia spp. DNA in R. sanguineus s.l. and C. felis felis through molecular examination (Polymerase Chain Reaction PCR). A total of 728 ectoparasites were collected of 155 dogs from the states of Pernambuco (municipalities of Recife and Bezerros) and Alagoas (municipalities of Viçosa and Arapiraca) were used in this study. All specimens were morphologically identified (R. sanguineus s.l. and C. felis felis), separated in pools (n = 3) and analyzed molecularly through PCR. Out of the 136 pools of R. sanguineus s.l. analyzed, 20.58% (28/136) and 80 pools of C. felis felis analyzed 31.20% (39/80) it was observed amplification fragment of 401 bp compatible with Rickettsia spp. In relation to the positivity of ectoparasites in the municipalities studied, it was observed that R. sanguineus s.l. was positive in the Metropolitan Area of Recife (20.49%) and Bezerros (22.22%), however in the state of Alagoas was not observed the positivity for Viçosa municipality, but, Arapiraca got 25% positive. With regard to C. felis felis it was observed that in Pernambuco 54.54% of samples were positive being derived from Metropolitan Area of Recife, while Bezerros municipality was not observed amplification of the fragment compatible with Rickettsia spp. In Alagoas, it was observed 12.50% of positivity for Arapiraca and 50.00% for Viçosa. This study reports, for the first time, the detection of Rickettsia spp. in R. sanguineus s.l. parasitizing dogs from the state of Pernambuco and R. sanguineus s.l. and C. felis felis parasitizing dogs from the state of Alagoas. Although there are no reports of Brazilian Spotted Fever (BSF) in the areas studied, the presence of infected ticks and fleas suggests the circulation of the pathogen between vertebrate hosts and vectors. / As riquetsioses são doenças zoonóticas causadas por bactérias gram-negativas da família Rickettsiaceae sendo transmitidas por diversos ectoparasitos, destacando-se os carrapatos do gênero Amblymomma, entretanto, as espécies Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) e Ctenocephalides felis felis vêm sendo relatadas como vetores em potencial. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi diagnosticar a infecção por Rickettsia spp. em R. sanguineus s.l. e C. felis felis através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Para tanto foram coletados 728 ectoparasitos de 155 cães de dois municípios do estado de Pernambuco (Recife e Bezerros) e de dois municípios do estado de Alagoas (Viçosa e Arapiraca). Todos os espécimes foram identificados morfologicamente (R. sanguineus s.l. e C. felis felis), sendo separados em pools (n = 3) e analisados através da PCR. Dos 136 pools de R. sanguineus s.l. analisados 20,58% (28/136) e dos 80 pools de C. felis felis analisadas 31,20% (39/80) foi observado amplificação de fragmento de 401 pb compatíveis com Rickettsia spp. Em relação à positividade dos ectoparasitos nos municípios estudados, observou-se que R. sanguineus s.l. foi positivo na Região Metropolitana do Recife (20,49%) e em Bezerros (22,22%), entretanto, no estado de Alagoas não foi observada positividade para o município de Viçosa, porém, Arapiraca obteve 25% de positividade. Em relação à C. felis felis observou-se que em Pernambuco 54,54% das amostras foram positivas sendo elas procedentes da Região Metropolitana do Recife, enquanto que no município de Bezerros não foi observada amplificação do fragmento compatível com Rickettsia spp. Já em Alagoas observou-se positividade de 12,50% para Arapiraca e 50,00% para Viçosa. Este estudo reporta pela primeira vez a detecção de Rickettsia spp. em R. sanguineus s.l. parasitando cães provenientes do estado de Pernambuco e R. sanguineus s.l. e C. felis felis parasitando cães provenientes do estado de Alagoas. Apesar de não existirem relatos de Febre Maculosa Brasileira (FMB) nas regiões estudadas, a presença de carrapatos e pulgas infectados sugere a circulação do patógeno entre hospedeiros vertebrados e vetores.

Neste projeto, objetivou-se o diagnóstico de riquétsias, utilizando metodologia molecular, em material de humanos, carrapatos, pulgas, cães e equinos de áreas endêmicas dos estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ). Diagnosticou-se Rickettsia rickettsii infectando Amblyomma cajennense e humanos no estado de SP, indicando ser esta a única espécie responsável pela doença. Rickettsia conorii foi diagnosticada em um paciente procedente de Portugal. No estado do RJ, Rickettsia felis foi detectada Ctenocephalides felis e em Am. cajennense enquanto que R. rickettsii em Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis e Rhipicephalus sanguineus. As frequências mínimas de vetores infectados do estado do RJ apresentaram valores superiores àqueles registrados em outras regiões do país. Demonstrou-se, de forma inédita, o envolvimento de algumas destas espécies no ciclo da bactéria. R. rickettsii foi diagnosticada em cães e equinos indicando a importância dos animais domésticos na manutenção do ciclo da riquetsiose. / This project aimed to diagnose rickettsial diseases using molecular analysis methods on human, tick, flea, dog and horse samples from endemic areas in the States of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ). A diagnosis of Rickettsia rickettsii infecting Amblyomma cajennense and humans in the State of SP was made, indicating that this is the only species responsible for the disease. Rickettsia conorii was diagnosed in a patient from Portugal. In RJ, Rickettsia felis was detected in Ctenocephalides felis and Am. cajennense, while R. rickettsii was detected in Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis and Rhipicephalus sanguineus. In the State of RJ the minimum frequency of infected vectors presented higher values than those recorded in other regions of the country. The involvement of some of these species in the bacterium cycle has been demonstrated for the first time. R. rickettsii was diagnosed in dogs and horses indicating the importance of livestock in the maintenance cycle of rickettsial infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The Brazilian spotted fever is an infectious disease transmitted by ticks to humans. The occurrence of Rickettsia rickettsii agent has been reported in Brazil since 1920 and is considered the main bacteria involved in Brazilian Spotted Fever. Since 2000, four other current species have been identified in the country, as follows: Rickettsia riphicephali, Rickettsia amblyommi, Rickettsia parkeri and Rickettsia felis. R. parkeri was first isolated in Amblyomma maculatum on the Gulf Coast of the United States in 1937, but until 2004 was considered as non-pathogenic agent, when was the first recognized case of spotted fever in humans caused by this species. Recently a new human rickettsial infection was reported to cause disease in São Paulo, being called Rickettsia parkeri Strain Atlantic Forest. This study aimed to detect and identify proteins with potential to stimulate the immune system of the host of this new strain described. Therefore, we performed total protein extraction R. parkeri Strain Atlantic Forest from infected VERO cell samples. The extracted proteins were fractionated by electrophoresis in polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). The proteins were transferred to nitrocellulose membranes by semi-dry electrotransfer system and subjected to Western blot. Subsequently, the membrane was incubated with domestic rabbit hyperimmune serum against R. parkeri Strain Atlantic Forest (primary antibodies) followed by incubation with anti-rabbit IgG peroxidase-conjugated antibody (secondary antibody) to detect the primary antibodies bound to the proteins . Obtaining the hyperimmune rabbit serum was performed by experimental infection of R. parkeri Strain Atlantic Forest in domestic rabbit, intraperitoneally. After incubation, the disclosure of immunoreactive proteins was performed using a chromogenic substrate. 2 immunoreactants were detected proteins with more than 78 kDa (200 e 130 kDa) and 5 with less than 78 kDa. By comparing existing proteomic maps and the molecular weight of these proteins showed that, it is suggested that rOmpA (200 kDa) and rOmpB (130 kDa) are among the proteins detected and the remaining proteins found are members of the family of surface antigens cell (Sca - Surface cell antigen). However, one can not say that these proteins represent only reactive immunity to R. parkeri Strain Atlantic Forest, or that are homologous to other species. However, studies using the Modern Liquid Chromatography technique associated with mass spectrometry (LC/MS/MS) must be conducted for protein characterization. Preliminary results obtained in this study allowed further elucidation of protein profile of this agent, providing subsidies for the development of highly sensitive and specific diagnoses, as well as studies allow for the realization of a vaccine, as an alternative for the control and prevention of Brazilian Spotted Fever. / A Febre Maculosa Brasileira é uma doença infecciosa, transmitida por carrapatos ao homem. A ocorrência do agente Rickettsia rickettsii tem sido relatada no Brasil desde 1920, sendo considerada a principal bactéria envolvida na Febre Maculosa Brasileira. Desde 2000, outras quatros espécies circulantes foram identificadas no país, sendo: Rickettsia riphicephali, Rickettsia amblyommi, Rickettsia parkeri e Rickettsia felis. R. parkeri foi isolada pela primeira vez em Amblyomma maculatum, na Costa do Golfo dos Estados Unidos da América em 1937, porém até 2004 era considerada como agente não patogênico, quando então houve o primeiro caso reconhecido de Febre Maculosa em humanos ocasionado por essa espécie. Uma nova riquetsiose humana foi descrita como causadora da doença no Estado de São Paulo, sendo denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. O presente trabalho teve como objetivo detectar e identificar proteínas com potencial de estimular o sistema imune do hospedeiro desta nova cepa descrita. Para tanto, foi realizado a extração proteica total de R. parkeri cepa Mata Atlântica a partir de amostras de células VERO infectadas. As proteínas extraídas foram fracionadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE). Estas proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose através do sistema semi-seco de eletrotransferência e submetidas à técnica de Western blot. Posteriormente, a membrana foi incubada com soro hiperimune de coelho doméstico contra R. parkeri cepa Mata Atlântica (anticorpos primários), seguido de incubação com anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (anticorpo secundário), para detectar os anticorpos primários ligados às proteínas. A obtenção do soro de coelho hiperimune foi realizada através da infecção experimental de R. parkeri cepa Mata Atlântica em um coelho doméstico, via intraperitoneal. A revelação das proteínas imunorreativas foi efetuada através de substrato cromogênico. Foram detectadas 2 proteínas imunorreagentes com mais de 78 kDa (200 e 130 kDa ) e 5 com menos de 78 kDa. Através da comparação de mapas proteômicos existentes e pelo peso molecular que estas proteínas apresentaram, sugere-se que rOmpA (200 kDa) e rOmpB (130 kDa) estejam entre as proteínas detectadas e as demais proteínas encontradas, sejam membros da família de antígenos de superfície celular (Sca Surface cella ntigen). No entanto, não se pode afirmar que estas proteínas apresentam imunidade reativa única para R. parkeri cepa Mata Atlântica, ou se são homólogas a outras espécies de riquetsias. Contudo, estudos empregando a técnica de Cromatografia Líquida Moderna associada a Espectrometria de Massas (LC/MS/MS) deverão ser conduzidos para a caracterização proteica. Os resultados preliminares obtidos neste estudo permitiram maior elucidação do perfil proteico deste agente, fornecendo assim subsídios para o desenvolvimento de diagnósticos altamente sensíveis e específicos, bem como permitir estudos para a realização de uma vacina, como alternativa para o controle e prevenção da Febre Maculosa Brasileira.

Neste projeto, objetivou-se o diagnóstico de riquétsias, utilizando metodologia molecular, em material de humanos, carrapatos, pulgas, cães e equinos de áreas endêmicas dos estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ). Diagnosticou-se Rickettsia rickettsii infectando Amblyomma cajennense e humanos no estado de SP, indicando ser esta a única espécie responsável pela doença. Rickettsia conorii foi diagnosticada em um paciente procedente de Portugal. No estado do RJ, Rickettsia felis foi detectada Ctenocephalides felis e em Am. cajennense enquanto que R. rickettsii em Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis e Rhipicephalus sanguineus. As frequências mínimas de vetores infectados do estado do RJ apresentaram valores superiores àqueles registrados em outras regiões do país. Demonstrou-se, de forma inédita, o envolvimento de algumas destas espécies no ciclo da bactéria. R. rickettsii foi diagnosticada em cães e equinos indicando a importância dos animais domésticos na manutenção do ciclo da riquetsiose. / This project aimed to diagnose rickettsial diseases using molecular analysis methods on human, tick, flea, dog and horse samples from endemic areas in the States of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ). A diagnosis of Rickettsia rickettsii infecting Amblyomma cajennense and humans in the State of SP was made, indicating that this is the only species responsible for the disease. Rickettsia conorii was diagnosed in a patient from Portugal. In RJ, Rickettsia felis was detected in Ctenocephalides felis and Am. cajennense, while R. rickettsii was detected in Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis and Rhipicephalus sanguineus. In the State of RJ the minimum frequency of infected vectors presented higher values than those recorded in other regions of the country. The involvement of some of these species in the bacterium cycle has been demonstrated for the first time. R. rickettsii was diagnosed in dogs and horses indicating the importance of livestock in the maintenance cycle of rickettsial infection.