Orientador: Arício Xavier Linhares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:41:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_CarolineSiqueira_M.pdf: 1657929 bytes, checksum: 0b27568a919b921d3ae68ae3161f87fd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A febre maculosa brasileira (FMB) é uma doença infecciosa aguda transmitida através da picada de carrapatos infectados com Rickettsia rickettsii Brumpt 1922. O carrapato Amblyomma cajennense Fabricius 1787 (Acari: Ixodidae) é um dos principais vetores no Brasil. Contudo, outras espécies de carrapatos podem ser vetores da doença e parasitar humanos. Neste estudo, procurou-se avaliar a competência vetorial de Ornithodoros mimon Kohls 1969 (Acari: Argasidae) em laboratório após ser infectado experimentalmente com a cepa Taiaçu de Rickettsia rickettsii, utilizando coelhos domésticos como modelo animal. Primeiramente, os carrapatos foram separados em grupos de acordo com seu estágio de desenvolvimento (larva, ninfa 2 e adulto). Na segunda etapa, dois coelhos foram utilizados como grupo tratamento, e foram inoculados com a Rickettsia, e um coelho foi usado como controle. Os carrapatos utilizados foram separados em lotes, de acordo com o coelho e dia em que foram alimentados. Na terceira etapa, novos coelhos sadios foram infestados com os carrapatos usados na segunda etapa, para verificar se houve transmissão. Carrapatos que tiveram contato com a bactéria foram macerados e inoculados em duas cobaias, e uma terceira cobaia foi infestada com carrapatos que foram alimentados em coelho infectado. PCR com os primers gltA e ompA (R. rickettsii), ftsZ (Wolbachia sp.), 28S (eucarioto) foi realizado, para avaliar se os carrapatos se tornaram infectados. Sequenciamento de amostras foram amplificadas com os primers ompA e 28S. Além da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), que foi realizada com o soro dos coelhos para verificar a presença de infecção. Os dois coelhos que foram inoculados com Rickettsia rickettsii apresentaram picos de febre. Um dos coelhos apresentou resultado positivo na RIFI e o outro morreu no décimo sexto dia após a inoculação. Os coelhos que foram infestados com carrapatos que foram alimentados em coelho infectado não apresentaram febre e nenhum outro sintoma da doença. As cobaias que foram inoculadas com carrapatos e a cobaia que foi infestada com carrapatos não demonstraram nenhum sintoma da doença. Das amostras amplificadas com o primer gltA apenas uma amostra foi positiva. A PCR das amostras de carrapatos usando o primer ompA não apresentou o resultado esperado, provavelmente devido a presença do DNA da bactéria Wolbachia sp. A sequência gerada, com amostras que foram amplificadas com o primer 28S, foi o DNA do carrapato. A PCR com o primer ftsZ não amplificou nenhum DNA. Portanto, conclui-se que O. mimon não se tornou infectado com a Rickettsia rickettsii, e não representa risco para a saúde pública / Abstract: The Brazilian Spotted Fever (BSF) is an acute infectious disease transmitted by the bite of ticks infected with Rickettsia rickettsii Brumpt 1922. The tick Amblyomma cajennense Fabricius 1787 (Acari: Ixodidae) is one of the main vectors in Brazil. However, other species of ticks can be vectors of this disease and parasitize humans. This study aimed to evaluate the vector competence of Ornithodoros mimon Kohls 1969 (Acari: Argasidae) in the laboratory after being experimentally infected with the Taiaçu strain of Rickettsia rickettsii, using domestic rabbits as the animal models. Firstly, the ticks were separated into groups according to their developmental stage (larva, nymph 2 and adult). Secondly, two rabbits were used as treatment group, and were inoculated with the Rickettsia, and one rabbit was used as control. The ticks were separated into batches according to the rabbit and the day they were fed. New healthy rabbits were infested with the ticks used in the second experiment, to verify the occurrence of transmission. Ticks that had contact with the bacteria were macerated and inoculated into two guinea pigs, and a third guinea pig was infested with ticks that were fed on infected rabbits. PCR with gltA e ompA primers (R. rickettsii), ftsZ (Wolbachia sp.), 28S (eukaryotic) was performed, to assess if the ticks become infected. Sequencing of the samples was amplified with the primers ompA and 28S. In addition, the Immunofluorescence Assay (IFA) was performed with serum of rabbits to verify the presence of infection. The two rabbits that were inoculated with Rickettsia rickettsii presented peaks of fever. One rabbit presented a positive result in the IFA and the other died on the sixteenth day after inoculation. The rabbits that were infested with ticks that were fed on infected rabbits, showed no fever and no other symptoms of the disease. The guinea pigs that were inoculated with ticks and the guinea pig that was infested with ticks showed no symptoms of the disease. Of the samples only one of all samples amplified with the primer gltA was positive. The PCR samples of ticks using the primer ompA did not yield the expected result, probably due to the presence of the DNA of the bacteria Wolbachia sp. The sequence generated, with samples that were amplified with the primer 28S, it was the DNA of the tick. PCR performed with the primer ftsZ did not amplify any DNA. Therefore, we concluded that O. mimon did not become infected with R. rickettsii, and do not represent risk to public health / Mestrado / Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia / Mestra em Biologia Animal

Rickettsia rickettsii é uma bactéria intracelular obrigatória e agente etiológico da febre maculosa brasileira, uma grave enfermidade para humanos. Na América do Sul, o principal vetor para o agente é o carrapato Amblyomma cajennense. Alguns animais exercem um papel importante na manutenção da bactéria na natureza, uma vez que a mantêm em níveis altos na corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem. Os equinos são um dos principais hospedeiros para A. cajennense, porém sua importância como hospedeiro amplificador de R. rickettsii ainda não havia sido estudada. Objetivou-se no presente trabalho detectar, em equinos experimentalmente infectados com R. rickettsii, possíveis alterações clínicas, ocorrência e duração de riquetsemia e ocorrência de transmissão da bactéria dos equinos para carrapatos A. cajennense, além de observar a curva de anticorpos IgG anti-R. rickettsii nestes animais. Para tanto, quatro equinos foram infectados com a amostra Taiaçu de R. rickettsii, sendo dois por meio de infestação com carrapatos A. cajennense infectados e dois por meio de inoculação intraperitoneal. Durante 30 dias, os animais foram examinados diariamente e amostras de sangue foram coletadas a cada dois dias para realização de hemograma, PCR em tempo real do sangue para detecção de Rickettsia e inoculação do sangue em cobaias. Adicionalmente, exames bioquímicos foram realizados a cada seis dias e RIFI para detecção de anticorpos IgG foi realizada até os animais se tornarem soronegativos. Para verificar a capacidade de transmissão para carrapatos, os equinos foram infestados com larvas, ninfas e adultos de A. cajennense não infectados. Após serem retirados dos equinos, estes carrapatos foram alimentados em coelhos e/ou testados pela PCR em tempo real e PCR convencional para detecção de Rickettsia. Os equinos não apresentaram sinais clínicos nem alterações significativas no hemograma e testes bioquímicos. Todas as amostras de sangue foram negativas na PCR em tempo real e nenhuma cobaia inoculada com sangue dos equinos apresentou sinais clínicos compatíveis com infecção por R. rickettsii, nem soroconversão. Os equinos apresentaram anticorpos detectáveis a partir de 10 ou 12 dias pós-inoculação ou infestação e permaneceram soropositivos por no mínimo 177 dias. Nenhum coelho infestado com carrapatos previamente alimentados nos equinos apresentou sinais clínicos ou soroconversão após 21 dias da infestação. Apenas um carrapato, originário de um equino infectado via carrapatos infectados, foi positivo concomitantemente na PCR em tempo real e PCR convencional. Conclui-se que equinos experimentalmente infectados com uma amostra brasileira de R. rickettsii não apresentam alterações clínicas nem bacteremia detectável e transmitem a bactéria para uma quantidade ínfima de carrapatos, porém desenvolvem boa resposta humoral. Pode-se inferir que, em condições naturais, equinos não são importantes como hospedeiros amplificadores para R. rickettsii. / Rickettsia rickettsii is an obligate intracellular bacterium and the etiological agent of Brazilian spotted fever, a severe illness of humans. In South America, the main vector for the agent is the tick Amblyomma cajennense. Some animals play an important role in maintenance of the bacterium in nature, since they develop high levels of bacteremia for a few days or weeks, ensuring that new ticks become infected. Horses are one of the major hosts for A. cajennense, but its importance as an amplifier host for R. rickettsii had not yet been studied. This study aimed to evaluate possible clinical changes, the occurrence and duration of rickettsemia, and the occurrence of transmission of the bacterium from horses to A. cajennense ticks in horses experimentally infected with R. rickettsii, in addition to observe the kinetics of anti-R. rickettsii IgG antibodies. Therefore, four horses were infected with R. rickettsii strain Taiaçu, two by infestation with infected A. cajennense ticks and two by intraperitoneal injection. For 30 days, the animals were examined daily and blood samples were collected every two days for hemogram, real-time PCR of whole blood for the detection of Rickettsia, and inoculation of guinea pigs with blood. Additionally, biochemical tests were performed every six days and IFA test for detection of IgG antibodies was performed until the animals become seronegative. In order to verify the ability of the horses to transmit the infection to ticks, horses were infested with uninfected A. cajennense larvae, nymphs and adults. After being removed from horses, these ticks were fed on rabbits and/or tested by real-time PCR and conventional PCR. The horses showed no clinical signs or significant changes in the blood count and biochemical tests. All blood samples were negative in the real-time PCR and no guinea pig inoculated with the horse blood showed clinical signs consistent with infection by R. rickettsii, neither seroconversion. Horses had detectable antibodies from 10 or 12 days post-inoculation or infestation and remained seropositive for at least 177 days. None of the rabbits infested with ticks previously fed on the horses showed clinical signs or seroconversion after 21 days of infestation. Only one tick fed on a horse infected by infected ticks was positive in the real-time PCR and conventional PCR. The results allows to conclude that horses, experimentally infected with a Brazilian strain of R. rickettsii, do not exhibit clinical changes or detectable bacteremia, and transmit the bacterium to a very small amount of ticks, but develop good humoral response. We can infer that horses are not important as amplifiers hosts for R. rickettsii under natural conditions.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria Gram-negativa, intra-celular obrigatória, causadora de uma grave riquetsiose em humanos, chamada no Brasil de Febre Maculosa Brasileira (FMB). Os carrapatos vetores de R. rickettsii para humanos, conhecidos até o momento no Brasil são Amblyomma cajennense e Amblyomma aureolatum. O presente estudo avaliou o tempo mínimo de parasitismo de A. aureolatum (ninfas não-alimentadas, machos adultos em jejum e pré-alimentados), infectadas por R. rickettsii, para que ocorra a transmissão da bactéria para o hospedeiro vertebrado. Para a produção de ninfas infectadas, foi mantida uma colônia de carrapatos em laboratório, infectados por R. rickettsii através de infestação em cobaias (Cavia porcellus) inoculadas por essa bactéria (Cepa Taiaçu). Para os experimentos com as ninfas de A. aureolatum, dividiram-se as cobaias em dez grupos de duas, sendo essas infestadas com dez ninfas cada uma. Após 2 horas da infestação (fixação da primeira ninfa), o primeiro grupo (G1) teve todas suas ninfas removidas. Após 4 horas de infestação, um segundo grupo (G2) de cobaias teve todas suas ninfas removidas de forma semelhante. Este procedimento foi repetido com os demais grupos, cada um em um determinado número de horas após a infestação: após 6 (G3), 8 (G4), 12 (G5), 18 (G6), 24 (G7), 36 (G8) e 48 (G9) horas. Para um último grupo (G10), as ninfas foram deixadas em parasitismo até seu desprendimento natural (cerca de 10 dias). Os experimentos realizados com carrapatos machos adultos em jejum seguiram os mesmos períodos utilizados para as ninfas, para fixação e retirada de carrapatos, assim como o número de cobaias. Nos experimentos com carrapatos machos adultos previamente alimentados - 48 horas em coelhos (Oryctolagus cuniculus), utilizaram-se os períodos de fixação e retirada de carrapatos idênticos aos experimentos anteriores, e além desses foi necessária a utilização de períodos menores de fixação de A. aureolatum, variando entre um minuto e uma hora. As cobaias foram avaliadas clinicamente todos os dias, e sacrificadas 21 dias após a infestação. Amostras de sangue foram colhidas e testadas para presença de anticorpos anti-R. rickettsii. Carrapatos retirados das cobaias de todos os grupos foram testados por PCR, a fim de se certificar que estavam infectados por R. rickettsii. De acordo com os resultados obtidos, ninfas não alimentadas de carrapatos A. aureolatum, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 12 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; carrapatos adultos não alimentados, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; e carrapatos adultos infectados por R. rickettsii e pré-alimentados em coelhos por 48 horas, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 minutos, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado, utilizando-se cobaias como modelo experimental. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of the most severe rickettsiosis, known in Brazil as Brazilian Spotted Fever (BSF). Tick vectors of R. rickettsii to humans in Brazil are Amblyomma cajennense and Amblyomma aureolatum. The present study determined the minimum feeding period required for A. aureolatum-infected unfed nymphs, unfed adults, and fed adults to transmit infective forms of R. rickettsii to naïve guinea pigs. For this purpose, we used nymphs and adults of a laboratory colony of A. aureolatum, previously shown to be 100% infected by R. rickettsii strain Taiaçu. Infected nymphs were allowed to infest 10 groups of hosts, each containing 2 guinea pigs, with each individual guinea pig receiving 10 infected. After two hours of parasitism (counting from the moment when the first infected nymph attached to the skin), this group had all infected nymphs manually removed and saved for further molecular analysis. After 4 hours of infection, guinea pigs of a second group had all their nymphs similarly removed. This procedure was repeated with the other groups, each at a given number of hours after infestation: 6, 8, 12, 18, 24, 36, and 48h. For an additional group, nymphs were allowed to complete feeding period (96-120h). In another experiment, this whole procedure was performed with adult ticks, being one infected male tick per naïve guinea pig. In a third experiment, adult male ticks were pre-fed on rabbits for 48h before allowing to feed on naive guinea pigs for 1, 3, 5, 10, 20, 40 or 60 minutes, and then for 2 to >48h. Clinical signs and rectal temperature were evaluated daily in each guinea. Blood samples were collected at 21 days after infestation, and tested for presence of anti-R. rickettsii antibodies. All removed ticks in all groups showed to contain rickettsial DNA by PCR. According to the results, unfed nymphs of R. rickettsii-infected A. aureolatum ticks must feed for a minimum of 12 hours to transmit the bacterium to the vertebrate host; unfed R. rickettsii-infected adult ticks must feed for a minimum of 10 hours for transmission to occur, while previously fed adult ticks must feed for a minimum of 10 minutes to transmit R. rickettsii to vertebrate hosts, using guinea pigs as experimental model.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - NATHALIE COSTA DA CUNHA.pdf: 1106704 bytes, checksum: acf94c83c9ed46a4ae020bccfdfe1db8 (MD5) Previous issue date: 2009-02-19 / Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Diseases caused by rickettsiae are widely distributed worldwide and are associated with hematophagous arthropods. The bacteria Rickettsia rickettsii is the most pathogenic of the spotted fever group (SFG). In order to know the factors that led to the occurrence of the disease in this area and acquire more knowledge in the epidemiology of SF in Brazil, as their vectors and the sentinel animals, this study have had the following objectives: verify the occurrence of dogs and horses serological reactive to R. rickettsii, using the technique of indirect immunofluorescence assay (IFA); evaluate the potential of dogs and horses as sentinels for the occurrence SF; better understand the population of ixodidae in dogs and horses and evaluate by molecular tools the presence of the spotted fever group rickettsiae (SFGR) in ticks. It was found that 29 (27.62%) sera of dogs were reactive, with titles ranging from 1:64 to 1:4096 and 76 sera (72.38%) were not reactive. In the analysis of horses there was a total of 9 (9.4%) animals reactive and 87 (90.6%) not reactive to the IFA. It was collected a total of 470 ticks of dogs, which showed a percentage of infestation of 44%. It was identified the species Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense, A. aureolatum, A. ovale and Rhipicephalus (Boophilus) microplus and nymphs of Amblyomma sp., R. sanguineus and R. (B.) microplus, and 33 larvae. A total of 975 ticks were collected from horses, the species: A. cajennense, R. (B.) microplus and Dermacentor (Anocentor) nitens. It was also collected nymphs of Amblyomma sp., R. (B.) microplus and D. (A.) nitens, and 15 larvae. Considering the total number of horses observed, 71% were parasitized by ticks. The polymerase chain reaction (PCR) was performed on samples of blood and ticks of dogs that had positive serology. Thus, it was submitted to the technique 82 ticks. Only one tick of the species R. sanguineus showed PCR positive, and amplified for the four primers studied (ompA, ompB, gltA and htrA). This tick infested canine founded the property where there were the cases of SF. The rate of infection in ticks was 1.22%. The sequence had similarity of 99,3% with deposits in GenBank of R. rickettsii. Based on the results observed in the studied region, it can be concluded that dogs were important sentinels for the agent of SF; canines regular contact with forests and pastures positively influenced the reactive infection by R. rickettsii; dogs coming from properties at least six kilometers away from the outbreak were reactive to SFGR, confirming the concept of endemic area; canine remained reactive to the SFGR to at least one year after the occurrence of five cases of Brazilian spotted fever diagnosed in 2006; the population of ixodidae found corroborates with other studies in areas endemic for SF. The presence of the bacteria R. rickettsii in the tick R. sanguineus in natural conditions have demonstrated a likely chance of participation of the transmission vector of R. rickettsii to humans in the area of study. / As enfermidades causadas por rickettsias s?o amplamente distribu?das no mundo e est?o associadas a artr?podes hemat?fagos. A bact?ria Rickettsia rickettsii ? a mais patog?nica das rickettsias do grupo da febre maculosa (RGFM). No Munic?pio de Resende, Estado do Rio de Janeiro, cinco casos de febre maculosa (FM) ocorreram em uma mesma fam?lia. Com intuito de conhecer os fatores que levaram ? ocorr?ncia da doen?a nesta localidade e adquirir mais conhecimentos na epidemiologia da FM no Brasil, o presente estudo teve os seguintes objetivos: verificar a ocorr?ncia de caninos e equinos reativos sorologicamente ? R. rickettsii, utilizando a t?cnica de rea??o de imunofluoresc?ncia indireta (RIFI); avaliar o potencial dos caninos e equinos como sentinelas para a ocorr?ncia de FM; conhecer a fauna de ixod?deos dos c?es e equinos e avaliar por meio de ferramentas moleculares a presen?a de RGFM em carrapatos. Verificou-se que 29 (27,62%) dos soros caninos foram reativos, com t?tulos variando de 1:64 a 1:4096 e 76 (72,38%) soros foram n?o reativos. Na an?lise soroepidemiol?gica dos equinos observou-se um total de 9 (9,4%) animais reativos e 87 (90,6%) n?o reativos ? RIFI. Coletou-se um total de 470 carrapatos dos caninos, que apresentaram um percentual de infesta??o de 44%. Foram identificadas as esp?cies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense, A. aureolatum, A. ovale e Rhipicephalus (Boophilus) microplus e ninfas de Amblyomma sp., R. sanguineus e R.(B.) microplus e 33 larvas. Coletou-se um total de 975 carrapatos dos equinos, que apresentaram um percentual de infesta??o de 71%, pertencentes ?s seguintes esp?cies: A. cajennense, R.(B.) microplus e Dermacentor (Anocentor) nitens. Tamb?m foram coletadas ninfas de Amblyomma sp., R.(B.) microplus e D.(A.) nitens e 15 larvas. A rea??o em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em amostras de carrapatos dos caninos que apresentaram sorologia positiva, sendo submetidos ? t?cnica 82 carrapatos. Apenas um carrapato da esp?cie R. sanguineus apresentou-se positivo na PCR, tendo amplificado para os quatro marcadores estudados (ompA, ompB, gltA e htrA). Este carrapato infestava canino procedente da propriedade onde ocorreram os casos de FM. A taxa de infec??o nos carrapatos foi de 1,22%. A sequ?ncia teve similaridade de 99,3% com dep?sitos no GenBank de R. rickettsii. Com base nos resultados observados na regi?o estudada, pode-se concluir que os c?es foram importantes sentinelas para o agente da febre maculosa; o h?bito de caninos frequentarem matas e pastos influenciou positivamente na presen?a de anticorpos s?ricos anti-RGFM; os caninos provenientes de propriedades a pelo menos seis quil?metros de dist?ncia a partir do local de ocorr?ncia dos casos foram reativos a RGFM, confirmando o conceito de ?rea end?mica; caninos permaneceram reativos para RGFM pelo menos um ano ap?s a ocorr?ncia dos cinco casos de FM brasileira diagnosticados em 2006; a fauna de ixod?deos encontrada corrobora com dados de outros estudos em regi?es end?micas para FM; a presen?a, em condi??es naturais, de Rickettsia rickettsii no carrapato Rhipicephalus sanguineus indica uma poss?vel participa??o deste vetor na transmiss?o de R. rickettsii para humanos na ?rea estudada.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria Gram-negativa, intra-celular obrigatória, causadora de uma grave riquetsiose em humanos, chamada no Brasil de Febre Maculosa Brasileira (FMB). Os carrapatos vetores de R. rickettsii para humanos, conhecidos até o momento no Brasil são Amblyomma cajennense e Amblyomma aureolatum. O presente estudo avaliou o tempo mínimo de parasitismo de A. aureolatum (ninfas não-alimentadas, machos adultos em jejum e pré-alimentados), infectadas por R. rickettsii, para que ocorra a transmissão da bactéria para o hospedeiro vertebrado. Para a produção de ninfas infectadas, foi mantida uma colônia de carrapatos em laboratório, infectados por R. rickettsii através de infestação em cobaias (Cavia porcellus) inoculadas por essa bactéria (Cepa Taiaçu). Para os experimentos com as ninfas de A. aureolatum, dividiram-se as cobaias em dez grupos de duas, sendo essas infestadas com dez ninfas cada uma. Após 2 horas da infestação (fixação da primeira ninfa), o primeiro grupo (G1) teve todas suas ninfas removidas. Após 4 horas de infestação, um segundo grupo (G2) de cobaias teve todas suas ninfas removidas de forma semelhante. Este procedimento foi repetido com os demais grupos, cada um em um determinado número de horas após a infestação: após 6 (G3), 8 (G4), 12 (G5), 18 (G6), 24 (G7), 36 (G8) e 48 (G9) horas. Para um último grupo (G10), as ninfas foram deixadas em parasitismo até seu desprendimento natural (cerca de 10 dias). Os experimentos realizados com carrapatos machos adultos em jejum seguiram os mesmos períodos utilizados para as ninfas, para fixação e retirada de carrapatos, assim como o número de cobaias. Nos experimentos com carrapatos machos adultos previamente alimentados - 48 horas em coelhos (Oryctolagus cuniculus), utilizaram-se os períodos de fixação e retirada de carrapatos idênticos aos experimentos anteriores, e além desses foi necessária a utilização de períodos menores de fixação de A. aureolatum, variando entre um minuto e uma hora. As cobaias foram avaliadas clinicamente todos os dias, e sacrificadas 21 dias após a infestação. Amostras de sangue foram colhidas e testadas para presença de anticorpos anti-R. rickettsii. Carrapatos retirados das cobaias de todos os grupos foram testados por PCR, a fim de se certificar que estavam infectados por R. rickettsii. De acordo com os resultados obtidos, ninfas não alimentadas de carrapatos A. aureolatum, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 12 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; carrapatos adultos não alimentados, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; e carrapatos adultos infectados por R. rickettsii e pré-alimentados em coelhos por 48 horas, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 minutos, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado, utilizando-se cobaias como modelo experimental. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of the most severe rickettsiosis, known in Brazil as Brazilian Spotted Fever (BSF). Tick vectors of R. rickettsii to humans in Brazil are Amblyomma cajennense and Amblyomma aureolatum. The present study determined the minimum feeding period required for A. aureolatum-infected unfed nymphs, unfed adults, and fed adults to transmit infective forms of R. rickettsii to naïve guinea pigs. For this purpose, we used nymphs and adults of a laboratory colony of A. aureolatum, previously shown to be 100% infected by R. rickettsii strain Taiaçu. Infected nymphs were allowed to infest 10 groups of hosts, each containing 2 guinea pigs, with each individual guinea pig receiving 10 infected. After two hours of parasitism (counting from the moment when the first infected nymph attached to the skin), this group had all infected nymphs manually removed and saved for further molecular analysis. After 4 hours of infection, guinea pigs of a second group had all their nymphs similarly removed. This procedure was repeated with the other groups, each at a given number of hours after infestation: 6, 8, 12, 18, 24, 36, and 48h. For an additional group, nymphs were allowed to complete feeding period (96-120h). In another experiment, this whole procedure was performed with adult ticks, being one infected male tick per naïve guinea pig. In a third experiment, adult male ticks were pre-fed on rabbits for 48h before allowing to feed on naive guinea pigs for 1, 3, 5, 10, 20, 40 or 60 minutes, and then for 2 to >48h. Clinical signs and rectal temperature were evaluated daily in each guinea. Blood samples were collected at 21 days after infestation, and tested for presence of anti-R. rickettsii antibodies. All removed ticks in all groups showed to contain rickettsial DNA by PCR. According to the results, unfed nymphs of R. rickettsii-infected A. aureolatum ticks must feed for a minimum of 12 hours to transmit the bacterium to the vertebrate host; unfed R. rickettsii-infected adult ticks must feed for a minimum of 10 hours for transmission to occur, while previously fed adult ticks must feed for a minimum of 10 minutes to transmit R. rickettsii to vertebrate hosts, using guinea pigs as experimental model.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria intracelular obrigatória e agente etiológico da febre maculosa brasileira, uma grave enfermidade para humanos. Na América do Sul, o principal vetor para o agente é o carrapato Amblyomma cajennense. Alguns animais exercem um papel importante na manutenção da bactéria na natureza, uma vez que a mantêm em níveis altos na corrente sanguínea por alguns dias ou semanas, garantindo que novos carrapatos se infectem. Os equinos são um dos principais hospedeiros para A. cajennense, porém sua importância como hospedeiro amplificador de R. rickettsii ainda não havia sido estudada. Objetivou-se no presente trabalho detectar, em equinos experimentalmente infectados com R. rickettsii, possíveis alterações clínicas, ocorrência e duração de riquetsemia e ocorrência de transmissão da bactéria dos equinos para carrapatos A. cajennense, além de observar a curva de anticorpos IgG anti-R. rickettsii nestes animais. Para tanto, quatro equinos foram infectados com a amostra Taiaçu de R. rickettsii, sendo dois por meio de infestação com carrapatos A. cajennense infectados e dois por meio de inoculação intraperitoneal. Durante 30 dias, os animais foram examinados diariamente e amostras de sangue foram coletadas a cada dois dias para realização de hemograma, PCR em tempo real do sangue para detecção de Rickettsia e inoculação do sangue em cobaias. Adicionalmente, exames bioquímicos foram realizados a cada seis dias e RIFI para detecção de anticorpos IgG foi realizada até os animais se tornarem soronegativos. Para verificar a capacidade de transmissão para carrapatos, os equinos foram infestados com larvas, ninfas e adultos de A. cajennense não infectados. Após serem retirados dos equinos, estes carrapatos foram alimentados em coelhos e/ou testados pela PCR em tempo real e PCR convencional para detecção de Rickettsia. Os equinos não apresentaram sinais clínicos nem alterações significativas no hemograma e testes bioquímicos. Todas as amostras de sangue foram negativas na PCR em tempo real e nenhuma cobaia inoculada com sangue dos equinos apresentou sinais clínicos compatíveis com infecção por R. rickettsii, nem soroconversão. Os equinos apresentaram anticorpos detectáveis a partir de 10 ou 12 dias pós-inoculação ou infestação e permaneceram soropositivos por no mínimo 177 dias. Nenhum coelho infestado com carrapatos previamente alimentados nos equinos apresentou sinais clínicos ou soroconversão após 21 dias da infestação. Apenas um carrapato, originário de um equino infectado via carrapatos infectados, foi positivo concomitantemente na PCR em tempo real e PCR convencional. Conclui-se que equinos experimentalmente infectados com uma amostra brasileira de R. rickettsii não apresentam alterações clínicas nem bacteremia detectável e transmitem a bactéria para uma quantidade ínfima de carrapatos, porém desenvolvem boa resposta humoral. Pode-se inferir que, em condições naturais, equinos não são importantes como hospedeiros amplificadores para R. rickettsii. / Rickettsia rickettsii is an obligate intracellular bacterium and the etiological agent of Brazilian spotted fever, a severe illness of humans. In South America, the main vector for the agent is the tick Amblyomma cajennense. Some animals play an important role in maintenance of the bacterium in nature, since they develop high levels of bacteremia for a few days or weeks, ensuring that new ticks become infected. Horses are one of the major hosts for A. cajennense, but its importance as an amplifier host for R. rickettsii had not yet been studied. This study aimed to evaluate possible clinical changes, the occurrence and duration of rickettsemia, and the occurrence of transmission of the bacterium from horses to A. cajennense ticks in horses experimentally infected with R. rickettsii, in addition to observe the kinetics of anti-R. rickettsii IgG antibodies. Therefore, four horses were infected with R. rickettsii strain Taiaçu, two by infestation with infected A. cajennense ticks and two by intraperitoneal injection. For 30 days, the animals were examined daily and blood samples were collected every two days for hemogram, real-time PCR of whole blood for the detection of Rickettsia, and inoculation of guinea pigs with blood. Additionally, biochemical tests were performed every six days and IFA test for detection of IgG antibodies was performed until the animals become seronegative. In order to verify the ability of the horses to transmit the infection to ticks, horses were infested with uninfected A. cajennense larvae, nymphs and adults. After being removed from horses, these ticks were fed on rabbits and/or tested by real-time PCR and conventional PCR. The horses showed no clinical signs or significant changes in the blood count and biochemical tests. All blood samples were negative in the real-time PCR and no guinea pig inoculated with the horse blood showed clinical signs consistent with infection by R. rickettsii, neither seroconversion. Horses had detectable antibodies from 10 or 12 days post-inoculation or infestation and remained seropositive for at least 177 days. None of the rabbits infested with ticks previously fed on the horses showed clinical signs or seroconversion after 21 days of infestation. Only one tick fed on a horse infected by infected ticks was positive in the real-time PCR and conventional PCR. The results allows to conclude that horses, experimentally infected with a Brazilian strain of R. rickettsii, do not exhibit clinical changes or detectable bacteremia, and transmit the bacterium to a very small amount of ticks, but develop good humoral response. We can infer that horses are not important as amplifiers hosts for R. rickettsii under natural conditions.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1998. / "May 1998." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 126-138). Also available on the Internet.

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 4396839 bytes, checksum: 5ab00e786722dcd7034e91ef02840bd9 (MD5) 1_monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A febre maculosa (Fm) é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, apresentando a bactéria Gram- negativa, Rickettsia ricketsii, como seu agente etiológico e transmitida pelo carrapato. Esse patógeno possui em sua superfície um conjunto de proteínas de membranas externas (OMP), sendo a OMP-A, um dos antígenos imunodominantes e exclusiva do grupo da Fm. Portanto, devido a inexistência de testes sorológicos sensíveis e específicos para o diagnóstico da Fm tivemos como objetivo mapear imunologicamente a OMP H6PGA4 usando uma biblioteca de peptídeos e soro de pacientes e cães com a doença e desenvolver testes diagnosticos mais específicos. Uma biblioteca de 84 peptideos com 15 residuos de comprimento cobrindo a extensão de 429 aminoácidos da proteína H6PGA4 e contendo sequências sobrepostas de nove aminoácidos foram sintetizadas pela técnica F-moc. Os peptídeos foram ligados quimicamente a uma membrana celulósica e feitos reagir independentemente com um \201Cpool\201D de soro de pacientes com febre maculosa (SP-Fm) e de soro de cães com febre maculosa (SC-Fm). Oito epitopos IgG foram identificados pelo soro de pacientes e três epitopos IgG pelo SC-Fm Todos os peptídeos foram análisados individualmente por ELISA-peptideo contra um painel de SP-Fm e SC-Fm. A análise realizada através da curva ROC indicou que os peptídeos E4 e E5 foram os mais imunogênicos com SP-Fm (especificidade de 90% e sensibilidade de 94%). Diferentemente os peptídeos E7 e E9 foram os que apresentaram especificidade e sensibilidade (p<0,05) acima de 90% e 94% com SC-Fm, repectivamente. Alternativamente, foi desenvolvido um imunosensor para diagnóstico da doença humana, baseado no peptídeo OMP3 e análise por voltametria cíclica. A acurácia foi demonstrada pela análise de 20 ciclos de varredura e a especificidade contra soros de indivíduos saudáveis. O chip imunosensor-peptideo foi reprodutível com um coeficiente de variação \226410,1% para SP-Fm. A sensibilidade de diluição do soro foi de até 1: 100 / Rocky Mountain spotted fever (Fm) is a serious public health problem in Brazil and in the world, presenting the Gram- negative bacteria, Rickettsia ricketsii, as its etiologic agent and transmitted by the bite of an infected tick. This pathogen has on its surface a set of outer membrane proteins (OMP), being the OMP-A one of the immunodominant and exclusive antigen of the Fm group. Therefore, due to the lack of sensitivity and specificity of the serologic tests for the diagnosis of Fm our objective was to map the immunologically OMP H6PGA4_ RICRI using a peptide library and serum of patients and dogs with the disease and develop more specific diagnostic tests. A library of 84 peptides with 15 residues in length covering the extension of 429 amino acids of the H6PGA4 protein and containing overlapping sequences of nine amino acids were synthesized by F-moc technique. The peptides were chemically bound to a cellulose membrane and reacted independently with serum from patients (n=5) with spotted fever (SP-Fm) and serum from dogs (n=5) with spotted fever (SC-Fm). Eight IgG epitopes were identified by the SP-Fm and three by the SC-Fm. All peptides were individually analyzed by ELISA-peptide using a panel of SP-Fm and SC-Fm The analysis of ROC curve indicated that the E4 and E5 peptides were the most immunogenic with a specificity of 90% and sensitivity of 94% for the SP-Fm. Unlike the E7 and E9 peptides were the most reactive for SC-Fm with a specificity of 90% and sensitivity of 94% (p <0.05). Alternatively, it was developed a cyclic voltametry E3 based immunesensor for the diagnosis of the human disease. The accuracy was demonstrated by the analysis of 20 cycles of scanning and the specificity against sera of healthy individuals. The peptide-imunosensor chip was reproducible with a coefficient of variation \2264 10,1% for SP-Fm. The sensitivity of serum dilution was 1: 100 / 2100-12-31

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós Graduação em Saúde Animal, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-02-06T14:14:16Z No. of bitstreams: 1 2016_LaurícioMonteiroCruz.pdf: 813862 bytes, checksum: eabbec94c0e063a72c6004a7e5e0adf9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-08T21:34:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LaurícioMonteiroCruz.pdf: 813862 bytes, checksum: eabbec94c0e063a72c6004a7e5e0adf9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T21:34:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LaurícioMonteiroCruz.pdf: 813862 bytes, checksum: eabbec94c0e063a72c6004a7e5e0adf9 (MD5) / A Febre Maculosa Brasileira (FMB), é uma zoonose reemergente, de notificação compulsória imediata, causada pela Rickettsia rickettsii. A transmissão ocorre por picada de carrapatos da família Ixodidae infectados, principalmente, Amblyomma cajennense, embora outros vetores como as pulgas, artrópodes pertencentes a classe Insecta, ordem Siphonaptera, também possam ser agentes transmissores. O objetivo desse estudo foi pesquisar por técnica de reação de polimerização em cadeia de DNA (PCR) a ocorrência da bactéria do gênero Rickettsia do Grupo Febre Maculosa em cães recebidos na Gerência em Vigilância Ambiental de Zoonoses do Distrito Federal. Foram analisadas 197 amostras de coágulo de sangue de cães no ano de 2015. Os genes amplificados foram específicos para gene OmpA e para o gene gtlA. Os resultados encontrados foram negativos. Nesse estudo não foi possível detectar por PCR a circulação Rickettsia em cães. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a reemerging zoonosis, immediately notifiable caused by Rickettsia rickettsii. Transmission is by the bite of infected ticks Ixodidae family mainly Amblyomma cajennense, although other vectors such as fleas, arthropods belonging to the class Insecta, order Siphonaptera, can also be transmitting agents. The objective of this study was to search for polymerization reaction technique on DNA chain reaction (PCR) the occurrence of the genus Rickettsia bacteria of the spotted fever group in dogs received in Management in Zoonosis Environmental Surveillance of the Federal District. Were analyzed 197 dog blood clot samples in 2015. The amplified genes were specific for the ompA gene and gtlA gene. The results were negative. In this study, it was not possible to detect by PCR Rickettsia circulation in dogs.

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.