In der vorliegenden Studie haben wir mit Hilfe von SHARP-Screening, einer 16S-rRNA-basierten Heterogenitäts- und phylogenetischen Analyse, die mikrobielle Diversität in entzündlichen Lymphadenitiden ohne vorherige Kenntnis der jeweiligen Erreger an einer Serie von 15 Lymphknoten untersucht. Die Methode wurde erstmals auf diese Fragestellung angewandt. Sie konnte für die Verwendung von paraffineingebettetem Gewebe adaptiert werden, so dass auch Gewebeproben analysiert werden konnten, von denen kein Gefriermaterial zur Verfügung stand und die in Routineverfahren eingebettet und nach Standardmethoden gefärbt wurden. SHARP-Screening beinhaltet zwei komplementäre Schritte: Zuerst erfolgte die Erstellung einer Genbank aller bakteriellen Gene aus der gesamten extrahierten DNA des analysierten Gewebes durch gezielte Amplifikation des 16S-rRNA-Gens mittels universeller eubakterieller Primer. Als zweiter Schritt wurde nach der Transformation mittels Analyse des Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus die Selektion der jeweiligen unterschiedlichen Phylotypen der enthaltenen 16S-rRNA-Gene durchgeführt (insgesamt 400). Nach der Sequenzierung wurden die 16S-rRNA-Gene durch den Vergleich mit bekannten bakteriellen Sequenzen mit Hilfe des „Basic-Local-Alignment-Search-Tool“ (BLAST) identifiziert. SHARP-Screening hat sich als geeignete Methode zur Analyse der gesamten, in einer Gewebeprobe enthaltenen bakteriellen Flora erwiesen. Dabei wurden zum Teil andere Erreger gefunden, als aus dem histologischen Bild vermutet wurden. So konnte zum Beispiel mit dem Nachweis von Gluconacetobacter sacchari, als potentieller Erreger einer septischen Granulomatose, eine alternative Differentialdiagnose zur histologisch vermuteten Katzenkratzkrankheit aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnten auch gleichartige histologische Bilder bei dem gleichen identifizierten Erreger beobachtet werden. Zum Beispiel konnten im Zusammenhang mit dem Auftreten von Ödemen, Nekrosen, granulomatös eitrigen Veränderungen und einer ausgeprägten Sinus-histiozytose im Lymphknotengewebe immer wieder Comamonadaceae bzw. Janthinobacterium nachgewiesen werden. Oft zeigte sich nicht ein einzelner Erreger der Lymphadenitis, sondern ein ganzes Spektrum, wobei aus dem Vorhandensein der 16S-rRNA nicht auf das Vorhandensein vitaler Erreger geschlossen werden kann. Dennoch erlaubt die Häufigkeit der entsprechenden Klone eine semiquantitative Abschätzung der Bedeutung des jeweiligen Erregers. So wies SHARP-Screening auch Homologien zu Paracoccus yeeii nach. Eine Spezies, die mit klassischen Methoden häufig übersehen wird, die in Lymphknoten jedoch eine pathogene Rolle spielen kann. Im Zusammenhang mit dem histologischen Verdacht auf ein Malignom wurden in einigen Fällen Streptomyces, Roseomonas gilardii rosea und Stenotrophomonas maltophila nachgewiesen, die auch in der Literatur häufig bei immunsupprimierten Patienten vorkommen. Bei dem Verdacht auf ein Lymphgranuloma venerum wurde eine Cyanobacterium-Spezies detektiert, die es nach Literaturangaben Chlamydia trachomatis erst möglich macht, den eigenen Aminosäurestoffwechsel zu betreiben. Insgesamt dürften vom SHARP-Screening noch weitere tiefgreifende Erkenntnisse der bakteriellen Diversität und kausaler Erregerassoziationen in Erkrankungen des lymphatischen Systems zu erwarten sein. / The focus of this study was laid on the analysis of the microbial diversity in inflammatory lymphadenitis of 15 different lymph nodes without prior knowledge of the respective causative organism with help of the SHARP-Screening, a 16S-rRNA-based heterogeneity and phylogenetic analysis. This represents the first study to analyse this problem with the above mentioned SHARP-Screening adapting the method for the utilization of paraffin embedded tissue which consequently allowed the analysis of tissue specimen of which no freezing material was available and which were embedded in routine procedures as well as coloured according to a standard approach. The SHARP-Screening compromises two complementary steps: The first step is the creation of a gene pool of all bacterial genes of the entire DNA extracted from the analysed tissue by the systematic amplification of the 16S-rRNA-gene by means of universal eubacterial primers. The next step after the transformation was the selection of the different phylotypes of the incorporated 16S-rRNA-genes (altogether 400) by analysing the restriction fragment length polymorphism (RFLP). After the sequencing, the 16S-rRNA-genes were identified by comparing them with the known bacterial sequences with help of the “Basic-Local-Alignment-Search-Tool” (BLAST). The SHARP-Screening has proved itself as an adequate method to analyse the entire bacterial flora contained in the tissue sample. In some cases different causative organisms were found in contrast to the expectations which arose from the histological pictures. In this way evidence of gluconacetobacter sacchari could be provided as potential causative agents of a septic granulomatosis, an alternative differential diagnosis to the histologically assumed cat scratch disease. Furthermore, histological pictures of a similar type could be observed with regard to the same identified causative organism. For example, in conjunction with the appearance of edema, necrosis, granulomatosic purulent alterations and a very pronounced sinushistiozytosis in the lymph node tissue, comamonadaceae and accordingly janthinobacteria could consistently be demonstrated. A lot of times not just a single causative organism but a whole spectrum of the lymphadenitis could be identified. Here, however, the existence of the 16S-rRNA cannot be attributed to the existence of vital causative agents. Nevertheless, the frequency of the respective clones allows a semi quantitative assessment of the importance of the corresponding causative agents. Thus the SHARP-Screening proved evidence of homologies to paracoccus yeeii. A species which is often missed with classic methods however can play a pathogenic role. In several cases streptomyces, roseomonas gilardii rosea and stenotrophomonas maltophila, which are often mentioned in literature with regard to immunosuppressed patients, could be demonstrated in connection with the histological suspicion of a malignant tumour. While suspecting a lymphgranuloma venerum, a cyanobacterium species was discovered which according to literature sources enables chlamydia trachomatis to operate the body’s amino acid metabolism. Altogether, the SHARP-Screening is expected to lead to even more profound findings of bacterial diversity and causal causative organism associations with regard to diseases of the lymphatic system.

In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie. / In this thesis outgoing from HIV-1 based minigenes and the proviral NL4-3 DNA the influences of the PI3K signaling modulation on the alternative HIV-1 pre-mRNA splicing and also the viral replication were investigated. By performing RT-PCR analysis it could be shown that in the case of the minigene experiments the PI3K inhibition displayed an increased amount of unspliced or intron containing mRNAs, while the production of alternative Tat variants was demonstrated in the context of the virus. As a result of the PI3K inhibition an increased inclusion of the HIV-1 leader exons2/2b and 3 was observed. Because the inclusion of these exons is negatively regulated by the hnRNP H/F- and hnRNP A/B-dependent silencere elements ESSV and GI2-1, it was suggested that the PI3K inhibition interferes with the functionality of this splicing regulatory activity. Replication experiments either with GI2-1 or ESSV mutants in the presence or absence of the PI3K-Inhibitior supported this hypothesis. In addition, the influence of the inhibitor on the alternative HIV-1 splicing was analyzed under hnRNP H overexpression conditions. Furthermore, it was shown that the hnRNP H splicing pattern as well as the SR-protein phosphorylation and expression were altered as a consequence of the PI3K inhibition. During this thesis an interference of the PI3K modulation with the viral replication was also shown. The overexpression of the activated Akt kinase nearly prevented viral production while the PI3K inhibition reduced viral production by half. In further experiments it was shown that the overexpression of the activated Akt kinase seems to block the nuclear export of Rev-dependent HIV-1 mRNAs. In addition, beside the effect on the viral splicing pattern the PI3K inhibition also showed an influence on the viral transcription and the cellular translation suggesting that the sum of all these effects could contribute to the reduced virus production. These findings demonstrate that the PI3K signaling pathway has indeed a central influence on the alternative HIV-1 splicing as well as on the viral replication and may offer a new approach for antiviral therapy.

Die Interaktion des Masernvirus mit T-Zellen stört die Aktivierung der TCR-Signalkaskade durch die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die zur Einstellung der T-Zell-Funktionen führt und dadurch nachgeschaltete (downstream) Signalwege sowie den Eintritt in den Zellzyklus, aber auch die Genexpression reguliert. Infolgedessen können die Aktivität spleißregulatorischer Faktoren sowie die Spleißmuster von mRNAs verändert werden, wie zum Beispiel bei der alternativ gespleißten SHIP1-Isoform SIP110, die eine T-Zell-inhibitorische Aktivität zeigt. Um alternativ gespleißte (AS) und differentiell regulierte (RG) Transkripte in T-Zellen infolge von PI3K-Inhibition zu erfassen, wurde ein Human Exon 1.0 ST Array an RNA-Proben von humanen T-Zellen, 24 h stimuliert und stimuliert/ PI3K-inhibiert, durchgeführt. Durch die Anwendung geeigneter bioinformatischer Algorithmen konnten spezifisch in PI3K-inhibierten Zellen angereicherte Transkripte nachgewiesen und in die Kategorien AS (2192 Gene) und RG (619 Gene) eingeteilt werden. Ausgewählte Gene wurde mittels RT-PCR und qPCR validiert, gefolgt von der funktionellen Annotation beider Genlisten. AS Gene konnten verstärkt in ECM-Rezeptor Interaktionen, fokaler Adhäsion, Proliferation, Zytoskelettorganisation und Tumorsignalwegen gefunden werden, während RG Gene eher in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Stressantwort vertreten waren. Gene beider Gruppen konnten auf Signalwege bezogen werden, die essentiell für den TCR-Signalweg, die Zytoskelettdynamik und den Zellzykluseintritt waren. Das stützt die Annahme, dass die Außerkraftsetzung der PI3K-Schüsselprozesse der T-Zell-Aktivierung sowohl auf der Ebene der RG als auch der AS Gene wirkt. Über die Ingenuity Pathway Analyse konnten wir unsere Genlisten mit Genen vergleichen, die bereits auf solche Schlüsselprozesse und die Viabilität bezogen werden können. In der Überschneidung wurden z.B. die AS GTP-Austauschfaktoren Vav1 und Vav3 gefunden, die für die Übersetzung extrazellulärer Signale in Zytoskelettdynamik, Proteinphosphatasen und Adapter von Bedeutung sind. Ausgewählte Gene (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) wurden aus PI3K-arretierten T-Zellen kloniert und deren Effekt auf grundlegende zelluläre Funktionen durch Überexpression in HEK293T-Zellen überprüft. Die Fusionsproteine veränderten weder die Zellviabilität noch die Proliferation dieser Zellen. Über einen auf siRNA basierenden Knockdown wurde überprüft, ob das RG Gene SLFN5 als Suppressor auf die T-Zell-Aktivierung agiert. Der Knockdown in primären T-Zellen zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilität, Proliferation und Polarisation. Jedoch konnte ein signifikanter Effekt auf die T-Zell-Adhärenz auf Fibronektin gezeigt werden, was darauf schließen lässt, dass SLFN5 die T-Zell-Adhärenz negativ reguliert. Des Weiteren wurde die MV-induzierte Regulation selektierter Gene betrachtet und Unterschiede in der Regulation im Vergleich zur direkten PI3K-Inhibition festgestellt. Ein Grund dafür könnte sein, dass das MV eine Inhibition auf vielen Ebenen induziert, anstelle der alleinigen PI3K-Inhibition. Abschließend wurde untersucht, ob ausgewählte Gene an der Regulation in verschiedenen T-Zelllinien beteiligt sind und als Tumorsuppressoren agieren könnten. FBXO6 als Regulator der CHK1-Stabilität wurde in den meisten Zelllinien nicht exprimiert. Die Annahme, dass eine Stress-induzierte defekte Ubiquitinierungsmaschinerie an der Resistenz von Tumorzellen auf Chemotherapeutika beteiligt ist, macht FBXO6 zu einem interessanten Kandidaten als Biomarker für Tumorsensitivität gegenüber Krebsmedikamenten. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. / The interaction of measles virus (MV) with T cells interferes with the activation of the TCR-signaling by the inhibition of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), leading to the termination of T cell functions and consequently to the regulation of downstream signaling as well as cell cycle entry. PI3K-inhibition also affects the activity of splice regulatory elements and the splicing pattern of mRNAs, as for example the alternatively spliced SHIP1 isoform SIP110 that shows T cell inhibitory activity. To integrate early alternatively spliced (AS) and differentially regulated (RG) transcripts in response to PI3K interference in T cells at a general level, we performed a Human Exon 1.0 ST Array analysis on RNAs isolated from human T cells PI3K-inhibited or not prior to 24h stimulation. Applying suitable bioinformatic algorithms, transcripts detected specifically in PI3K-inhibited cells were assigned to categories defining RG (619 genes) and AS species (2192 genes). A selection of genes was validated by RT-PCR and qPCR followed by functional annotation of both gene lists. AS genes were found to be enriched in ECM-receptor interactions, focal adhesion, proliferation, cytoskeleton organization and tumor signaling, while RG genes were rather related to processes as DNA-replication, DNA-repair and stress response. Some genes that belonged to both groups target pathways essential for TCR-signaling, cytoskeletal dynamics and cell cycle entry, strongly support the notion that PI3K abrogation interferes with key T cell activation processes at the level of differential regulation as well as alternative splicing. Using Ingenuity Pathway Analysis we compared our gene lists to genes already known to specifically relate to key T cell functions and viability. In the overlap we found for example AS GTP-exchange factors Vav1 and Vav3 important for translating extracellular signals into cytoskeletal dynamics, protein phosphatases and adaptors. Selected candidate genes (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) were cloned from PI3K-arrested T cells into the pEGFP-vector and tested by overexpression in HEK293T for their effect on basic cell functions. These fusion proteins did not affect viability and proliferation of these cells. Using siRNA-based knockdown the potential of the RG gene SLFN5 to act as suppressors of key steps in T cell activation was tested. Its knockdown in primary T cells did not affect cell viability, proliferation and polarization. However, T cell adherence on fibronectin was significantly enhanced indicating that SLFN5 negatively regulates T cell adhesion to the ECM. Additionally we had a look at the MV induced regulation of selected genes and found a difference of the regulation in comparison to direct PI3K-inhibition. A reason for these unexpected results could be that MV induces a multi-level inhibition, rather than PI3K-inhibition only. Finally we wanted to find out, if selected genes were also implicated in the regulation of different T cell lines and therefore could act as tumor suppressors. FBXO6, a regulator of CHK1 stability, for example was not expressed in most investigated cell lines. Assuming that a stress-induced defective ubiquitination complex is involved in the resistance of tumor cells to chemotherapeutic agents FBXO6 might be an interesting candidate as biomarker for tumor sensitivity to cancer medication. If some of these differences in regulation are the result of immortalization, corresponding genes could consequently act as tumor suppressor. This issue has to be subject to further research.

The oncogenic MYC protein is a transcriptional regulator of multiple cellular processes and is aberrantly activated in a wide range of human cancers. MYC is an unstable protein rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. Ubiquitination can both positively and negatively affect MYC function, but its direct contribution to MYC-mediated transactivation remained unresolved. To investigate how ubiquitination regulates MYC activity, a non-ubiquitinatable MYC mutant was characterized, in which all lysines are replaced by arginines (K-less MYC). The absence of ubiquitin-acceptor sites in K-less MYC resulted in a more stable protein, but did not affect cellular localization, chromatin-association or the ability to interact with known MYC interaction partners. Unlike the wild type protein, K-less MYC was unable to promote proliferation in immortalized mammary epithelial cells. RNA- and ChIP-Sequencing analyses revealed that, although K-less MYC was present at MYC-regulated promoters, it was a weaker transcriptional regulator. The use of K-less MYC, a proteasomal inhibitor and reconstitution of individual lysine residues showed that proteasomal turnover of MYC is required for MYC target gene induction. ChIP-Sequencing of RNA polymerase II (RNAPII) revealed that MYC ubiquitination is dispensable for RNAPII recruitment and transcriptional initiation but is specifically required to promote transcriptional elongation. Turnover of MYC is required to stimulate histone acetylation at MYC-regulated promoters, which depends on a highly conserved region in MYC (MYC box II), thereby enabling the recruitment of BRD4 and P-TEFb and the release of elongating RNAPII from target promoters. Inhibition of MYC turnover enabled the identification of an intermediate in MYC-mediated transactivation, the association of MYC with the PAF complex, a positive elongation factor, suggesting that MYC acts as an assembly factor transferring elongation factors onto RNAPII. The interaction between MYC and the PAF complex occurs via a second highly conserved region in MYC’s amino terminus, MYC box I. Collectively, the data of this work show that turnover of MYC coordinates histone acetylation with recruitment and transfer of elongation factors on RNAPII involving the cooperation of MYC box I and MYC box II. / Der Transkriptionsfaktor MYC ist an der Regulation einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist und spielt bei der Tumorentstehung und des Tumorwachstum eine entscheidende Rolle. MYC ist ein kurzlebiges Protein, das durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Die Ubiquitinierung von MYC hat auch einen stimulierenden Einfluss auf dessen transkriptionelle Aktivität. Dabei blieb jedoch der Mechanismus, der dieser Beobachtung zugrunde liegt, bislang ungeklärt. Um den direkten Einfluss von Ubiquitinierung auf die Aktivität von MYC zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine MYC Mutante analysiert, in der alle Lysine zu Argininen mutiert wurden (K-less MYC). Die Mutation der Ubiquitin-Verknüpfungsstellen resultierte in einem stabileren Protein, hatte jedoch keinen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation oder Assoziation mit bekannten Interaktionspartnern. Im Vergleich zu Wildtyp (WT) MYC war K-less MYC jedoch in der Vermittlung MYC-induzierter biologischer Phänotypen stark beeinträchtigt. Mittels RNA- und ChIP-Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass K-less MYC zwar an MYC-regulierte Promotoren bindet, in der transkriptionellen Aktivität aber stark beeinträchtigt ist und diese Zielgene nicht aktivieren kann. Dabei war K-less MYC noch in der Lage, RNA Polymerase II (RNAPII) zu den Zielpromotoren zu rekrutieren und die Transkription dort zu initiieren, jedoch war der Übergang zur Elongation blockiert. Die Verwendung eines Proteasom-Inhibitors sowie die Rekonstitution einzelner Lysine in K-less MYC zeigten, dass der proteasomale Abbau von MYC für die Aktivierung von Zielgenen benötigt wird. Der proteasomale Abbau ist für die Histon-Acetylierung von Bedeutung, die von einer hoch konservieren Region in MYC, der MYC Box II, abhängt. Durch die WT MYC-vermittelte Induktion der Histon-Acetylierung können folglich die Proteine BRD4 und P-TEFb an die Promotoren rekrutiert werden. Diese Proteine spielen bei dem Übergang der initiierenden RNAPII zur elongierenden RNAPII eine essentielle Rolle. Darüber hinaus ermöglichte die Inhibition des MYC Abbaus die Identifizierung eines Zwischenschritts der MYC-abhängigen Transaktivierung: die Assoziation von MYC mit dem positiven Elongationskomplex, dem PAF-Komplex. Dieser wird über eine zweite hochkonservierte Region in MYC, der MYC Box I, rekrutiert. Somit kann angenommen werden, dass MYC als eine Verbindungsstelle fungiert, die positive Elongationsfaktoren auf die RNAPII transferiert. Zusammenfassend resultieren die Daten dieser Arbeit in einem Model, nach dem der proteasomale Abbau von MYC die Histon-Acetylierung mit der Rekrutierung und dem Transfer von Elongationsfaktoren auf die RNAPII koordiniert, was der Kooperation von MYC Box I und MYC Box II bedarf.

In der vorliegenden Arbeit wurden Fusionsprodukte aus verschiedenen nukleolären Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen (GFP und dsRed: rot fluoreszierendes Protein) in lebenden Zellen von Säugern und Xenopus laevis exprimiert und lokalisiert. Dadurch standen "Marker" für die drei Hauptkomponenten des Nukleolus zur Verfügung. Die dynamischen Eigenschaften dieser Fusionsproteine wurden quantitativ mit Hilfe von "Photobleaching"-Experimenten analysiert (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). Im einzelnen wurde durch die Untersuchung von RNA-Polymerase I der rDNA Transkriptionsort im fibrillären Zentrum des Nukleolus bestätigt. Die kinetischen Analysen von zwei pol I-Untereinheiten (RPA194 und RPA53) durch FRAP in transkriptionell aktiven und inaktiven Nukleoli erlaubten direkte Rückschlüsse auf die Transkriptionsdauer der rRNA-Gene in vivo. Die individuellen pol I-Untereinheiten bewegen sich rasch zwischen Nukleoplasma und Nukleolus und interagieren in den fibrillären Zentren mit dem rDNA-Promoter. Dann werden sie in produktive Transkriptionskomplexe integriert, die während der Elongationsphase, die bei Raumtemperatur etwa fünf Minuten dauert, stabil bleiben und erst nach der Termination dissoziieren. Zumindest ein Teil der Untereinheiten wandert anschließend in das Nukleoplasma. Die Ergebnisse widersprechen Modellen, welche die dichte fibrilläre Komponente als Transkriptionsort ansehen oder immobile RNA Polymerase I-Moleküle postulieren. Die Identifizierung des fibrillären Zentrums als rDNA-Transkriptionsort wurde durch die Koexpression der pol I-Untereinheiten mit Fibrillarin, einem Leitprotein der dichten fibrillären Komponente, ermöglicht. Durch die Expression der beiden Proteine als unterschiedlich fluoreszierende Fusionsproteine konnten die Orte der Transkription (die fibrillären Zentren) und die Orte der ersten Prozessierungsschritte, an denen Fibrillarin beteiligt ist (die dichte fibrilläre Komponente), in lebenden Zellen als direkt benachbarte, aber räumlich getrennte Kompartimente identifiziert werden. Die Rolle der granulären Komponente als Ort späterer Prozessierungschritte und Integration ribosomaler Proteine wurde durch die Expression von B23 und der ribosomalen Proteine L4, L5 und L10 verdeutlicht. Dabei wurde die nukleoläre Lokalisation von L10 erstmals belegt. In der Literatur wurde bisher angenommen, L10 würde erst im Cytoplasma mit Ribosomen assoziieren. Dies ist nicht der Fall, wie insbesondere Experimente mit Leptomycin B gezeigt haben. Diese Droge hemmt den CRM1-abhängigen Kernexport und führte zu einer deutlichen Akkumulation von L10-haltigen Präribosomen im Nukleoplasma von menschlichen Zellen. Schließlich sollte ein neues nukleoläres Protein von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, das mit verschiedenen Antikörpern in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert wurde. Durch massenspektrometrische Analysen nach zweidimensionaler Gelelektrophorese wurden die Antigene überraschenderweise als Cytokeratin-Homologe identifiziert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden drei bisher unveröffentlichte Cytokeratin 19 Isoformen von Xenopus kloniert, sequenziert und als GFP-Fusionsproteine exprimiert. Diese wurden allerdings wie reguläre Cytokeratine in cytoplasmatische Intermediärfilamente integriert und konnten, auch nach Translokation in den Zellkern durch ein experimentell eingefügtes Lokalisationssignal, nicht im Nukleolus nachgewiesen werden. Nach der Kotransfektion mit verschiedenen Zellkern-Proteinen wurde Cytokeratin 19 mit diesen in den Zellkern und mit nukleolären Proteinen in den Nukleolus transportiert. Obwohl diese Versuche auf einen "Huckepack"-Transportmechanismus für ein normalerweise cytoplasmatisches Protein hinweisen, konnte Cytokeratin 19 nicht spezifisch in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert werden. Daher konnte bisher, trotz intensiver Bemühungen, die Identität des in der Immunfluoreszenz nachgewiesenen nukleolären Proteins leider nicht aufgeklärt werden. / In the present work, nucleolar proteins were expressed as fusions with fluorescent proteins (GFP: green fluorescent protein or dsRed: red fluorescent protein) in living mammalian and Xenopus laevis cells. These tagged proteins were used as markers for the three main components of the nucleolus. The dynamic properties of the fusion proteins were analyzed quantitatively in photobleaching experiments (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). The analysis of RNA polymerase I allowed the conclusion that the fibrillar centers are the site of rDNA transcription. The kinetic FRAP analysis of two pol I subunits (RPA194 and RPA53) in transcriptionally active and inactive nucleoli allowed an estimate of the transcription time of rDNA genes in vivo. The individual pol I subunits move rapidly between the nucleoplasm and the nucleolus and associate at rDNA promoter sites. Then they are integrated into productive transcription complexes, which remain stable for the elongation phase of about five minutes at room temperature, and dissociate after termination. At least part of the subunits migrate to the nucleoplasm. The obtained results disagree with models that assume the site of transcription to be in the dense fibrillar component, as well as proposing immobile RNA Polymerase I molecules. The designation of the fibrillar center as site of rDNA transcription was further corroborated by the coexpression of pol I subunits with fibrillarin, a major protein of the dense fibrillar component. Using two differently fluorescing tags, the sites of transcription (fibrillar centers) and the sites of early processing steps, in which fibrillarin participates (dense fibrillar components), could be identified in living cells as closely neighboured but clearly separated compartments. The granular component as the site of late processing steps and assembly of ribosomal proteins was visualized by the expression of B23 and ribosomal proteins L4, L5 and L10. In the course of this work L10 was shown to be localized in the nucleolus for the first time. In the literature, human L10 was assumed to associate with ribosomes only in the cytoplasm. This is not the case, as was shown in particular by experiments with Leptomycin B. This drug inhibits the CRM1 dependent nuclear export pathway and resulted in a clear accumulation of L10 containing preribosomes in the nucleoplasm of human cells. Finally, a novel nucleolar protein (p52) of Xenopus laevis was studied in detail. Antigens of various p52 antibodies, localized in the granular component of nucleoli by immunofluorescence were surprisingly identified as cytokeratin homologs by two-dimensional immunoblot analysis and mass spectrometry. In the course of this work three hitherto unpublished Cytokeratin 19 isoforms of Xenopus were cloned, sequenced and expressed as GFP-fusion proteins. However, these proteins behaved like regular cytokeratins and were integrated into intermediate filaments. They were not detectable in the nucleolus, even after translocation into the nucleus by means of an experimentally added localization signal. Following cotransfection with various nuclear RFP-fusion proteins, GFP-CK19 was transported into the nucleus and localized with ist coexpressed partner. When coexpressed with nucleolar proteins, Cytokeratin 19 was also transported into the nucleolus. Although these experiments indicate a possible piggyback transport mechanism for a normally cytoplasmic protein, Cytokeratin 19 was not specifically located in the granular component of the nucleolus. Therefore, despite all efforts, until now the identity of the nucleolar protein originally identified by immunofluorescence remains to be clarified.

Cette thèse donne un aperçu des différentes attaques que doivent contrer les implémentations et propose quelques solutions en distinguant trois niveaux, le niveau hardware, le niveau mathématique et le niveau algorithmique. L'état de l'art fait au chapitre 2 montre bien que les possibilités données à l'attaquant sont multiples et variées. Au niveau hardware, les résultats obtenus dans le projet ESPASS-IS ont motivé la définition de nouveaux projets entre le laboratoire TIMA, le LIRMM et STMicroelectronics . Au niveau mathématique, la mise en ÷uvre de LRA et la collaboration initiée avec le LIRMM a ouvert la voie à de nombreux sujets de recherches vers des arithmétiques à la fois rapides et compactes mais prenant en compte un nouvel élément d'optimisation : la robustesse aux injections de fautes et la minimisation des fuites au travers des canaux cachés. Au niveau algorithmique particulièrement, l'article publié à CHES'00 a fait parti de la toute première vague de travaux de sécurisation des implémentations des courbes elliptiques et constitue une publication très citée dans le domaine.

Zugl.: Giessen, University, Diss., 2008.

Francisella tularensis is a gram-negative, highly virulent, intracellular bacterium which causes the zoonotic disease tularemia. The subspecies tularensis and holarctica are clinically important, and the former is the more virulent. The intracellular lifestyle of F. tularensis is not completely understood, but after uptake in monocytes, the bacterium escapes from the phagosome within hours and replicates massively in the cytosol. The escape is dependent on factors encoded by the Intracellular Growth Locus (igl) operon, located in the Francisella Pathogenicity Island, FPI. The thesis was aimed to clarify and understand the interaction of F. tularensis strains with the endosomal pathway of monocytic cells in general and the roles of the Igl proteins and the global regulator MglA for this interaction in particular. A focus has also been to elucidate the roles of reactive oxygen and nitrogen species for the intracellular host-parasite interaction. We show that mutants in the IglB, IglC, or IglD proteins or their regulator MglA of the live vaccine strain, LVS (subspecies holarctica), all demonstrated reduced replication rates and lowered cytopathogenicity compared to the wild type in a J774 mouse macrophage cell model. Colocalization with LAMP-1 was significantly increased for the IglC, IglD and MglA mutants compared to LVS. This indicated an impaired ability to escape into the cytoplasm, while at the same time they, like LVS, partly prevented fusion with lysosomes. IFN-γ activation of the J774 host cells prior to infection had a bactericidal effect on LVS and all of the mutants, though the cidal effect was significantly more pronounced for the mutants. Following IFN-γ activation, a majority of the mutant-containing phagosomesfused with lysosomeswhile LVS remained localized in the cytosol without significantly increased interactions with the endosomal pathway. Previous studies have revealed that IFN-γ activation of F. tularensis-infected macrophages leads to control of infection but conclusions about the importance of reactive nitrogen and oxygen species on bacterial killing are inconsistent. We found that the growth inhibition resulting from IFN-γ activation could not be attributed to an increased oxidative burst since PMA-induced superoxide production was still inhibited by LVS to the same extent as in non-activated macrophages. On the other hand, reactive nitrogen species may in part have contributed to the cidal effect. To further assess the role of reactive nitrogen species to the killing of F. tularensis, nitric oxide was administrated exogenously to J774 cells infected with LVS. This led to significant killing of intracellular LVS with a concomitant increased phagosomal localization and downregulation of the virulence gene regulator mglA. These effects were reversed by addition of a peroxynitrite decomposition catalyst. A spontaneous avirulent mutant of subspecies tularensis, strain FSC043, was previously demonstrated to provide protective immunity in mice. Here, microscopic analyses of the strain revealed an unusual intracellular localization with a delayed phagosomal escape. This may account for the low virulence, while at the same time FSC043 remains immunogenic and thereby confers protection. The igl operon is intact in strain FCS043 and we hypothesize that a defect in the FPI gene pdpC contributed to the observed phenotype. Altogether, this thesis work demonstrates the importance of the mglA and igl genes for the virulence of F. tularensis and specifically their important roles for a functional phagosomal escape and inhibition of the host cell oxidative burst. Also, addition of exogenous nitric oxide likely leads to formation of peroxynitrite intracellularly, a reactive molecule which confines the bacterium to the phagosome and confers a significant bactericidal effect on intracellular F. tularensis.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.