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Uno de los problemas a los que se enfrenta la agricultura son los daños producidos por los virus que causan cada año considerables pérdidas económicas en diversos cultivos de todo el mundo. El control de las enfermedades virales es difícil debido a su compleja y dinámica epidemiología, con casos frecuentes de emergencia y rápida dispersión a escala global, así como por su gran capacidad evolutiva que les permite superar distintas estrategias de control, como por ejemplo el cultivo de variedades resistentes obtenidas por mejora genética. El primer paso para evaluar el estado sanitario de un cultivo y poder aplicar un programa de manejo integrado es disponer de métodos de diagnóstico y detección de los principales virus que sean específicos, fiables, rápidos y sensibles. Dada la situación dinámica de las virosis, en la que continuamente están apareciendo nuevos virus o variantes, es recomendable que los métodos de diagnóstico puedan desarrollarse rápidamente para responder a la demanda y que sean flexibles de manera que se pueda ajustar al nivel de especificidad requerido (no solamente para la especie viral sino también para categorías taxonómicas superiores, como género y familia o inferiores como cepa o grupo de aislados virales). En este respecto, los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) y la hibridación molecular de ácidos nucleicos cumplen estos criterios. Los métodos de PCR tienen la ventaja de ser muy sensibles mientras que los basados en la hibridación permiten analizar simultáneamente un elevado número de muestras. Una modalidad, la hibridación de flujo de improntas vegetales (flow-through hybridization of tissue prints), recientemente desarrollada, supone una reducción drástica del tiempo necesario para el análisis al evitar el procesamiento de las muestras y acelerar el proceso de hibridación. En el desarrollo, tanto de la PCR como de la hibridación, es necesario conocer la secuencia nucleotídica de al menos una porción del genoma del virus que se quiere detectar, pero si se quiere sacar el máximo provecho, por una parte, hay que estimar la variabilidad genética entre los distintos aislados del virus, para así evitar o minimizar los falsos negativos (ej. reacción negativa con algunos aislados genéticamente divergentes), y por otra parte, hay que considerar la relación genética del virus objeto con repecto a otros virus, para evitar falsos positivos (ej. reacción positiva con aislados pertenecientes a otros virus). En esta tesis doctoral se abordaron dos retos relacionados con el desarrollo de métodos moleculares de detección de ribovirus (con genoma de RNA) que afectan a cultivos hortícolas. El primero corresponde a la detección del género Fabavirus, que está compuesto por cinco especies virales: virus 1 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), virus 2 del marchitamiento del haba (Broad bean wilt virus 2, BBWV-2), virus del mosaico de la genciana (Gentian mosaic virus, GeMV) y virus del mosaico suave de cucurbitáceas (Curcubit mild mosaic virus, CuMMV) y virus del mosaico suave de la ortiga blanca (Lamium mild mosaic virus, LMMV). En primer lugar se secuenció el genoma completo del único aislado disponible de LMMV, ya que era la única especie viral de este género de la que no se disponía ninguna secuencia nucleotídica. La comparación de esta secuencia con la del genoma completo de los otros fabavirus confirmó que LMMV es una especie viral per se al ajustarse a los criterios actualmente aceptados de demarcación entre generos, especies y aislados virales. Se encontró varias repeticiones de un motivo de diez nucleotídos en las zonas no traducibles del extremo 5’ de todos los miembros del género Fabavirus que se puede considerar como una seña de identidad y serviría para asignar nuevos virus a este género viral. En segundo lugar, a partir de todas las secuencias nucleotídicas disponibles de todos los virus del género Fabavirus se diseñó una pareja de iniciadores conservados para poder detectar por retrotranscripción (reverse transcription, RT) y PCR (RT-PCR) todos los fabavirus en una única reacción. También se diseñaron cinco parejas de iniciadores, cada una específica para una especie viral, para poder detectar e identificar cualquiera de estos virus en una única reacción mediante RT-PCR múltiple (multiplex RT-PCR). La combinación de ambos procedimientos de RT-PCR permite detectar e identificar cada una de las cinco especies conocidas del género Fabavirus, así como descubrir nuevas especies dentro de este género. En tercer lugar, se diseñó una sonda molecular correspondiente a la región del genoma que contenia las repeticiones del motivo de diez nucleótidos, con la que se pudo detectar las cinco especies del género Fabavirus mediante hibridación molecular de flujo. Esta es la la primera vez que se consigue una sonda conservada para un género viral. También se diseñaron cinco sondas, cada una específica para cada una de cinco las especies conocidas del género. De manera que mediante hibridación de flujo con las seis sondas se pueden identificar BBWV-1, BBWV-2, LMMV, GeMV y CuMMV y descubrir nuevas especies dentro del género Fabavirus. Para comprobar la especificidad de las técnicas de RT-PCR e hibridación desarrolladas aquí, ambas se probaron con distintos aislados de una misma especie viral que eran genéticamente muy divergentes (identidad ~80%) y no se produjeron falsos negativos. Así mismo se constató in silico o in vitro que estas técnicas no producían falsos positivos al no detectar otros virus relacionados fuera del género Fabavirus, como son aquellos que pertenecen a los géneros Comovirus y Nepovirus, que junto el género Fabavirus forman la subfamilia Comovirinae. El otro reto que se planteó fue la detección e identificación de los siete ribovirus más importantes en los cultivos de tomate del área mediterránea y otras áreas subtropicales: virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), virus del la clorosis del tomate (Tomato chlorosis virus,ToCV), virus de la clorosis infecciosa del tomate (Tomato infectious clorosis virus, TICV), virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), y virus del torrado del tomate (Tomato torrado virus, ToTV). Primero se caracterizó la variabilidad genética de ToMV puesto que era el único de estos virus en la que no se había estudiado este atributo. Se encontró tres grupos de aislados que tenían entre ellos identidades nucleotídicas menores al 90%. Sin embargo, solamente uno de estos grupos se había dispersado por el mundo y se caracterizaba por una gran estabilidad y muy baja variabilidad genética (identidades mayores del 98%). A partir del análisis de todas las secuencias disponibles de estos siete virus se diseñaron siete parejas de iniciadores específicos para cada virus. Se tuvo en cuenta la variabilidad genética dentro de cada uno de los siete virus para evitar o minimizar los falsos negativos. Mediante dos RT-PCR múltiples (una para CMV, ToMV y TICV y la otra para TSWV, ToCV, ToTV y PepMV) se pudo detectar e identificar cada especie viral tanto en infecciones únicas como múltiples en muestras de campo de Sicilia con una prevalencia variable según el virus y el área geográfica. Los métodos moleculares de detección desarrollados en esta tesis permiten llevar a cabo prospecciones rutinarias en grandes áreas de cultivo, recabando información epidemiológica muy valiosa para el manejo de enfermedades a diferentes escalas geográficas, y constituyen una primera línea de defensa frente a la ocurrencia de brotes de las enfermedades virales. El desarrollo y adopción de esta metodología supone un aporte que contribuiría a mejorar la gestión de la calidad por parte de empresas productoras y distribuidoras de semillas o propágulos asexuales, y a las agencias gubernamentales reguladoras del comercio internacional de estos productos con la finalidad de disminuir los riesgos y reducir el enorme impacto económico, valorado en decenas de millones de euros anuales, en pérdidas directas e indirectas, que implica la emergencia y dispersión de los virus en las economías de los países afectados. / Rangel Aranguren, EA. (2015). Desarrollo de métodos moleculares de detección de virus de RNA de cultivos hortícolas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58269

There are many options when it comes to performing DNA quantitation. One of the most common is performing a quantitative polymerase chain reaction (qPCR), though cell enumeration may also provide an alternate pathway. In this study, a traditional qPCR approach was compared to a semi-automated cell enumeration method using the MetaSystems Metafer software to assess if there were differences in the DNA estimations between the two. A 1:100 and 1:500 dilution were prepared from four different aliquots of the same semen sample. Twelve samples of each were quantitated using cell enumeration and twelve using qPCR. Two procedure reviews were also performed to assess reproducibility between Metafer scans and the validity of the dilution and extraction procedure. The results revealed both inter- and intra-method variation which may have arisen for a variety of reasons, including lack of reproducibility in semen pipetting, method-specific considerations, and human error. The differences in DNA quantities between the two methods were found to be statistically significant (p < 0.0001 for all except the 1:100 dilution from aliquot C where p < 0.01 and the 1:100 dilution from aliquot D where p < 0.0005). The average ratio of qPCR quantities to cell enumeration quantities was 3.69 for the 1:100 dilution and 2.15 for the 1:500 dilution.

São freqüentes alterações em vias de sinalização de genes de desenvolvimento, no que diz respeito ao carcinoma epidermóide de boca (CEB). Vinte e nove casos de CEB e tecido não tumoral adjacente à neoplasia foram investigados através da técnica de hibridização “in situ". Os transcritos dos genes WNT5A e HOXB5 foram observados em todos os casos de tumor. A hibridização “in situ" revelou que o WNT5A estava mais expresso em tumores bem diferenciados. Adicionalmente, observou-se transcritos do WNT5A em glândulas salivares menores, estroma glandular, estroma tumoral e alguns vasos sanguíneos Entretanto, com respeito ao HOXB5 não foi possível estabelecer mudança do padrão do transcrito nos diferentes graus histológicos nas amostras de CEB. O HOXB5 também pôde ser identificado em alguns fragmentos de glândulas salivares menores, tecido muscular e em endotélio. Os resultados do presente estudo sugerem que a expressão dos genes WNT5A e HOXB5 podem estar relacionadas com a diferenciação e progressão do câncer de boca. / Disruption in developmental genes pathway are common in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study investigated the pattern of expression of two developmental genes, WNT5A and HOXB5, in 29 cases of OSCC and adjacent non tumoural tissue using in situ hybridization technique. Transcripts for WNT5A and HOXB5 were detected in all tumoral samples. In situ hybridization technique demonstrated that WNT5A transcripts were mainly detected in well differentiated tumors when compared with moderately and undifferentiated OSCC. WNT5A transcripts were also observed in accessory salivary glands, glandular stroma, and vessels. Therefore, for the HOXB5 transcript it was not possible to stability a relationship with the tumoral histological grade. The expression of HOXB5 transcripts in non tumoral samples was detected in salivary glands, glandular stroma, endothelium, and muscle. Results suggest that WNT5A and HOXB5 genes play a possible role in tumor differentiation and cancer progression.

A dengue é uma doença infecciosa de transmitida pela picada de mosquitos do gênero Aedes. O vírus da dengue (DENV), pertencente ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, é atualmente um importante problema de saúde pública em todo o mundo. São reconhecidos quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, -2, -3 e -4). A doença causada por qualquer um dos sorotipos cursa de forma assintomática ou com quadro clínico que varia desde uma febre indiferenciada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves de febre hemorrágica da dengue (DHF). O diagnóstico clínico é difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a cargo do laboratório o diagnóstico definitivo. Os métodos sorológicos para detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir do sexto dia do início dos sintomas. Os métodos moleculares estão sendo cada vez mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis que a sorologia e o isolamento viral. Neste estudo comparamos a sensibilidade de uma RT-PCR em tempo real gênero específica com um ELISA para detecção da proteína NS1 comercialmente disponível analisando amostras de soro de pacientes com dengue. Também foram desenvolvidos dois protocolos de RT-PCR em tempo real para identificação do sorotipo viral, uma contendo primers para extremidade 5 do genoma viral e outra contendo primers para a região codificadora da proteína NS5. A RT-PCR em tempo real gênero específica mostrou-se mais sensível que o ELISA, principalmente nas amostras que apresentavam baixa carga viral. A RT-PCR em tempo real contendo os primers para a extremidade 5 apresentou uma sensibilidade baixa quando comparada com a RT-PCR genérica, porém foi mais sensível que aquela contendo os primers para a região codificadora da proteína NS5. Considerando os resultados obtidos, sugerimos uma estratégia de triagem dos casos suspeitos de dengue utilizando a RT-PCR genérica para posteriormente identificar o sorotipo viral com o protocolo que utiliza os primers da extremidade 5. Embora este último protocolo tenha sido pouco sensível, a identificação do sorotipo infectante em algumas amostras é suficiente para definir qual o sorotipo circulante durante uma epidemia. / Dengue is an infectious disease transmitted by the biting of mosquitoes of Aedes genus. Dengue virus (DENV), belonging to the Flavivirus genus, Flaviviridae family, is an important public health problem worldwide. Four antigenically distinct viruses are recognized (DENV-1, -2, -3, e -4). Infection with any of the virus serotypes causes a spectrum of the illness ranging from inapparent or mid viral syndrome to classic dengue fever (DF) and severe hemorrhagic disease (DHF). The clinical diagnosis is difficult especially in the acute phase of the disease when the symptoms are very similar to other febrile illness, corresponding to the laboratory the definitive diagnosis. Serological methods detecting antibodies IgM/IgG are the more widely used; however, they are inappropriate for early diagnosis since these methods detect antibodies after six day of the onset of symptoms. The molecular methods are more frequently used for the early diagnosis because they are faster and more sensitive than serological methods and virus isolation. In this study, we have compared the sensitivity of a generic real time RT-PCR with a commercial ELISA for the NS1 protein analyzing serum samples from patients with dengue virus infection. We have also developed two protocols of real time RT-PCR to identify dengue serotype, one of them containing primers to the 5 end and the other, primers to the NS5 coding region. The generic real time RT-PCR showed to be more sensitive than the ELISA, principally, between the samples with low viral load. The real time RT-PCR containing primers to the 5 end showed a lower sensitivity than the generic real time RT-PCR; however, it was more sensitive than that containing primers to the NS5 coding region. Considering these results, we suggest the use of the generic real time RT-PCR to screen the dengue suspected cases and then to identify the serotype using the protocol that include the primers to the 5 end. Although the last protocol has shown a low sensitive, the identification of the infecting serotype in some of the samples is enough to define which serotype is circulating during the epidemic period.

A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial afetando homens e diversas espécies animais. Levantamentos sorológicos indicam elevados índices de infecção, porém relatos de doença severa é rara. A infecção pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune mediada pelo interferon-&#947; (IFN-&#947;) que rapidamente controla a multiplicação parasitária. Com o objetivo de explorar a resistência da espécie suína à toxoplasmose como modelo de estudo para a compreensão dos mecanismos de defesa a infecção, foram realizadas infecções orais com 4,5 x 105; oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplênico (LN HS), mesentérico (LN M) e íleo-cólico (LN IC), fígado, sangue, íleo, jejuno, baço e timo aos 2, 4, 7 e 14 dias pós-infecção (DPI). Analisou-se a expressão de 69 genes ligados a resposta de defesa às infecções pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fígado foram as amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativação enquanto que células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e timo apresentaram reduzida resposta à infecção. A expressão e a produção de IFNG foram mais altas nas amostras de LN M e LN HS comparadas às amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP, indicando diferentes níveis de resposta local. Intensa indução de resposta inata e inflamatória foi observada em vários tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; estimulação de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expressão de citocinas regulatórias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente indução de ARG1, INDO and SLC11A1 indica ativação de mecanismos de proteção do hospedeiro envolvendo metabolismo de aminoácidos (arginina, triptofano) e ferro. A presença de parasitas foi detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoquímica. Aumento do número de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatória, edema e necrose tecidual no 7DPI principalmente no fígado e no LN M. Elevados níveis de AST sérico no 7DPI confirmam a lesão de hepatócitos. A diminuição da inflamação e da quantidade de parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferação parasitária. Elevados níveis de haptoglobina e óxido nítrico séricos detectados aos 4DPI (&#945;=0,05) indicam respectivamente a ativação de proteínas de fase aguda e de macrófagos. A análise de citometria de fluxo mostra elevação da porcentagem de células CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de células NK e não foram observadas alterações na porcentagem de células CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A estimulação na expressão gênica, a produção de IFN-&#947;, as determinações séricas e lesões histológicas apresentam padrão similar, com início de resposta no 2DPI, elevação no 4DPI e 7DPI e diminuição no 14DPI. A análise da expressão de mRNA nos tecidos revelou alguns dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infecção pelo T. gondii. Observou-se uma equilibrada ativação de citocinas pró- e anti-inflamatórias envolvendo uma intrincada rede de mecanismos co-estimulatórios e regulatórios coordenando a resposta do tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-&#947; dominated immune response that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts (VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN), liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC) and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response. Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1 response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan) and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at 7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (&#945;=0.05) indicate acute phase protein and macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-&#947; production, serum determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI, increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC)

Para determinação da ocorrência de transmissão transplacentária da Theileria equi em neonatos eqüinos foram avaliados 50 potros da raça Puro Sangue Lusitano, machos e fêmeas, bem como suas respectivas mães, logo após o parto. Foram colhidas amostras de sangue total, tanto das mães como dos neonatos, entre as primeiras cinco horas pós parto para pesquisa de Theileria equi e Babesia caballi através da técnica de RT-PCR. Utilizou-se o kit de detecção baseado no fluofóro intercalante de DNA SYBERgreen. Um total de 46% das éguas apresentaram resultado positivo para Theileira equi e 54% se mostraram negativas, enquanto que 66% dos potros apresentaram resultados positivos e 34% negativos, sendo que 73,9% dos potros positivos nasceram de mães também positivas. Já para Babesia caballi, 16% das éguas foram positivas e 84% negativas, assim como 2% dos potros foram positivos e 98% negativos. O teste de RT-PCR é bastante sensível e específico, mas pode resultar em falso negativo, apesar de ser eficaz na detecção da Theileria equi e Babesia caballi nos eqüinos. Estes dados permitem concluir que existe a possibilidade de transmissão transplacentária de Theileria equi. / The occurrence of transplacentary transmission of Theileria equi in horses was determined by evaluating 50 young male and female horses of the breed Lusitano Horses as well as their respective mothers. Colts and fillies were evaluated as soon as they were born. Total blood samples were collected from both mother and offspring within the first five hours right after the parturition to analyse Theileria equi and Babesia caballi through the RT-PCR technique. It was used the kit of detection based on DNA SYBERgreen. This study showed us that 46% of the female horses had positive results for Theileira equi and 54% negative results while 66% of the male horses had positive results and 34% of them, negative ones. Moreover, 73.9% of the positive young horses also had their mothers positive. However, for Babesia caballi 16% of the female horses had positive results and 84% negative ones while 2% of the male horses had positive results and 98%, negative ones. The RT-PCR test is very sensitive and specific but it can occur false-negative results although it is efficient in detecting Theileria equi and Babesia caballi in horses. In conclusion, the data show us that there is a possibility of transplacentary transmission of Theileria equi.

A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial afetando homens e diversas espécies animais. Levantamentos sorológicos indicam elevados índices de infecção, porém relatos de doença severa é rara. A infecção pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune mediada pelo interferon-&#947; (IFN-&#947;) que rapidamente controla a multiplicação parasitária. Com o objetivo de explorar a resistência da espécie suína à toxoplasmose como modelo de estudo para a compreensão dos mecanismos de defesa a infecção, foram realizadas infecções orais com 4,5 x 105; oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplênico (LN HS), mesentérico (LN M) e íleo-cólico (LN IC), fígado, sangue, íleo, jejuno, baço e timo aos 2, 4, 7 e 14 dias pós-infecção (DPI). Analisou-se a expressão de 69 genes ligados a resposta de defesa às infecções pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fígado foram as amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativação enquanto que células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e timo apresentaram reduzida resposta à infecção. A expressão e a produção de IFNG foram mais altas nas amostras de LN M e LN HS comparadas às amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP, indicando diferentes níveis de resposta local. Intensa indução de resposta inata e inflamatória foi observada em vários tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; estimulação de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expressão de citocinas regulatórias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente indução de ARG1, INDO and SLC11A1 indica ativação de mecanismos de proteção do hospedeiro envolvendo metabolismo de aminoácidos (arginina, triptofano) e ferro. A presença de parasitas foi detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoquímica. Aumento do número de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatória, edema e necrose tecidual no 7DPI principalmente no fígado e no LN M. Elevados níveis de AST sérico no 7DPI confirmam a lesão de hepatócitos. A diminuição da inflamação e da quantidade de parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferação parasitária. Elevados níveis de haptoglobina e óxido nítrico séricos detectados aos 4DPI (&#945;=0,05) indicam respectivamente a ativação de proteínas de fase aguda e de macrófagos. A análise de citometria de fluxo mostra elevação da porcentagem de células CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de células NK e não foram observadas alterações na porcentagem de células CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A estimulação na expressão gênica, a produção de IFN-&#947;, as determinações séricas e lesões histológicas apresentam padrão similar, com início de resposta no 2DPI, elevação no 4DPI e 7DPI e diminuição no 14DPI. A análise da expressão de mRNA nos tecidos revelou alguns dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infecção pelo T. gondii. Observou-se uma equilibrada ativação de citocinas pró- e anti-inflamatórias envolvendo uma intrincada rede de mecanismos co-estimulatórios e regulatórios coordenando a resposta do tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-&#947; dominated immune response that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts (VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN), liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC) and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response. Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1 response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan) and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at 7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (&#945;=0.05) indicate acute phase protein and macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-&#947; production, serum determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI, increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC)

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ilia Gilmara Carvalho.pdf: 530450 bytes, checksum: 50f84ac4bf26a69a84cf2a4b2a031978 (MD5) Previous issue date: 2008-12-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The study had for objective the detection and typing of the dengue virus, in the vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus through the Polimerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. During the period of December of 2005 to December of 2006 8984 mosquitoes were collected, of these 827 they were Aedes, being 819 Ae. aegypti (414 females and 405 males) and 8 Ae. albopictus (7 females and 1 male), in 46 neighborhoods of the city of Manaus including all of the geographical areas of the city. The females were grouped in pools from 1 to 10 mosquitoes for microtubes, in agreement with the gender, it dates from collection, neighborhood and stocked to -70C in the same day of the collection, totaling 143 pools (138 of Ae. aegypti and 5 of Ae. albopictus). Those pools were macerated in PBS containing albumin, and a bracket of the softened was removed for inoculation in cell culture, and other bracket was used to accomplish the extraction of the viral RNA. Once extracted, RNA was submitted the reaction of reverse transcription following by the chain reaction of the polimerase (RT-PCR). The positive samples in RT-PCR were submitted the reaction of semi nested PCR and the products of this reaction were resolved in agarose gel to 1,5% with etídio bromide. Of the 143 analyzed pools, 114 (111 of Ae. aegypti and 3 of Ae. albopictus) they were positive for DENV 3, just a pool was shown positive for two sorotipos, DENV 1 and DENV 3. The prevalence pools Ae. aegypti infected with DENV 3 in the city of Manaus was of 53%, being larger in the areas Center-west (70%), South (60%) and West (53%), and smaller in the area East (23%). This is the first report of the detection of DENV 3 in field-caught Ae. albopictus naturally infected in Brazil. The monitoring of the circulation viral in mosquitoes with the use of the technique of RT-PCR allows the previous knowledge of the levels of spread viral in certain areas contributing to determine the time and place to apply the prevention measures and control. / O estudo teve por objetivo a detecção e tipagem do vírus dengue, nos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando primers específicos. Durante o período de Dezembro de 2005 a Dezembro de 2006 foram coletados 8984 mosquitos, destes 827 eram Aedes, sendo 819 Ae. aegypti (414 fêmeas e 405 machos) e 8 Ae. albopictus (7 fêmeas e 1 macho), em 46 bairros da cidade de Manaus abrangendo todas as zonas geográficas da cidade. As fêmeas de Ae. aegypti e Ae. albopictus foram agrupadas em pools de 1 a 10 mosquitos por microtubos, de acordo com o gênero, data de coleta, bairro e estocado a -700C no mesmo dia da coleta, totalizando 143 pools (138 de Ae. aegypti e 5 de Ae. albopictus). Esses pools foram macerados em PBS contendo albumina, e uma alíquota do macerado foi retirada para inoculação em cultura de célula, e outra alíquota foi utilizada para realizar a extração do RNA viral. Uma vez extraído, o RNA foi submetido a reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As amostras positivas na RT-PCR foram submetidas a reação de Semi Nested PCR e os produtos desta reação foram resolvidos em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio. Dos 143 pools analisados, 114 (111 de Ae. aegypti e 3 de Ae. albopictus) foram positivos para DENV 3, apenas um pool mostrou-se positivo para dois sorotipos, DENV 1 e DENV 3. A prevalência de mosquitos Ae. aegypti infectados com DENV 3 na cidade de Manaus foi de 80%. Em todas as zonas a prevalência foi maior que 53%, sendo maior nas zonas Centro-oeste (70%), Sul (60%) e Oeste (53%), e menor na zona Leste (23%). Este foi o primeiro achado no Brasil da identificação do DENV 3 em amostras de Ae. albopictus , coletados em campo na forma adulta. O monitoramento da circulação viral em mosquitos com o uso da técnica de RT-PCR permite o conhecimento prévio dos níveis de disseminação viral em determinadas áreas contribuindo para determinar a época e local para aplicar as medidas de prevenção e controle.

São freqüentes alterações em vias de sinalização de genes de desenvolvimento, no que diz respeito ao carcinoma epidermóide de boca (CEB). Vinte e nove casos de CEB e tecido não tumoral adjacente à neoplasia foram investigados através da técnica de hibridização “in situ”. Os transcritos dos genes WNT5A e HOXB5 foram observados em todos os casos de tumor. A hibridização “in situ” revelou que o WNT5A estava mais expresso em tumores bem diferenciados. Adicionalmente, observou-se transcritos do WNT5A em glândulas salivares menores, estroma glandular, estroma tumoral e alguns vasos sanguíneos Entretanto, com respeito ao HOXB5 não foi possível estabelecer mudança do padrão do transcrito nos diferentes graus histológicos nas amostras de CEB. O HOXB5 também pôde ser identificado em alguns fragmentos de glândulas salivares menores, tecido muscular e em endotélio. Os resultados do presente estudo sugerem que a expressão dos genes WNT5A e HOXB5 podem estar relacionadas com a diferenciação e progressão do câncer de boca. / Disruption in developmental genes pathway are common in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study investigated the pattern of expression of two developmental genes, WNT5A and HOXB5, in 29 cases of OSCC and adjacent non tumoural tissue using in situ hybridization technique. Transcripts for WNT5A and HOXB5 were detected in all tumoral samples. In situ hybridization technique demonstrated that WNT5A transcripts were mainly detected in well differentiated tumors when compared with moderately and undifferentiated OSCC. WNT5A transcripts were also observed in accessory salivary glands, glandular stroma, and vessels. Therefore, for the HOXB5 transcript it was not possible to stability a relationship with the tumoral histological grade. The expression of HOXB5 transcripts in non tumoral samples was detected in salivary glands, glandular stroma, endothelium, and muscle. Results suggest that WNT5A and HOXB5 genes play a possible role in tumor differentiation and cancer progression.