La bactérie Gram négative Pseudomonas aeruginosa produit un grand nombre d’exoprotéines remplissant de multiples fonctions. Pour rejoindre la surface ou le milieu extracellulaire, ces exoprotéines doivent franchir successivement la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. De multiples systèmes de sécrétion ont été mis en place par P.aeruginosa pour réaliser ces différentes étapes. Ainsi, les exoprotéines peuvent traverser l’enveloppe par le système le plus approprié à leur transport. Un de ces systèmes, le système de sécrétion de type II (T2SS) est présent en deux exemplaires. Ces deux T2SS, complets et fonctionnels ont été appelés Xcp (« extracellular deficient protein ») et Hxc (« Homologue toXcp »). Si les éléments constitutifs des T2SSs sont bien identifiés, leur assemblage au sein de l’enveloppe ainsi que leur mode de sécrétion sont très peu documentés. Le modèle communément admis suggère cependant l’existence d’une plateforme de membrane interne, d’un composant demembrane externe et d’un pseudopilus, qui va tel un piston, pousser les substrats au travers du pore formé par l’unique composant de membrane externe, la sécrétine. Les sécrétines formentdans la membrane externe de larges pores homo-multimériques de 12 à 14 monomères.L’adressage et l’assemblage de telles structures nécessitent en général l’implication d’une petite lipoprotéine, connue sous le nom de pilotine. A ce jour, aucune protéine de ce type n’est connue pour assister les multiples sécrétines répertoriées chez P. aeruginosa dans leur adressage à lamembrane externe. Ce travail de thèse à principalement porté sur le second T2SS de P.aeruginosa, le système Hxc. Nous avons en particulier démontré que la sécrétine du système Hxc,HxcQ ne dépendait d’aucune pilotine pour son adressage à la membrane externe et que cette sécrétine était une lipoprotéine dont l’ancre lipidique N-terminale jouait le rôle de pilotine. / The Gram negative bacteria Pseudomonas aeruginosa produces a large number of exoproteins that have multiple functions. To reach the cell surface or the extracellular medium, an exoprotein must successively cross the inner membrane, the periplasm and the outer membrane.P. aeruginosa has developed a number of secretion systems that carry out these different steps.Thus, a specific exoprotein will cross the envelope using the most suitable secretion system. Oneof these systems, the type II secretion system (T2SS), is present in two copies on the P.aeruginosa genome. Both T2SS are complete and functional, and have been named Xcp(« extracellular deficient protein ») and Hxc (« Homologue to Xcp »). While the different components that make up each T2SS have been clearly identified, their assembly in the envelopeand their mode of secretion are poorly documented. Nevertheless, the commonly acceptedworking model suggests the existence of an inner membrane platform, a component in the outer membrane, and a pseudopilus which, acting as a piston, pushes the substrate through a pore formed by the sole component of the outer membrane, the secretin. Secretins form large homomultimeric pores (12 to 14 monomers) in the outer membrane. Targeting and assembly ofsuch structures requires the involvement of a small lipoprotein known as pilotin. To date, no suchprotein is known to assist the targeting of P. aeruginosa secretins to the outer membrane. This thesis work has mainly focused on the second T2SS of P. aeruginosa, the Hxc system. One of ourmajor findings is that the outer membrane targeting of the Hxc secretin, HxcQ, does not dependon any pilotin, but that instead HxcQ is a lipoprotein with a lipid anchor that acts as a pilotin.

Les protéines synthétisées et sécrétées par les bactéries jouent des rôles importants pour leur survie. Les bactéries à Gram négatif ont développé des voies de sécrétion en tant qu'armes principales pour transporter des facteurs de virulence dans l'environnement extracellulaire ou dans des cellules hôte. L'un de ces systèmes, le T9SS a été principalement étudié chez l'agent pathogène oral Porphyromonas gingivalis et chez la bactérie mobile Flavobacterium johnsoniae. Un autre complexe, le T2SS est le principal déterminant de la virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène de la fibrose kystique. Dans le cadre de ma thèse, j'ai résolu la structure atomique de plusieurs composants centraux du T9SS et du T2SS. Concernant le projet T9SS, j'ai essayé de cristalliser le domaine cytoplasmique de GldL de F. johnsoniae. La co-cristallisation de GldL avec des Nbs a été réalisée sans succès. Néanmoins, les structures cristallines de deux nanobody contre GldL ont été résolues par remplacement moléculaire. De plus, j'ai également travaillé sur la protéine PG1058 de P. gingivalis. J'ai résolu sa structure par diffraction anomale à la longueur d’onde du selenium. Concernant le projet T2SS, je me suis concentré sur la partie N-terminale de XcpQ, une sous-unité de la sécrétine. J'ai résolu la structure cristalline de XcpQN012 seul et en complexe avec le nanobody vhh04 à une résolution de 2,98 Å et de 2,9 Å, respectivement. Enfin, j'ai participé à la détermination structurale de TssK, un composant de plaque de base du système de T6SS et déterminer la structure cristalline d'un nanobody contre le domaine périplasmique de PorM. / Proteins synthesized and secreted by bacteria serve many important roles in their survival. In particular, Gram-negative bacteria have evolved secretion pathways as the main weapons for transporting virulence factors into target cells or into the extracellular environment. One of these systems, the type IX secretion system (T9SS) or the Por secretion system, has been studied mainly in the oral pathogen Porphyromonas gingivalis and the gliding bacterium Flavobacterium johnsoniae. Another complex, the type II secretion system (T2SS) is the main determinant of the virulence of Pseudomonas aeruginosa, a cystic fibrosis pathogen. In my PhD thesis, I solved the atomic structure of several core components of both T9SS and T2SS.For the T9SS project, I tried to crystallize the cytoplasmic domain of GldL from F. johnsoniae. The co-crystallization of GldL with Nbs was unsuccessfull. The crystal structures of two nanobodies against GldL were solved by molecular replacement. I also worked on the PG1058 protein of P. gingivalis. I obtained crystals of the selenomethionine-derivatized PG1058 OmpA_C-like domain that diffracted up to 1.55 Å, and solved its structure by single-wavelength anomalous diffraction. For the T2SS project, I focused on the N-terminal part of XcpQ, a subunit of the secretin. I solved the crystal structure of XcpQN012 alone and in complex with nanobody vhh04 at a resolution of 2.98 Å and 2.9 Å, respectively. In addition, I also took part in the structural determination of the base plate component TssK of the T6SS and determined the crystal structure of one nanobody (vhh19) against the periplasmic domain of PorM.

La souche de P. aeruginosa PA14 est un isolat humain hautement virulent. PA14 possède deux îlots de pathogénicité. L'îlot de pathogénicité PAPI-1 de 108 kb est un élément intégratif et conjugatif (ICE), capable de s'auto-transférer à des souches de Pseudomonas par un mécanisme de conjugaison. Le mécanisme de transfert fait intervenir un pilus de Type IVb, encodé dans l'îlot PAPI-1. Mon travail de doctorat a eu pour but de caractériser à un niveau moléculaire le pilus de Type IVb (Pil-PAPI-1). J'ai d'abord, inséré un promoteur constitutif en place du promoteur endogène pour activer l'expression du locus pil2. J'ai démontré que 9 des 10 gènes sont requis pour le transfert d'ADN. J'ai ensuite initié la caractérisation de composants formant la machine de conjugaison. J'ai caractérisé le produit des gènes pilL2 et pilN2. J'ai démontré que PilL2 est une protéine de membrane externe (ME) et exposée dans le périplasme. Cette protéine est essentielle pour la fonctionnalité (transfert d'ADN) de la machinerie de conjugaison. Malgré ses caractéristiques prédites de lipoprotéine, aucune des mutations réalisées n'a pu modifier la localisation de ME de PilL2. J'ai aussi démontré que PilL2 forme un sous complexe de ME avec PilN2, la sécrétine du système. PilN2 forme des multimères stable, et présente les caractéristiques d'une liposécretine, capable d'auto-insertion et d'auto-multimérisation dans la ME. J'ai démontré que le N-ter de PilN2 mature est critique pour la formation d'un pore fonctionnel, mais n'est pas impliqué dans l'interaction avec PilL2. Ces résultats suggèrent que PilL2 et PilN2 forment un nouveau type de sous complexe de ME dans la famille des TFPb. / The P. aeruginosa PA14 strain is a highly virulent human isolate. PA14 possesses two pathogenicity islands. The 108-kb pathogenicity island PAPI-1 is an integrative and conjugative element (ICE), capable of self-transferring to any recipient Pseudomonas strain, by a conjugative mechanism. The transfer mechanism is mediated by a Type IVb pilus, encoded within the PAPI-1 Island. My PhD work aimed to characterize this Type IVb pilus (Pil-PAPI-1) at a molecular level. The pil2 locus is poorly expressed under laboratory condition. I, first, introduced a constitutive promoter to turn on expression of the pil2 locus. I demonstrated that 9 of the 10 genes are required for DNA transfer. Then, I initiated the characterization of components forming the conjugation machinery. I characterized the products of pilL2 and pilN2 genes. I demonstrated that PilL2 is an OM protein and protruding in the periplasm. This protein is essential for the functionality (DNA transfer) of the conjugative TFPb machinery. Despite its predicted lipoprotein-hallmarks, none of the mutations engineered were able to abrogate the OM-localization of PilL2. We also demonstrated that PilL2 forms an OM sub-complex with PilN2, the secretin of the system. We provide evidence that PilN2 forms stable multimers, which presents the features of a liposecretin, capable of self-insertion and self-multimerization in the OM. We demonstrated that while the N-terminus of the mature PilN2 is required for the formation of a functional pore, it is not involved in interaction with PilL2. These results suggest that PilL2 and PilN2 could form new type of OM sub-complex in the TFPb family.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS / The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur. / Ischaemic heart disease, the most common cause of heart disease, is still today a leading cause of mortality in industrialized countries. An inflammatory cardiometabolic response to acute changes elicited by energetic substrate shift in the ischemic heart is amplified once the oxygen supply is reinstated. Resulting deleterious alterations include increased myocardial accumulation of non-esterified fatty acids (NEFA) and their oxidation at the expense of glucose, thus enhancing reactive oxygen species (ROS) generation. Peripheral tissues such as the adipose tissue can affect the extent of myocardial injury by releasing bioactive substances such as adiponectin and NEFA into the circulation. CD36 is the main facilitator of the entry of NEFA in the heart or adipocytes and constitutes an important metabolic target especially during an ischaemia-reperfusion (I/R) stress. It was previously reported by our group that a selective synthetic ligand of CD36 exerts potent protective effects on the vasculature. However, no study has reported the in vivo cardioprotective effects of selective CD36 ligands. Thus, this project aimed to evaluate the role and possibly cardioprotective effects of selective CD36 receptor ligands on myocardial I/R injury. CD36+/+ and CD36-/- mice were pretreated with EP 80317, CP-3(iv) or vehicle for 14 days prior to undergoing a transient occlusion of the left anterior descending (LAD) coronary artery. Our first study showed that EP 80317 exerted potent cardioprotective effects as shown by reduced lesion area and ameliorated cardiac function following in vivo myocardial I/R injury. Furthermore, EP 80317 reduced total myocardial NEFA uptake, as assessed by in vivo metabolic cardiac imaging, in agreement with reduced levels of circulating NEFA. Reduced lipolysis revealed by palmitate radiotracer infusion and increased expression levels of adipogenic and anti-lipolytic genes further support an effect of EP 80317 in preventing deleterious fatty acid mobilization from adipose tissue. Our second study investigated the cardioprotective mechanisms of a new generation of ligands with increased affinity towards CD36. This study showed that CP-3(iv) is also endowed of potent cardioprotective effects as shown by reduced infarct area and improved myocardial function following myocardial I/R injury which is mediated by an adiponectin metabolic and anti-oxidative signaling pathway. Indeed, main signaling pathways regulating adiponectin secretion and antioxidative genes were shown to be increased in adipose tissue following myocardial I/R and CP-3(iv) treatment. Myocardial protein kinase B or Akt activation along with reduced ROS generation and cell death signaling further support a cardioprotective role of CP-3(iv) in MI/R. In conclusion, work from this thesis support that CD36 signaling by EP 80317 and CP-3(iv) may constitute a novel therapeutic approach for the treatment of ischemic heart disease. These synthetic CD36 selective ligands provoke salutary effects on ischaemic myocardium by means of an ameliorated metabolic profile in the first hours of reperfusion. EP 80317 reduces deleterious NEFA levels and their uptake into the heart in time of excess, while CP-3(iv) increases beneficial adiponectin level and its cardioprotective effects.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif et est, entre autre, exploité par de nombreux pathogènes pour sécréter des facteurs de virulence dans le milieu extérieur. Le T2SS est constitué de 12 à 15 protéines différentes s’associant en une machinerie complexe qui traverse la totalité de l’enveloppe bactérienne. Ce système assure la sécrétion de protéines repliées du périplasme au milieu extracellulaire. Le mode de fonctionnement de cette machinerie n’est toujours pas connu. Pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la sécrétion des protéines par le T2SS, nous avons utilisé comme modèle le T2SS de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, nommé Out, qui assure la sécrétion de pectinases entrainant la pourriture molle chez de nombreux végétaux. Nous avons employé des approches de pontage disulfure, double hybride bactérien et GST-pull down afin d’étudier l’arrangement et l’organisation des composants au sein du système de sécrétion. Nous avons ainsi montré que les composants de la membrane interne et la sécrétine de la membrane externe se coordonnent entre eux grâce à un réseau d’interactions complexe et dynamique qui peut être modifié par la présence d’une protéine à sécréter. En combinant des approches génétiques, biochimiques, structurales et bioinformatiques, nous avons étudié le mécanisme de reconnaissance de la pectinase PelI, par deux composants majeurs du système, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD qui forme le pore du T2SS dans la membrane externe. Nous avons montré que PelI interagit avec les domaines périplasmiques HR et PDZ d’OutC et N0 et N1 d’OutD. La présence de N1 renforce l’interaction PDZ/PelI suggérant que le processus de sécrétion pourrait être régi par une succession de contacts synergiques. PDZOutC reconnait une boucle de 9 résidus au sein de l’exoprotéine PelI. Cette boucle constitue un motif d’adressage spécifique contrôlant le recrutement de PelI par la machinerie de sécrétion Out. Des études in silico et in vivo ont montré l’existence de régions similaires à cette boucle au sein d’autres pectinases sécrétées par D. dadantii. Par ailleurs, l’interaction N1OutD/PelI impliquerait un contact de brins β ainsi que la région non structurée située en amont de N1. Ces travaux constituent la première démonstration expérimentale du rôle de signal de sécrétion d’un élément structural précis d’une exoprotéine sécrétée par un T2SS. Ils ont également permis pour la première fois de caractériser des sites précis d’interactions entre une protéine sécrétée et des composants du T2SS. Cette étude constitue une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui gouvernent le recrutement et la sécrétion des protéines par le système de type II. / The type II secretion system (T2SS) is widespread in Gram-negative bacteria. It is notably exploited by various pathogenic bacteria to secrete virulence factors into the extracellular milieu and host tissues. The T2SS is composed of 12 to 15 proteins that assemble together into a complex machine that spans the bacterial envelope. It allows the translocation of fully folded proteins from the periplasm across the outer membrane. The exact mode of action of this sophisticated machine is still unknown. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii uses a T2SS, named Out, to secrete several plant cell-wall degrading enzymes that cause the soft rot disease of many plants. We used the Out system of this bacterium as a model to study the molecular mechanism of protein secretion by T2SS. In order to study the mutual arrangement of the different components of this machinery, we used disulfide bonding, bacterial two hybrid and GST-pull down. We showed that the components of the inner membrane platform interact together and we characterized several interfaces between the inner membrane component OutC and the outer membrane secretin OutD. These various contacts create a complex and dynamic network within the secretion machine that can be modulated by the presence of a protein to be secreted. Subsequently, we combined genetic, biochemical, structural and bioinformatics approaches to study how the pectinase PelI is recognized by the inner membrane component OutC and the pore-forming secretin OutD. We showed that PelI interacts with the periplasmic domains HR and PDZ of OutC and N0 and N1 of OutD. The presence of N1OutD positively modulates the PDZ/PelI interaction, suggesting that protein progression through the T2SS could involve a succession of synergistic contacts. The OutC PDZ domain recognizes a short loop of PelI. This loop acts as a specific secretion signal that controls exoprotein recruitment by the T2SS. Concerted in silico and in vivo approaches suggest the occurrence of equivalent secretion motifs in other exoproteins. The interaction between PelI and OutD could involve a β-strand contact and an intrinsically disordered region located upstream of N1. This work provides the first experimental evidence of molecular mechanisms that govern exoprotein recruitment by the T2SS. Notably, we identified a short structural element acting as a secretion signal and characterized for the first time the interfaces between the T2SS components and a protein to be secreted. This study provides important new mechanistic insights to understand the functioning of this secretion machine.