Les muqueuses représentent la principale voie de contamination par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) indiquant qu'une protection au niveau des muqueuses serait nécessaire dans la prévention et le développement d'un vaccin efficace. La prise en charge du VIH-1 par l'intermédiaire de la gp120 se fait, grâce à des lectines de type C, au niveau de la muqueuse par les cellules de Langerhans (Langerine) et au niveau de la sous-muqueuse par les cellules dendritiques (DC-SIGN). Notre but était d'analyser la présence d'anticorps capables de bloquer l'interaction entre le virus et les lectines. Nous avons développé des tests spécifiques pour l'étude de la liaison de la gp120 du VIH-1 avec la Langerine et le DC-SIGN. Grâce à ces tests, nous avons pu caractériser des anticorps, dirigés contre la Langerine ou le DC-SIGN, permettant le blocage de la fixation de la gp120 sous forme conformationnelle. Nous avons utilisé ces tests validés pour étudier la fréquence d’anticorps bloquants dans le sérum de 110 individus séropositifs et 30 individus séronégatifs. Seulement peu de sujets infectés ont développé ce genre d'anticorps durant l'infection par le VIH-1. Nous avons pour la première fois décrit des anticorps bloquants chez des sujets séropositifs avec la capacité potentielle d’interférer dans la transmission des particules virales aux cellules dendritiques. Ces résultats permettent d'espérer la conception de nouvelles stratégies pour bloquer la transmission du VIH-1 au niveau des muqueuses et prévenir la dissémination du virus. Ces tests permettront de doser l'inhibition de la liaison de la gp120 soit à la Langerine soit au DC-SIGN et d'étudier différentes cohortes de sujets séropositifs et séronégatifs mais fortement exposés (HEPS) / Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is primarily transmitted sexually through mucosal surfaces, indicating that protection at mucosal sites may be crucial in prevention and in the development of an effective conventional vaccine against HIV-1. The HIV-1 gp120 is recognized by the C-type lectins of Langerhans cells (LCs), Langerin, in the mucosa and by the C-type lectins of dendritic cells (DCs), DC-SIGN in the sub-mucosa. Our aim was to analyze the presence of antibody able to block HIV / Lectins interactions. We have developed specific assays for the study of the binding of HIV-1 gp120 on human Langerin and DC-SIGN. With these assays, we have been able to characterize specific DC-SlGN and Langerin antibodies able to block fixation of conformational gp120 envelope protein. We have used our validated assays to monitor the prevalence of blocking antibodies in the sera of one hundred and ten HIV-1-infected individuals and thirty HIV-1 non-infected individuals. Only few patients have developed such type of antibodies during their infection. This is the first report which describes blocking antibodies in patients with the potential capacity to interfere during the mucosal transmission of HIV particles to mucosal DCs. The results provide a framework for the design of effective strategies to block local transmission and prevent HIV-1 spread. These tests will allow the measuring of the inhibition of gp120 binding to langerin or to DC-SIGN and the screening of different cohorts of HIV-1 positive subjects and HIV-1 negative but highly exposed subjects (HEPS)

Parmi les cinq isotypes d’anticorps présents chez l’Homme, les immunoglobulines A (IgA) prédominent dans les muqueuses. Les IgA sont produites dans le chorion sous forme majoritairement polymérique (pIgA) et sécrétées dans la lumière des muqueuses. Leur transport trans-épithélial est assuré par le récepteur aux immunoglobulines polymériques (pIgR), exprimé au pôle basal des épithéliums. Les pIgA ainsi sécrétées conservent le domaine extracellulaire du pIgR et sont appelées IgA sécrétoires (SIgA). Une fonction essentielle des SIgA intestinales est de maintenir microorganismes et antigènes alimentaires dans la lumière des muqueuses afin d’empêcher leur pénétration dans l'organisme. Néanmoins, la transcytose inverse des SIgA couplées à des bactéries a été décrite dans les plaques de Peyer où elle participe à la génération de la réponse immune contre ces bactéries. En outre, les travaux passés du laboratoire ont suggéré que le récepteur de la transferrine (CD71), surexprimé au pôle apical des entérocytes chez les patients cœliaques, interagit avec les SIgA couplées à des peptides de gliadines et permet leur transcytose inverse à travers l’épithélium intestinal. Ce travail de thèse a eu pour objectif de mieux caractériser l’interaction SIgA-CD71 dans les entérocytes humains. Dans un premier temps, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour générer une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2 TC7) dépourvue du récepteur CD71 (CD71KO). De manière inattendue, nous n’avons observé aucune altération de la fixation des SIgA sur les cellules Caco-2 CD71KO. Ce résultat nous a amenés à réévaluer le rôle de CD71 comme récepteur aux SIgA. Dans un second temps, nous avons vérifié et confirmé que les SIgA interagissent avec CD71, mais nous avons montré que cette interaction est indirecte. Nous avons ensuite criblé les récepteurs aux IgA déjà décrits dans la littérature et montré qu'aucun n'est responsable de la fixation des SIgA à la surface des cellules Caco-2 TC7. Ces résultats nous ont amenés à chercher le(s) autre(s) partenaire(s) du complexe SIgA-CD71. Par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié les protéines Secretory Carrier Membrane Protein 3 (SCAMP3), B-Cell Receptor-Associated Protein 31 (BCAP31) et Histocompatibility minor 13 (HM13) comme membres du complexe SIgA-CD71. En nous appuyant à nouveau sur la technologie CRIPSR-Cas9, nous avons montré qu’aucun de ses partenaires n’interagit directement avec les SIgA. Néanmoins, nos résultats suggèrent que SCAMP3 est nécessaire à l’oligomérisation de surface des complexes de fixation des SIgA. Enfin, l’internalisation des SIgA n'est pas altérée par l’absence de chacun des partenaires du complexe, suggérant que leur rôle advient durant le transport trans-épithélial des SIgA. L’ensemble de nos travaux montre que les SIgA interagissent avec l'épithélium intestinal via un complexe protéique composé d'au moins cinq membres : CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 et le(s) récepteur(s) inconnu(s) aux SIgA. Ces résultats complètent les travaux antérieurs sur le rôle physiopathologique des SIgA dans la maladie cœliaque et contribuent à souligner la complexité des interactions entre IgA et entérocytes. Une question importante sera d’identifier le(s) récepteur(s) aux SIgA et de déterminer le rôle des partenaires identifiés dans la transcytose inverse des SIgA par l’entérocyte. / Among the five isotypes of antibodies found in Humans, immunoglobulins A (IgA) are the most abundant in the mucosae. In the lamina propria, IgA are produced mainly as polymeric IgA (pIgA) and then secreted in the lumen. In fact, pIgA are translocated across the epithelium via the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR), which is expressed at the basolateral side of the epithelium. Once secreted in the lumen, pIgA retain the extracellular domain of the pIgR and are called secretory IgA (SIgA). One of the main functions of intestinal SIgA is to restrain microorganisms and dietary antigens in the lumen, therefore, preventing their uptake through the epithelial barrier. However, retrotranscytosis of SIgA conjugated to bacteria has been described in Peyer’s patches where it participates to immune response. Moreover, previous works from the laboratory have suggested that transferrin receptor (CD71), which is overexpressed at the apical side of enterocytes from coeliac patients, interacts with SIgA bound to gliadin peptides and allows their retrotranscytosis across the intestinal epithelium. This thesis work aimed to further characterize the interaction between SIgA and CD71 in human enterocytes. We, first, generated a human epithelial intestinal cell line (Caco-2 TC7) devoid of CD71 expression (CD71KO) using the CRISPR/Cas9 genome editing method. Unexpectedly, flow cytometry experiments did not reveal a significant reduction of SIgA binding at the cell surface of CD71KO cells. Overall, our results indicated that CD71-SIgA interaction is indirect and may occur via additional protein partners through the assembly of a multifactorial protein complex. Therefore, we screened IgA receptors already known in the literature and showed that all are dispensable for SIgA binding at the surface of Caco-2 TC7 cells. In the effort to identify partner(s) within SIgA-CD71 complex, we set out mass spectrometry-based immunoprecipitation proteomics experiments and identified secretory carrier membrane protein 3 (SCAMP3), B-cell receptor-associated protein 31 (BCAP31) and histocompatibility minor 13 (HM13) as members of SIgA-CD71 complex. By generating knockout cell lines with the CRISPR/Cas9 system, we showed that none of these partners directly interacts with SIgA. However, our results suggest that SCAMP3 is required for the oligomerization of SIgA complexes at cell surface. Finally, we did not find any role in SIgA internalization for the different members of the complex, suggesting that they may play a role later on during SIgA retrotranscytosis. In conclusion, our work shows that SIgA interact with the intestinal epithelium via a proteic complex composed of at least five members: CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 and one or more unknown SIgA receptor(s). These results complement the previous works on the pathophysiologic role of SIgA in coeliac disease and underline the highly complex interaction between IgA and enterocytes. An important point to address will be to identify SIgA receptor(s) and to determine the role of the four other identified partners in SIgA retrotranscytosis across the intestinal epithelium.

Les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) sont essentielles pour la fusion membranaire. J'ai étudié chez Arabidopsis thaliana la SNARE Memb11 de l’appareil de Golgi qui intervient au début de la voie sécrétoire à l'interface Réticulum endoplasmique (RE)-appareil de Golgi. Dans les cellules de mammifères, l'orthologue de Memb11 (Membrine) est un « récepteur » potentiel de la GTPase Arf1 à la membrane golgienne. Cette dernière est impliquée dans le recrutement de la machinerie COPI nécessaire au transport rétrograde de l'appareil de Golgi vers le RE. Le but de ce travail était de déterminer si Memb11 pouvait interagir avec Arf1 dans les cellules végétales. Des anticorps dirigés contre la partie cytosolique de Memb11 ont été obtenus et ont été utilisés sur tissus végétaux pour réaliser des immunomarquages en microscopie électronique à transmission et des immunoprécipitations sur extraits de plantes. Il a été démontré que Memb11 est située au niveau de la membrane cis-golgienne et qu'elle co-immunoprécipite avec Arf1, suggérant ainsi que Arf1 peut interagir avec Memb11. J'ai confirmé l'interaction de Memb11 et Arf1 au niveau de l'appareil de Golgi par des expériences de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) in vivo. Cette interaction est spécifique puisque ni Memb12 (90% d'identité avec Memb11) ni Sec22 interagissent avec Arf1. Grâce à une approche de bioinformatique structurale, j'ai déterminé les régions de Memb11 (différentes de Memb12) qui pourraient être critiques pour l'interaction et j’ai commencé à tester in vivo les mutants correspondants par BiFC. En outre, des expériences d’immunoprécipitations avec des protéines recombinantes produites in vitro suggèrent que la forme d’Arf1 liée au GTP interagit avec Memb11. / The SNARE proteins (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) are critical for membrane fusion in the secretory pathway. I have studied the Golgi SNARE Memb11 in Arabidopsis thaliana cells. Memb11 is involved at the ER-Golgi interface. In mammalian cells, the ortholog of Memb11 (Membrin) is the potential “receptor” of the GTPase Arf1 in the Golgi membrane. This protein is involved for the recruitment of the COPI machinery, required for retrograde transport from the Golgi to the ER. The aim of this work was to determine whether Memb11 can interact with Arf1 in plant cells. Antibodies against the cytosolic part of Memb11 were obtained and were applied on plant tissues to perform immunolabeling by transmission electron microscopy and immunoprecipitation (IP) studies. It has been shown that Memb11 is located at the cis-Golgi and that it co-immunoprecipated with Arf1, suggesting that Arf1 may interact with Memb11. I confirmed the interaction of Memb11 and Arf1 at the Golgi by in vivo BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) experiments. This interaction was specific since neither Memb12 (90% identity with Memb11) nor Sec22 interacted with ARF1. Thanks to a structural bioinformatic approach, I determined the regions in Memb11 (different from Memb12) that could be critical for the interaction and started to test corresponding mutants in vivo by BiFC. In addition, IP experiments with recombinant proteins produced in vitro suggest that the GTP-bound form of ARF1 interacts with Memb11.

Les SIgA possèdent la capacité de pouvoir adhérer spécifiquement à la membrane apicale des cellules M présentes au niveau des muqueuses monostratifiées. La capacité des cellules M à transporter les SIgA de la lumière intestinale jusqu'au GALT par un mécanisme de transcytose inverse a également été décrite. J'ai donc souhaité évaluer la capacité des SIgA à transporter efficacement un antigène vaccinal, à travers la barrière épithéliale par l'intermédiaire des cellules M vers les DCs présentes dans le MALT. Le mécanisme exact et notamment la structure moléculaire du récepteur permettant la transcytose inverse des IgA n'a pas été identifiée. Il m’a donc paru intéressant d'améliorer la compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans le transport d'une SIgA de la lumière intestinale jusqu’aux cellules immunitaires sous-muqueuses. Cette étude a permis de démontrer le rôle majeur de deux nouveaux récepteurs présents à la surface des cellules M, la dectine-1 et le siglec-5, dans l'activité physiologique rétrograde des SIgA. Cette étude a permis d'identifier les domaines des SIgA impliqués dans ce mécanisme. J'ai ensuite utilisé les SIgA comme vecteur vaccinal permettant le ciblage des cellules M. Les applications de cette approche à la vaccination par voie orale et nasale sont décrites dans la publication 4 en cours de rédaction. Durant ma thèse, j'ai pu démontrer que la transcytose inverse des SIgA est un mécanisme physiologique dépendant par exemple de récepteurs aux sucres. J'ai pu également démontrer que leur utilisation dans des approches de vaccination muqueuse peuvent être une voie très prometteuse notamment contre le VIH ou d'autres pathogènes muqueux / Secretory IgA (SIgA) are the main effectors of the mucosal immune response. More, SIgA have the capacity to adhere to the apical membrane of M cells present in the intestinal and nasal mucosa. After binding to M cells, SIgA are transported from the intestinal lumen to the GALT by a reverse transcytosis mechanism. In this work, I have assessed the capacity of SIgA to effectively deliver a vaccine antigen through the epithelial barrier via M cells to sub-mucosal dendritic cells (DCs). Precise mechanisms and the IgA-specific receptor(s) for reverse transcytosis have not yet been identified. In this work, I identified the receptors involved in SIgA reverse transcytosis. Both dectin-1 and siglec-5 allow the transport of the Cα1 domain of SIgA by murine an human M cells in vitro and also in vivo. This work is currently undergoing to immunity (publication 1) and should also be patented. Next, I tried to use the reverse transcytosis mechanism mediated by M cells to efficiently deliver an HIV-1 antigen by mucosal routes. We applied results obtained using SIgA as a vaccine vector for M cells targeting. This approach should help to protect antigen in the mucosal environment. Applications of this approach to oral and nasal immunisation are described in the incomplete publication 4. During any PhD, I was able to demonstrate that SIgA reverse transcytosis is a physiological mechanism depending on sugar receptors. I was also able to demonstrate that their use could be a very promising vaccine approach especially for mucosa] diseases or pathogens as HIV

Le développement érythrocytaire de Plasmodium falciparum, l'agent du paludisme, est responsable de tous les symptômes liés à la maladie. Les formes sanguines du parasite possèdent plusieurs organites qui se sont révélés essentiels au développement intra-érythrocytaire. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés à un compartiment tout à fait original connu sous le nom de structures de Maurer. Ce compartiment, qui présente des caractéristiques de Golgi, est localisé dans le cytoplasme de la cellule hôte et assure le transfert de protéines parasitaires à la membrane érythrocytaire. Les structures de Maurer participent notamment au transport des protéines parasitaires liées au phénomène de cytoadhérence, qui est à l'origine du neuropaludisme. Notre travail a de plus permis de montrer leur rôle dans la libération des mérozoïtes infectieux. Nous avons entrepris une étude protéomique et fonctionnelle de ce compartiment afin de mieux comprendre son rôle biologique et d'identifier des enzymes essentielles au parasite, qui pourraient être validées comme cibles chimio-thérapeutiques. Nos études ont identifié dans ces structures la protéine RhopH2 qui semble présenter une activité sérine protéase dont nous poursuivons la caractérisation. Nous avons également, par une approche protéomique globale, identifié près de 50 protéines parasitaires dans des préparations de fantômes de globules rouges parasités, qui contiennent la membrane plasmique et le squelette sous-membranaire érythrocytaire ainsi que les structures de Maurer. Cette étude, ainsi que la caractérisation de l'interaction entre PfSBP1, protéine intégrale de la membrane des structures de Maurer, et LANCL1, protéine du squelette sous membranaire érythrocytaire, permettent de préciser les modalités d'interaction entre structures de Maurer et membrane plasmique de la cellule hôte du parasite. À terme, notre analyse devrait permettre de mieux comprendre le rôle biologique des structures de Maurer ainsi que les voies d'adressage des protéines parasitaires à ce compartiment extracellulaire tout à fait original.

La sénescence cellulaire est un arrêt stable du cycle cellulaire qui empêche la prolifération des cellules endommagées par des stress génotoxiques, tels que l'irradiation. En général, les lésions de l'ADN initient rapidement une réponse aux dommages et un blocage transitoire du cycle cellulaire nécessaire à la réparation de l'ADN. Cependant, les phénotypes associés à la sénescence, tels que l'arrêt de la prolifération stable et le sécrétome pro-inflammatoire, se manifestent plusieurs jours après le stress. Nous avons récemment démontré que l'établissement de la sénescence induite par l'irradiation est un processus en plusieurs étapes qui nécessite un événement prolifératif en présence de foyers de dommages de l'ADN persistants pour former de l'instabilité génomique. L'instabilité génomique secondaire, et non les dommages primaires de l'ADN, est responsable de nombreux phénotypes de sénescence. Le but de notre projet était d'évaluer l'impact de p16INK4a, un inhibiteur de kinase dépendant des cyclines, sur la reprise de la prolifération observée dans notre modèle initial en caractérisant la reprise de la prolifération, les phénotypes de sénescence lorsque p16INK4a est fortement exprimé, et de comprendre sa dynamique d'activation. Notre hypothèse était que l'expression de p16INK4a réduirait la reprise de la prolifération après l'irradiation, ce qui diminuerait la formation d'instabilité génomique et altérerait l'expression de certains phénotypes de sénescence. Nous avons induit la sénescence par irradiation dans des fibroblastes humains normaux qui présentent des niveaux endogènes différents d'expression de p16INK4a. Nous avons également utilisé une lignée qui surexprime et une autre qui déplète p16INK4a pour évaluer les conséquences de son expression sur la reprise de la prolifération et son impact sur les phénotypes de sénescence. Nos résultats suggèrent que p16INK4a réduit la reprise de la prolifération, diminuant l'instabilité génomique et réduisant à terme l'expression des facteurs du phénotype sécrétoire. De plus, de manière surprenante, nous avons observé que l'expression de p16INK4a n'a pas besoin d'être présente uniquement au moment de la reprise de la prolifération pour l'empêcher. Elle peut durer 24 heures au moment de l'irradiation, soit avant la reprise de la prolifération, pour la prévenir. Les données présentées dans ce mémoire aident à mieux comprendre le mécanisme de sénescence médié par l'irradiation et l'impact de l'expression de p16INK4a sur les différents phénotypes de sénescence. / Cellular senescence is a stable cell cycle arrest that prevents proliferation of cells damaged by genotoxic stresses, such as irradiation. In general, DNA damage initiates a DNA damage response and a transient cell cycle arrest required for DNA repair. However, senescence-associated phenotypes, such as stable senescence-associated proliferation arrest and pro-inflammatory secretome are established several days later. We have recently shown that the establishment of irradiation-induced senescence is a multi-step process that requires a proliferation event in the presence of persistent DNA damage foci to form genomic instability. Secondary genomic instability, but not primary DNA damage, leads to the establishment of senescence phenotypes. The aim of our project was to evaluate the impact of p16INK4a, a cyclin-dependent kinase inhibitor, on the bypass of the transient cell cycle arrest we observed in our initial model by characterizing the bypass and senescence phenotypes when p16INK4a was highly expressed and to understand its activation dynamics. Our hypothesis was that p16INK4a expression would reduce the percentage of bypass after irradiation which would decrease genomic instability formation and ultimately alter the expression of some senescence phenotypes. We induced senescence by irradiation in normal human fibroblasts with different endogenous levels of p16INK4a expression. We also used a cell line that overexpresses and another that depletes p16INK4a to evaluate the consequences of its expression on the bypass and its impact on senescence phenotypes. Our results suggest that p16INK4a decreases the bypass, thus reducing the genomic instability and, therefore, reduces expression of secretory phenotype factors. Moreover, interestingly, we observed that p16INK4a expression does not need to be present only at the time of reproliferation to prevent it, i.e. it can last 24 hours at the time of irradiation. These results contribute to improve our knowledge about the mechanism of establishment of irradiation-mediated senescence and the impact of p16INK4a expression on different senescence phenotypes.