Orientadora: Cecilia Laluce / Banca: Kelly Johana Dussan Medina / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattas / Resumo: A levedura mais utilizada nos processos fermentativos é a Saccharomyces cerevisiae, por apresentar uma grande eficiência de conversão dos açúcares em etanol, permitindo assim a produção de etanol combustível em larga escala, porem essas leveduras não predominam durante toda a safra, sendo substituídas por leveduras não - Saccharomyces. Durante o processo fermentativo fatores como estresse alcoólico, térmico, ácido, nutricional e osmótico causam prejuízo ao processo. Na busca por um microrganismo capaz de fermentar em condições de estresse a levedura híbrida, S. cerevisiae IQAr/45-1 (PI 0806141-6) construída no Laboratório de Unidades das Leveduras Industriais do Instituto de Química - UNESP, apresenta características de rápida fermentação e resistência ao estresse térmico. Sendo assim o objetivo principal do presente trabalho é testar a capacidade de fermentar da levedura IQAr/45-1 quando inoculada junto ao creme de levedura industrial, que contem leveduras Saccharomyces e não - Saccharomyces avaliando sua capacidade de melhorar a fermentação. Fermentações de 5 ciclos sucessivos com reuso de células foram conduzidas utilizando um fluxo de alimentação 0,39 mL/min, por 3 horas com melaço 20 % (ART) e foram realizadas a 35 °C e 40 °C, durante 10 horas, utilizando como inóculo creme de levedura industrial com adição da levedura IQAr/45-1 na proporção de 3:1. Durante a fermentação foi analisado a concentração celular, viabilidade e ART. Após as análises observou-se quando adiciona... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

La protéine nucléolaire Dbp4 est impliquée dans la biogenèse de l'ARN ribosomique (ARNr) 18S chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle présente une interaction génétique avec le petit ARN nucléolaire (snoRNA) U14. Dbp4 est une RNA hélicase de la famille «DEAD-box» et elle est hautement conservée dans l'évolution. Son homologue chez l'humain (DDX10) serait impliqué dans certains types de cancers. La plupart des «DEAD-box » RNA hélicases sont essentielles à la croissance de la levure indiquant ainsi une absence de redondance de leurs fonctions sur leurs substrats spécifiques. De façon plus intéressante, il a été démontré que plusieurs hélicases seraient aussi impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Les protéines «DEAD-box» sont caractérisées par la présence de neuf motifs conservés formant la région centrale catalytique de l'enzyme. Cette dernière est flanquée par deux extensions de composition variable aux extrémités N- et C-terminales. Ces extensions joueraient un rôle déterminant dans la reconnaissance du substrat et/ou la liaison de cofacteurs. Nos analyses bioinformatiques prédisent la présence d'un domaine d'interaction protéine-protéine appelé domaine «coiled-coil» (CC) à chacune des extrémités N-et C-terminale. Notre hypothèse est que Dbp4 serait associé à des protéines par l'intermédiaire de ces domaines CC. Afin d'identifier les partenaires protéiques potentiels de Dbp4, nous avons utilisé le système double hybride chez la levure en criblant une banque génomique de Saccharomyces cerevisiae. Parmi les clones positifs, nous avons identifié la présence des protéines Ifh1, Rrn5, Rps20, Rps2 et Msb2. Curieusement à l'exception de Msb2, toutes ces protéines sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes et renferment des domaines CC comme Dbp4. Cela suggère que ces protéines sont des partenaires potentiels de Dbp4 pour la biogenèse des ribosomes. Pour confirmer ces résultats de double hybride, nous avons réalisé des tests in vivo par co-immunoprécipitation dont les résultats préliminaires n'ont pas été concluants. Des études complémentaires seront nécessaires afin d'éclaircir ces résultats. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Saccharomyces cerevisiae, Nucléole, Ribosomes, RNA hélicases, Dbp4.

Les mécanismes qui entrent en jeu dans la maturation de l'ARN ribosomique (ARNr) restent toujours obscurs. Dbp4 est une ARN hélicase putative qui fait partie du groupe des hélicases « DEAD-box ». Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Dbp4 aurait un rôle à jouer dans la maturation du pré-ARNr 35S. Les ARN hélicases ont généralement une activité ATPasique dépendante de la présence d'ARN. De plus, la plupart des hélicases possèdent des domaines supplémentaires en N-et en C-terminal qui pourraient être nécessaires pour l'activité et/ou pour conférer la spécificité pour un substrat. Nous désirons déterminer les caractéristiques biochimiques de Dbp4. Cette enzyme est pourvue d'un très long domaine C-terminal qui contient un motif de liaison protéique « coiled-coil ». La présence de ce motif suggère que Dbp4 pourrait nécessiter l'assistance de protéine(s) cofacteur(s) pour avoir une activité ATPasique et/ou hélicasique. Des tests d'interaction dans le système double hybride de levure ont permis d'identifier une interaction entre Dbp4 et les protéines Bfr2, Esf1 et Enp2. Les conditions optimales pour l'activité ATPasique sont une incubation à 37 °C dans un tampon HEPES à pH 7.5 avec 10 µg d'ARN total de levure. Dbp4 possède une activité ATPasique qui augmente de quatre à cinq fois en présence d'ARN. La protéine Dbp4 recombinante sans la section C-terminale a été produite et des tests d'activité ATPasique ont été effectués. Selon nos observations, la section C-terminale de Dbp4 joue un rôle important pour l'activité ATPasique. Finalement, la production d'anticorps anti-Dbp4 chez le lapin nous a donné deux anticorps, A et B, capables de détecter Dbp4. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hélicase, ATPase, ARNr, DEAD-box, Dbp4, Saccharomyces cerevisiae, Double hybride et coloration au vert de malachite.

Les télomères forment la structure qui coiffe les extrémités des chromosomes. Ils sont essentiels pour protéger l’intégrité génomique. À cause du problème de fin de réplication, les télomères raccourcissent à chaque division cellulaire, menant à l’arrêt du cycle cellulaire, à la sénescence et à la mort cellulaire. Pour contrevenir au raccourcissement des télomères, les cellules immortalisées et hautement prolifératives, ainsi que la plupart des eucaryotes unicellulaires tels que Saccharomyces cerevisiae, expriment la télomérase, un complexe ribonucléoprotéique enzymatique qui rallonge les télomères. Pour permettre le maintien de la longueur des télomères et assurer l’intégrité du génome, plusieurs régulateurs contrôlent le recrutement et l’activité de la télomérase, s’assurant du ciblage précis de l’activité de la télomérase à ses substrats. Aux télomères, un dérèglement des mécanismes de régulation de la télomérase peut mener au raccourcissement des télomères, à des fusions de chromosomes et au développement d’un potentiel cancéreux. La télomérase peut aussi agir aux cassures d’ADN où son activité se traduit par l’ajout de novo d’un télomère et conduit à la perte de matériel génétique, à l’instabilité génomique et possiblement à la mort cellulaire. Son recrutement et son activité y sont donc inhibés. Les mécanismes par lesquels la cellule régule l’activité de la télomérase aux télomères et aux cassures d’ADN restent encore peu connus. De plus, en réponse à certains stress, ces mécanismes peuvent être altérés. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour but d’étudier les régulateurs de l’activité de la télomérase et l’impact de certains stress cellulaires sur cette régulation. Dans la première partie, nous avons étudié la localisation de l’ARN TLC1, la sous-unité ARN de la télomérase, à travers le cycle cellulaire chez S. cerevisiae. Alors que cet ARN est majoritairement dans le nucléoplasme en G1/S, il démontre une accumulation nucléolaire en phase G2/M du cycle cellulaire. Chez la levure, la réparation des cassures d’ADN se fait majoritairement par recombinaison homologue et est exclue du nucléole. Dans ce contexte, nous avons formulé l’hypothèse que l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléole en G2/M constitue un mécanisme par lequel l’ajout de novo de télomère est inhibé aux cassures d’ADN. Nous avons fixé comme buts de caractériser les mécanismes régulant l’accumulation nucléolaire de l’ARN TCL1 et d’étudier comment la présence de dommage à l’ADN influence cette régulation. Nous avons pu montrer que la localisation nucléolaire de l’ARN TLC1 dépend de l’hélicase Pif1, de la protéine de la recombinaison homologue Rad52 et que la présence de dommage à l’ADN et l’absence de Rad52 influence le trafic nucléaire de cet ARN. Dans ces conditions, la protéine de la recombinaison homologue Rad51 permet l’accumulation de Cdc13 aux cassures et favorise l’accumulation de l’ARN TLC1 au nucléoplasme et aux cassures d’ADN. Cette accumulation est dépendante de la SUMO ligase Siz1 et mène à une augmentation d’ajout de novo de télomère aux sites de cassures d’ADN. Pour pouvoir quantifier l’augmentation d’ajout de novo de télomère, nous avons développé une nouvelle approche basée sur le séquençage haut-débit de type Illumina pour identifier et quantifier les événements d’ajout de novo de télomère sur le génome entier de manière non-biaisée. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes contrôlant l’expression d’un régulateur de la télomérase nommé TERRA (telomeric repeats containing RNA). TERRA est un long ARN non-codant qui est transcrit à partir des régions sous-télomériques jusqu’aux répétitions télomériques. Chez S. cerevisiae, l’expression de TERRA est inhibée au niveau de sa transcription par le complexe SIR et au niveau de sa dégradation par l’exonucléase Rat1. Pourtant, les télomères courts expriment TERRA à des niveaux élevés. Cette augmentation de l’expression de TERRA permet de concentrer et de cibler l’activité de la télomérase aux télomères courts. En étudiant l’expression de TERRA, nous avons remarqué que les télomères exprimant cet ARN démontrent une perte prématurée de leur cohésion en phase S du cycle cellulaire. Nous pensons que l’organisation structurelle des télomères et, plus particulièrement, la cohésion télomérique participe à la régulation de l’expression de TERRA. De plus, plusieurs groupes ont montré que l’expression de TERRA était régulée en réponse à plusieurs stress, de façon indépendante de la taille des télomères. Dans ce contexte, nous formulons l’hypothèse que le stress oxydatif et les changements métaboliques induits durant la transition diauxique influence l’expression de TERRA. Pour cette partie de la thèse, nous avions comme but d’étudier comment l’expression de TERRA étaient régulé par les changements métaboliques comme la transition diauxique et d’étudier le rôle joué par le complexe de la cohésine dans la régulation de l’expression de TERRA. Nous avons montré que les télomères courts montrent une perte de cohésion prématurée en début de phase S, ce qui favorise l’expression de TERRA en cis. Alors qu’une perte de fonction partielle de la cohésine résulte en une augmentation de l’expression de TERRA, la rétention forcée de cohésine à un télomère court réprime sa transcription. Cette perte de cohésion aux télomères courts est dépendante de Sir4 mais indépendante de Sir2, ce qui suggère que le rôle de Sir4 dans l’ancrage des télomères à la membrane nucléaire pourrait être impliqué dans ce phénomène. Nous avons également montré que la transcription de TERRA est induite durant la transition diauxique, une phase de croissance cellulaire où, suite à la déplétion du glucose, les cellules adaptent leur métabolisme en faveur de la respiration oxydative. Cette augmentation d’expression coïncide avec l’accumulation cytoplasmique de TERRA. Ensemble, les travaux présentés dans cette thèse explorent les liens entre les stress cellulaires tels que les dommages à l’ADN, le raccourcissement télomérique, le stress oxydatif et le métabolisme cellulaire, et leur impact sur le trafic de la télomérase et l’expression de son régulateur TERRA. / Telomeres constitute the structure at the end of linear chromosomes which is essential to protect genome integrity. Due to the end-replication problem, telomeres get shorter with every cell division, leading to cell cycle arrest, senescence and cell death. To counteract telomere shortening, highly proliferative cells and most unicellular eukaryotes, like Saccharomyces cerevisiae, express telomerase, a ribonucleoprotein enzyme that elongates telomeres. Many regulatory pathways affect telomerase activity and recruitment to assure precise targeting of telomerase activity to its proper substrate, the telomeres. Impairing these pathways can lead to telomere shortening, end-to-end chromosome fusions and immortalization. Telomerase can also be recruited at double strand breaks (DSBs), where its activity leads to de novo telomere additions which induce genomic instability, loss of genetic information and possibly cell death. For this reason, telomerase recruitment and activity is strongly inhibited at DSB. However, the mechanisms behind this regulation are still poorly understood. Furthermore, many cellular stresses affect telomerase regulation at telomeres and DSBs. Our goal is to study the regulation of telomerase activity and the impact of cellular stresses on this regulation. In the first part of this thesis, we looked at the cell cycle localization of the Saccharomyces cerevisiae RNA subunit of the telomerase, TLC1 RNA. While TLC1 RNA is mostly in the nucleoplasm in G1/S, it accumulates in the nucleolus in G2/M. In yeast, the most common DSB repair pathway is homologous recombination (HR). As HR is mostly excluded from the nucleolus in G2/M, we propose that the accumulation of TLC1 RNA in the nucleolus in G2/M may represent a regulatory pathway that repress de novo telomere addition by physically separating telomerase from sites of DNA repair by HR. We aim to characterize the mechanisms by which TLC1 RNA localization is regulated and how the presence of DSB affects this trafficking. We were able to show that the nucleolar localization of TLC1 RNA is dependent on the Pif1 helicase and on the HR protein Rad52. Furthermore, we showed that the presence of DSBs and the absence of Rad52 alter the nuclear trafficking of TLC1 RNA. In these conditions, Rad51 favors the accumulation of Cdc13 at DSBs and promotes the nucleoplasmic accumulation of TLC1 RNA. This accumulation is dependent on the SUMO ligase Siz1 and leads to an increased addition of de novo telomere at DNA breaks. In order to identify de novo telomere addition events genome-wide, we developed an unbiased genome-wide technique based on Illumina sequencing of genomic DNA. In the second part of this thesis, we studied another regulator of telomerase activity, the long non-coding RNA (lncRNA) TERRA (telomeric repeats-containing RNA), which is transcribed from subtelomeric regions through the telomeric tracts. In S. cerevisiae, TERRA expression is controlled at the transcriptional level by the SIR complex and its degradation by the exonuclease Rat1. Nevertheless, short telomeres escape transcriptional inhibition and degradation to express TERRA at higher levels. TERRA serves as a regulator of telomerase, allowing the concentration and the targeting of telomerase activity to short telomeres. While studying TERRA expression, we observed that TERRA-expressing telomeres display a premature S-phase loss of cohesion. We propose that cohesin and telomere cohesion are regulators of TERRA expression. In addition, other groups have shown that TERRA expression was regulated in response to different cellular stress. This regulation seems to be independent from telomere length. In these contexts, we propose that oxidative stress and metabolic changes induced during the diauxic shift affect TERRA expression. We aim to study how the diauxic shift affects TERRA expression and study the role of cohesin in regulating TERRA expression. We were able to show that telomere cohesion inhibits TERRA expression and that short telomeres display a premature loss of cohesion to allow TERRA expression. This loss of cohesion is dependent on Sir4 and probably on Sir4-mediated telomere anchoring at the nuclear membrane. Additionally, we showed that TERRA transcription is increased during the diauxic shift, when yeast cells switch from fermentative glycolysis to oxidative respiration. Yeast cells in this phase also display a cytoplasmic accumulation of TERRA molecules. Altogether, the articles presented in this thesis explore the interplay between cellular stresses such as DNA damage, telomere shortening, oxidative stress and respiratory metabolism, and their roles in the regulation of the localisation and expression of TLC1 RNA and TERRA.