Tectiviridae šeimos bakteriofagas PRD1, infekuojantis dauginiu atsparumu antibiotikams pasižyminčias gramneigiamąsias bakterijas, patekimui į ląstelę naudoja viriono viduje esančią membraną. Manoma, kad šio bakterijų viruso membrana patekimo metu suliejama su infekuojamų ląstelių plazmine membrana. Deja, tiesiogiai įrodyti, kad faginė membrana susilieja su infekuojamų bakterijų plazmine membrana yra sudėtinga. Registruodami fago sukeliamas TPP+ ir K+ sroves bei tirdami membranose aktyvių antibiotikų poveikį membranos įtampai ir kalio jonų gradientui pabandėme ištirti Salmonella enterica ląstelių plazminės ir išorinės membranų laidumo pokyčius pradiniame infekcijos etape ir nustatyti infekcijos terpės fizikocheminių savybių įtaką bakteriofago PRD1 sąveikai su S. enterica ląstelėmis. Bakteriofagas PRD1, infekuodamas Salmonella enterica ląsteles, didina išorinės membranos laidumą, bet nedepoliarizuoja jų plazminės membranos. 300 OsmM ir didesnis infekavimo terpės osmosinis slėgis bei 22 oC ir žemesnė temperatūra slopina bakteriofago PRD1 poveikį Salmonella enterica ląstelių apvalkalėlio laidumui. Skirtingai nuo giminingo bakteriofago Bam35 infekcijos poreikių, dvivalenčiai katijonai nėra reikalingi fago PRD1 sąveikai su S. enterica ląstelių apvalkalėliu pradiniuose infekcijos etapuose. Dvivalenčių katijonų kompleksonai net skatina membranas laidinantį fago PRD1 poveikį, o Ca2+ ir Mg2+ jonai šiek tiek slopina plazminės membranos laidinimą. Arsenatas slopina PRD1 poveikį... [toliau žr. visą tekstą] / Bacteriophage PRD1 from Tectiviridae family uses its internal membrane to enter the host multiple resistant to antibiotics Gram-negative bacteria. Some indirect evidences indicate that during the entry phage membrane fuses with the plasma membrane of bacterial cell. However, it is very complicated to get the direct evidences or indications of the membrane fusion in this system. Monitoring the phage-induced fluxes of TPP+ and K+ ions and studying the influence of membrane-active antibiotics on membrane voltage and potassium gradient we were investigating PRD1-induced changes in the permeability of the outer and the plasma membranes of Salmonella enterica cells and registering the influence of physicochemical parameters of infection medium on the efficiency of phage-cell interaction. We have shown that phage PRD1 increases permeability of the outer membrane but does not depolarize the plasma membrane during the entry. 300 OsmM and higher osmotic pressure in the infection medium and temperature lower than 22 oC blocks the phage induced changes in bacterial envelope. Differently from the relative bacteriophage Bam35, divalent cations are not needed for PRD1 entry. Complexones of divalent cations EDTA and EGTA stimulate, but Ca2+ ir Mg2+ slightly inhibit the plasma membrane-permeabilizing activity of PRD1. Arsenate inhibits PRD1 induced changes of the cell envelope and the reduced intracellular ATP content could be the reason. Bacteriophage-induced lysis of S. enterica cells is... [to full text]

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-12T12:06:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2872306 bytes, checksum: 4524f2b2277b755bcb654e67c07705cb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T12:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2872306 bytes, checksum: 4524f2b2277b755bcb654e67c07705cb (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Quorum sensing (QS) é um mecanismo de comunicação entre células microbianas mediado por moléculas sinalizadoras, denominadas autoindutores (AIs). Embora não produza o AI-1, que são moléculas de acil homoserina lactonas (AHLs), Salmonella responde às AHLs produzidas por outros micro-organismos por sintetizar a proteína de resposta ao AI-1, denominada de SdiA. Contudo, o gene sdiA ainda não tem sua função estabelecida em Salmonella. Neste trabalho foi avaliada a influência de n-dodecanoil homoserina lactona (C12-AHL) e de furanonas, análogas de AHLs, sobre o crescimento, motilidade, adesão, formação de biofilme em poliestireno e síntese de proteínas por Salmonella Enteritidis PT4 em anaerobiose. Na presença ou na ausência de 50 nM de C12-AHL e, ou de furanonas, o crescimento, a motilidade em massa ou por espalhamento (swarming) e a motilidade por contração ou por espasmos (twitching) deste patógeno não foram alterados. Conforme verificado pela determinação do potencial de adesão e formação de biofilme em microplacas, enumeração de células aderidas e microscopia confocal de epifluorescência, foi constatada que a presença de C12-AHL induziu a formação de biofilme em superfície de poliestireno após 36 h de cultivo. Além disso, constatou-se o efeito antagonista das furanonas sobre a formação de biofilme nas mesmas condições. As proteínas sintetizadas por Salmonella Enteritidis PT4 na presença e na ausência de 50 nM de C12-AHL após 7 h de cultivo em anaerobiose foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional e preditas por comparação do ponto isoelétrico e massa molecular disponíveis em bancos de dados. Foi verificado que, na presença de C12-AHL houve síntese de maior número de proteínas, sendo que muitas delas estão relacionadas com o sistema QS e com a formação de biofilme. Os resultados obtidos evidenciam que a presença de C12-AHL exógena influencia o metabolismo de Salmonella Enteritidis PT4, cultivada em condições de anaerobiose e indicam uma nova linha de investigação que pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos relacionados com a patogenicidade de Salmonella. / Quorum sensing (QS) is a communication mechanism employed by microbial cells by means of signaling molecules, called autoinducers (AIs). Even though Salmonella does not produce AI-1, also known as acyl homoserine lactones (AHLs), it responds to AHLs produced by other microorganisms through an AI-1 response protein called SdiA. However, the sdiA gene has not established function in Salmonella. In this work the influence of n-dodecanoyl homoserine lactone (C12-AHL) and furanones, AHLs analogs, was assessed on the growth, motility, adhesion, biofilm formation on polystyrene and protein synthesis by Salmonella Enteritidis PT4 under anaerobic environment. In the presence or absence of 50 nM C12-AHL and/or furanones, growth, swarming and twitching motilities of this pathogen were not altered. We found that the presence of C12-AHL induced biofilm formation after 36 h of cultivation as determined by the adhesion potential and biofilm formation on microplates, the enumeration of adhered cells and by confocal epifluorescence microscopy. The results were evaluated by determining the adhesion potential and biofilm formation on microplates, the enumeration of adhered cells and by confocal epifluorescence microscopy. The antagonistic effect of furanones was also determined by using the same conditions. The proteins synthesized by Salmonella Enteritidis PT4 in the presence or absence of 50 nM C12-AHL, after 7 h of incubation in anaerobic conditions, were extracted, separated by bidimensional electrophoresis and predicted on the basis of their isoelectric point and molecular masses available on databases. In the presence of C12-AHL, there was an increased synthesis of proteins, with the majority related to the QS system and biofilm formation. The results demonstrate that the presence of exogenous C12-AHL affects the metabolism of Salmonella Enteritidis PT4, cultivated under anaerobic conditions and point towards a new line of investigation which could contribute to the understanding of the pathogenicity mechanisms in Salmonella.

Para avaliar a diversidade de Salmonella enterica, foram analisados os sorovares presentes em amostras de Salmonela isoladas de aves e seu ambiente do Sul do Brasil (n=155), Colômbia (n=141) e Mississippi (EUA, n=50). No total, foram examinados 346 isolados de Salmonela pela técnica de ribotipificação de sequências Intergênicas (ISR) usando PCR convencional (para bactérias vivas isoladas no Estado de Mississippi) ou nested PCR (para o DNA de Salmonelas do Brasil e da Colômbia, em cartões FTA). O sequenciamento da região intergênica do gene dkgB avalia polimorfismos de nucleotídeos simples que ocorrem em torno do gene ribossomal 5S. A concordância geral entre o esquema Kauffman-White-LeMinor (KWL) e a ISR foi de 85,2% em isolados do Brasil, e de 89,58% em isolados do Mississippi. É possível que a divergência seja devida à capacidade da ISR de detectar as misturas de sorovares numa cultura. Os sorovares de Salmonella enterica identificados nos isolados brasileiros foram: Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo e Senftenberg. Três sorovares ISR únicos foram detectados (UN0041, UN0042, UN0043). Nos isolados colombianos, foram identificados os sorovares Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen, Braenderup, Yoruba e um sorovar ISR Único (UN0048). Já no tocante aos isolados de Mississippi, foram identificados os sorovares Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg e um ISR Único (UN0094). Em geral, a ISR forneceu mais informações do que KWL sobre a ecologia de Salmonella enterica das aves comerciais. Em 73 isolados da Colômbia e 50 isolados de Mississippi, foram estabelecidas as resistências para 15 e 17 agentes antimicrobianos, respectivamente. Não foram identificados isolados pansusceptíveis. Todas as amostras analisadas foram classificadas como multirresistentes. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados, não só com respeito aos sorovares identificados em cada país, mas também sobre a sua resistência aos antimicrobianos. Os resultados desta pesquisa irão beneficiar a indústria avícola do sul do Brasil, da Colômbia e de Mississippi, porque a caracterização de cepas isoladas de aves comerciais poderá ser usada no futuro para o desenvolvimento e adaptação de programas de controle. / To assess diversity of Salmonella enterica serotypes present in poultry and their environment from Southern Brazil (n=155), Colombia (n=141) and Mississippi (EUA, n=50); 346 isolates were examined with conventional PCR (live bacteria from Mississippi) or nested PCR (Brazilian and Colombian Salmonella DNA in FTA cards) and sequencing of the dkgB-linked intergenic sequence ribotyping (ISR) region that assesses single nucleotide polymorphisms occurring around a 5S ribosomal gene. Overall agreement between Kauffman-White-LeMinor (KWL) scheme and ISR was 85.2% in Brazilian Salmonella isolates, and 89.58% in Mississippi´s isolates. It is possible that the disagreement was due to the ability of ISR to detect mixtures of serotypes in culture. Salmonella enterica serotypes identified among Brazilian isolates were Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo, and Senftenberg. Three unique ISRs were detected (UN0041, UN0042, UN0043). Regarding the Colombian isolates, serotypes Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen Braenderup, Yoruba, and One Unique ISR (UN0048) were identified and among Mississippian isolates, serotypes Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg, and one Unique ISR (UN0094). Overall, ISR provided more information than KWL about the ecology of on-farm Salmonella enterica. In 73 isolates from Colombia and 50 isolates from Mississippi, there were established the antimicrobial resistance against 15 and 17 antimicrobial agents, respectively. No pansusceptible isolate was identified. All analyzed isolates were classified as Multidrug resistant. The results of this study show a great diversity among analyzed isolates, not only in respect to the serotypes, but also about their antimicrobial resistance. The results of this research will benefit the poultry industries of Southern Brazil, Colombia and Mississippi, because the characterization of strains isolated from poultry can be used in the future to the development and adaptation of Salmonella control programs.

Para avaliar a diversidade de Salmonella enterica, foram analisados os sorovares presentes em amostras de Salmonela isoladas de aves e seu ambiente do Sul do Brasil (n=155), Colômbia (n=141) e Mississippi (EUA, n=50). No total, foram examinados 346 isolados de Salmonela pela técnica de ribotipificação de sequências Intergênicas (ISR) usando PCR convencional (para bactérias vivas isoladas no Estado de Mississippi) ou nested PCR (para o DNA de Salmonelas do Brasil e da Colômbia, em cartões FTA). O sequenciamento da região intergênica do gene dkgB avalia polimorfismos de nucleotídeos simples que ocorrem em torno do gene ribossomal 5S. A concordância geral entre o esquema Kauffman-White-LeMinor (KWL) e a ISR foi de 85,2% em isolados do Brasil, e de 89,58% em isolados do Mississippi. É possível que a divergência seja devida à capacidade da ISR de detectar as misturas de sorovares numa cultura. Os sorovares de Salmonella enterica identificados nos isolados brasileiros foram: Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo e Senftenberg. Três sorovares ISR únicos foram detectados (UN0041, UN0042, UN0043). Nos isolados colombianos, foram identificados os sorovares Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen, Braenderup, Yoruba e um sorovar ISR Único (UN0048). Já no tocante aos isolados de Mississippi, foram identificados os sorovares Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg e um ISR Único (UN0094). Em geral, a ISR forneceu mais informações do que KWL sobre a ecologia de Salmonella enterica das aves comerciais. Em 73 isolados da Colômbia e 50 isolados de Mississippi, foram estabelecidas as resistências para 15 e 17 agentes antimicrobianos, respectivamente. Não foram identificados isolados pansusceptíveis. Todas as amostras analisadas foram classificadas como multirresistentes. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados, não só com respeito aos sorovares identificados em cada país, mas também sobre a sua resistência aos antimicrobianos. Os resultados desta pesquisa irão beneficiar a indústria avícola do sul do Brasil, da Colômbia e de Mississippi, porque a caracterização de cepas isoladas de aves comerciais poderá ser usada no futuro para o desenvolvimento e adaptação de programas de controle. / To assess diversity of Salmonella enterica serotypes present in poultry and their environment from Southern Brazil (n=155), Colombia (n=141) and Mississippi (EUA, n=50); 346 isolates were examined with conventional PCR (live bacteria from Mississippi) or nested PCR (Brazilian and Colombian Salmonella DNA in FTA cards) and sequencing of the dkgB-linked intergenic sequence ribotyping (ISR) region that assesses single nucleotide polymorphisms occurring around a 5S ribosomal gene. Overall agreement between Kauffman-White-LeMinor (KWL) scheme and ISR was 85.2% in Brazilian Salmonella isolates, and 89.58% in Mississippi´s isolates. It is possible that the disagreement was due to the ability of ISR to detect mixtures of serotypes in culture. Salmonella enterica serotypes identified among Brazilian isolates were Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo, and Senftenberg. Three unique ISRs were detected (UN0041, UN0042, UN0043). Regarding the Colombian isolates, serotypes Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen Braenderup, Yoruba, and One Unique ISR (UN0048) were identified and among Mississippian isolates, serotypes Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg, and one Unique ISR (UN0094). Overall, ISR provided more information than KWL about the ecology of on-farm Salmonella enterica. In 73 isolates from Colombia and 50 isolates from Mississippi, there were established the antimicrobial resistance against 15 and 17 antimicrobial agents, respectively. No pansusceptible isolate was identified. All analyzed isolates were classified as Multidrug resistant. The results of this study show a great diversity among analyzed isolates, not only in respect to the serotypes, but also about their antimicrobial resistance. The results of this research will benefit the poultry industries of Southern Brazil, Colombia and Mississippi, because the characterization of strains isolated from poultry can be used in the future to the development and adaptation of Salmonella control programs.

Orientadores: Marcelo Brocchi, Gustavo Bueno Gregoracci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:27:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SartiSprogis_AdrianeCristina_M.pdf: 1852459 bytes, checksum: 397af9ee41d085346189ca76eee83f96 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A salmonelose é uma zoonose que representa um sério problema de saúde pública mundial, devido: à sua alta prevalência, à dificuldade de seu controle, ao seu caráter endêmico, à morbidade e à mortalidade. O conhecimento da ocorrência das diferentes sorovariedades de S. enterica em diferentes regiões e países pode ajudar no rastreamento e reconhecimento de patógenos emergentes, e assim implementar políticas de tratamento e prevenção. A grande maioria das sorovariedades expressa dois tipos diferentes de antígenos flagelares codificados pelos genes fliC (fase 1) e fljB (fase 2), sendo assim denominadas bifásicas. Contudo, algumas sorovariedades expressam apenas uma das fases, e são denominadas monofásicas. É possível que a variação de fase flagelar em S. enterica esteja associada a uma função de escape do sistema imunológico, por aumentar o repertório de antígenos expressos pela célula bacteriana, evitando temporariamente a resposta imune celular. Assim sendo, S. enterica bifásicas possuiriam uma vantagem seletiva sobre as monofásicas, porém isso não é totalmente verificado nos estudos epidemiológicos, pois no Estado de São Paulo, S. enterica I,4,[5],12:i:-, (monofásica) é uma das mais comumente associadas aos casos de diarreia e/ou infecções sistêmicas em pacientes humanos. De fato, a partir da década de 1990 houve um aumento significativo da S. enterica I,4,[5],12:i:- em muitos países. Sequências de profagos são muito comuns em S. enterica, sendo de conhecimento que esses fagos codificam vários fatores que contribuem para patogenicidade, diversidade genética e/ou características que aumentam o fitness. Coculturas experimentais de linhagens de S. enterica podem induzir espontaneamente profagos, que matam bactérias sensíveis, e assim a indução espontânea de fagos em uma população lisogênica acentua a competitividade entre populações. Neste estudo foram analisadas culturas puras de S. enterica Enteritidis (bifásica) adicionadas de fagos líticos induzidos de S. enterica I,4,[5],12:i:-, bem como coculturas entre as duas sorovariedades citadas, nas quais foram observadas induções espontâneas de fagos associados à alta densidade populacional e alterações das taxas de crescimento em ambos os estudos, corroborando a hipótese de que S. enterica monofásica pode alterar a dinâmica populacional a seu favor, pela liberação de fagos líticos à outra sorovariedade, interferindo no crescimento populacional de S. enterica Enteritidis, e que o sucesso evolutivo de S. enterica I,4,[5],12.:i:- pode estar associado a fagos líticos atuando como um regulador na ecologia bacteriana. Esses dados podem mudar nosso conhecimento sobre a interação bactéria-fago de uma simples relação parasita-hospedeiro para uma coevolução de duas vias entre seus genomas / Abstract: Salmonellosis is a zoonosis that is a serious public health problem worldwide, due to its high prevalence, difficulty controlling, their endemicity, morbidity and mortality. The knowledge of the occurrence of different serovars of S. enterica in different regions and countries can help in tracking and recognition of emerging pathogens and thus implement policies for treatment and prevention. The majority of serovars express two different types of flagellar antigens encoded by genes: fliC (phase 1) and fljB (phase 2), so called biphasic. However, some serovars express only one of the phases and are termed monophasic. It is possible that flagellar phase variation of S. enterica is associated with an escape function of the immune system to increase the repertoire of antigens expressed by the bacterial cell temporarily preventing cellular immune response. Thus, S. enterica biphasic would have a selective advantage over monophasic, but this is not fully verified in epidemiologic studies, because in the State of São Paulo, S. enterica I,4,[5],12:i:-, (monophase) is the one most commonly associated with cases of diarrhea and/or systemic infections in human patients, in fact, from the 1990s there was a significant increase of S. enterica I,4,[5],12:i:- in many countries. Prophages sequences are very common in S. enterica, with the knowledge that these phages encode several factors that contribute to pathogenicity, genetic diversity and/or characteristics that increase fitness. Cocultures experimental strains of S. enterica prophages can induce spontaneous, killing susceptible bacteria, and thus the spontaneous induction in a population of lysogenic phage enhances the competitiveness between populations. This study analyzed pure cultures of S. enterica Enteritidis ( biphasic ) added lytic phage induced from S. enterica I,4,[5],12:i:-, as well as cocultures between the two serovars cited where inductions were observed spontaneous phage associated with high population density and changes in growth rates in both studies, supporting the hypothesis that S. enterica monophase can alter the population dynamics to their advantage by releasing lytic phage to another serovar, interfering with the population growth of S. enterica Enteritidis and the evolutionary success of S. enterica I,4,[5],12:i:- may be associated with lytic phages acting as a regulator in bacterial ecology. These data may change our understanding of bacteria- phage from a simple parasite-host coevolution for a two-way between their genomes / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

In the United States, illnesses associated with fresh produce are increasing in frequency.  While contamination risks are present at every aspect of the farm to fork continuum, post-harvest practices holds the potential for cross-contamination of large amounts of product.  Post-harvest contamination risks for hydroponically grown lettuce packaged with intact roots and sold as "living lettuce"" are poorly understood.  In this study, transmission of Salmonella enterica serotype Enteritidis to the roots and leaves of butterhead lettuce was studied when contamination was introduced during typical handling practices.  The effectiveness of random sampling strategies for selection of Salmonella contaminated leaves was assessed by co-inoculating the Salmonella solution with Glo Germ™ and comparing recovery from blacklight selected leaves.  The recovery of Salmonella was improved by only 0.5 log CFU/g when blacklight was used to select Glo Germ™ contaminated leaves (P=0.05). This suggests random leaf selection as described by current FDA protocols is adequate. In addition, this study showed rapid transfer of Salmonella from liquid to the roots and sub-sequentially to the leaves of living lettuce.  Salmonella persisted but did not grow on leaves when stored at 4˚C for 18-days. Storage at 12˚C was associated with 2 log CFU/g increases in Salmonella on roots after 18-days storage (P=0.0002), while 4˚C storage was associated with a decrease of 0.4 log CFU/g Salmonella on roots (P=0.0001). Growth occurred only under temperature abuse conditions.  This reinforces the need for maintaining temperature control and highlights the importance of identifying risks associated with post-harvest handling during hydroponic production and distribution. / Master of Science in Life Sciences

Water used in fresh produce washing is a potential vehicle of foodborne pathogen contamination. This work focused on assessing the sanitizing efficacy of ethanol mist to reduce Salmonella populations on the surfaces of tomatoes and cantaloupes. Ethanol (70%) mist was applied to whole tomatoes and cantaloupe rind plugs using a Biomist sanitation system, which uses CO2 as a carrier gas to spray vapors through a fine droplet spray nozzle. Fresh red tomatoes (Solanum lycopersicum) and cantaloupe (Cucumis melo) plugs were inoculated with Salmonella enterica Newport to a concentration of log 7 CFU/tomato and log 7 CFU/cm2 respectively. Application time (5, 10, and 15 sec), dry vs. wet surface, and stem scar contamination were evaluated on tomatoes, while only application time was evaluated on cantaloupe. Application of ethanol mist for 10 seconds was the most effective treatment time, reducing Salmonella by 3.3 log CFU/tomato. Application of ethanol mist was more effective on dry opposed to wet tomato surfaces by approximately 0.7 log CFU/tomato. Ethanol mist application to inoculated tomato stem scars reduced Salmonella 1.2 log CFU/tomato. Additionally, Salmonella decreased by 1.3 log CFU/cm2 on cantaloupe rind plugs at 10 seconds, again the most effective treatment time. Ethanol mist resulted in sufficient reductions of Salmonella populations on dry tomato surfaces, but was limited in effectiveness if the surface was wet, or if Salmonella adhered to the stem scar. Furthermore, this technique was overall not an efficient method to sanitize cantaloupe surfaces. / Master of Science in Life Sciences / Water is often used in washing and moving fresh produce during harvesting. However, this water is often found to be a source of contamination that can cause the fruits or vegetables to become unsafe to eat. In order to resolve this problem, a mist-type sanitizing system is being explored to wash fresh produce in packinghouses. In this experiment, a mist of ethanol (70%) was applied to whole tomato and cantaloupe plugs using a Biomist sanitation system, which turns liquids into a mist. Whole fresh tomatoes and cantaloupe plugs were infected with Salmonella enterica bacteria. Tomatoes and cantaloupe plugs were treated with ethanol mist for various times of 5, 10, or 15 seconds. Additionally, tomatoes were treated with ethanol to compare a wet surfaced tomato, as well as the tomatoes stem scar (where the vine of the tomato is attached during growing). Ethanol mist application was most effective at 10 seconds, but there was very little difference in bacterial elimination when all the times were compared to the untreated tomatoes. In addition, the mists effectiveness decreased if the surface of the tomato was wet compared to dry, and was even less effective if the bacteria were located where the vine attaches. Also, the ethanol mist has very little effect if bacterial contamination is present on a cantaloupes surface. If a harvested tomato remains dry post harvest, ethanol mist may make for a good washing system. However, it is probably not the best for rough surfaced produce like cantaloupes.

Infecções pulmonares de potros jovens por Rhodococcus equi resultam em grave pneumonia levando à morte um grande número de animais todos os anos. Até o momento não há nenhuma vacina aceita globalmente para a prevenção da rodococose equina. O único tratamento preconizado é baseado em antibioticoterapia, porém os protocolos clínicos são longos, de alto custo, com efeitos colaterais e tem favorecido a seleção de cepas resistentes aos antibióticos. Diversas estratégias no desenvolvimento de uma vacina segura e eficiente contra a rodococose foram propostas, porém, não induziram um efeito protetor considerável. O principal fator de virulência do R. equi descrito e amplamente estudado é a proteína vapA, no entanto, outras proteínas localizadas na ilha de patogenicidade estão presentes em amostras de R. equi virulento extraídos de animais infectados. Trabalhos recentes têm demonstrado a presença do gene vapG em todas as cepas virulentas e este gene é altamente expresso quando a bactéria reside no interior de macrófagos, tornando-o um possível alvo vacinal. Nosso grupo já possui experiência prévia no uso de linhagem de Salmonella enterica Typhimurium atenuada carreando a proteína vapA. Baseado nos resultados positivos obtidos, foi construída uma linhagem atenuada de S. enterica Typhimurium 3987 expressando a proteína vapG. A administração desta linhagem em camundongos foi capaz de induzir proteção contra R. equi virulento. Os resultados observados foram a colonização e persistência da Salmonella nos órgãos alvo, a redução da carga bacteriana de R. equi, e a indução de um perfil imune protetor semelhante ao observado em animais adultos resistentes. Observou-se o aumento da produção de IL-12p70 e IFN-, alem da presença de níveis aumentados de IL-4 e a redução dos níveis de TNF-. Observou-se também o aumento na subpopulação de células T auxiliares (CD4+) com perfil de memória, além de aumento na população de linfócitos B totais quando comparado aos grupos controles. Este conjunto de resultados indica que a imunização com Salmonella enterica Typhimurium expressando a proteína vapG gera uma resposta imune celular eficiente tornando esta linhagem uma possível candidata a vetor vacinal. Alem disso, sugere que outros antígenos do R. equi podem ser / Pulmonary infections in young foals by Rhodococcus equi result in severe pneumonia, leading to death a large number of animals every year. There is no globally accepted vaccine for the prevention of equine rhodococosis so far. To date, the only acceptable treatment is based on antibiotics, but the clinical protocols are long lasting, expensive, having side effects and favoring the emergence of drug resistant strains. Several strategies for developing a safe and effective vaccine against rhodococosis have been proposed, however, none has induced a significant protective effect. The main virulence factor of R. equi described and extensively studied is the protein vapA, although other proteins encoded by genes in pathogenicity islands are detected in samples of virulent R. equi, isolated from infected animals. Recent works have demonstrated that the vapG gene is present in all virulent strains, and that this gene is highly expressed when bacteria reside within macrophages, making it a potential vaccine target. Our group has already been working with an attenuated Salmonella enterica Typhimurium strain expressing the VapA protein. Even though our results were very promising, we decided to construct a second vaccine strain expressing the VapG protein. Based on the positive results, it was constructed an attenuated strain of S. enterica Typhimurium 3987 expressing the vapG protein. Interestingly, the VapG-expressing strain induced protection against virulent R. equi in mouse model of infection. We could observe colonization and persistence of Salmonella vaccine cells in target organs, with reduction of bacterial loads of R. equi and induction of a protective immune profile similar to that seen in resistant adult animals. We could also observe increased production of IL-12p70 and IFN- in addition to the presence of increased levels of IL-4 and reduced levels of TNF-. Moreover, we detected an increase in the subpopulation of T helper cells (CD4), with a profile of memory, as well as in the population of B lymphocytes, when compared to control groups. This set of results shows that immunization with Salmonella enterica Typhimurium expressing the VapG protein raises an efficient cellular immune response, making this strain a potential candidate for vaccine vector. Furthermore, this work suggests that other R. equi antigens may be taken into account for vaccine construction, besides the VapA protein utilized in the majority of studies.

Infecções pulmonares de potros jovens por Rhodococcus equi resultam em grave pneumonia levando à morte um grande número de animais todos os anos. Até o momento não há nenhuma vacina aceita globalmente para a prevenção da rodococose equina. O único tratamento preconizado é baseado em antibioticoterapia, porém os protocolos clínicos são longos, de alto custo, com efeitos colaterais e tem favorecido a seleção de cepas resistentes aos antibióticos. Diversas estratégias no desenvolvimento de uma vacina segura e eficiente contra a rodococose foram propostas, porém, não induziram um efeito protetor considerável. O principal fator de virulência do R. equi descrito e amplamente estudado é a proteína vapA, no entanto, outras proteínas localizadas na ilha de patogenicidade estão presentes em amostras de R. equi virulento extraídos de animais infectados. Trabalhos recentes têm demonstrado a presença do gene vapG em todas as cepas virulentas e este gene é altamente expresso quando a bactéria reside no interior de macrófagos, tornando-o um possível alvo vacinal. Nosso grupo já possui experiência prévia no uso de linhagem de Salmonella enterica Typhimurium atenuada carreando a proteína vapA. Baseado nos resultados positivos obtidos, foi construída uma linhagem atenuada de S. enterica Typhimurium 3987 expressando a proteína vapG. A administração desta linhagem em camundongos foi capaz de induzir proteção contra R. equi virulento. Os resultados observados foram a colonização e persistência da Salmonella nos órgãos alvo, a redução da carga bacteriana de R. equi, e a indução de um perfil imune protetor semelhante ao observado em animais adultos resistentes. Observou-se o aumento da produção de IL-12p70 e IFN-, alem da presença de níveis aumentados de IL-4 e a redução dos níveis de TNF-. Observou-se também o aumento na subpopulação de células T auxiliares (CD4+) com perfil de memória, além de aumento na população de linfócitos B totais quando comparado aos grupos controles. Este conjunto de resultados indica que a imunização com Salmonella enterica Typhimurium expressando a proteína vapG gera uma resposta imune celular eficiente tornando esta linhagem uma possível candidata a vetor vacinal. Alem disso, sugere que outros antígenos do R. equi podem ser / Pulmonary infections in young foals by Rhodococcus equi result in severe pneumonia, leading to death a large number of animals every year. There is no globally accepted vaccine for the prevention of equine rhodococosis so far. To date, the only acceptable treatment is based on antibiotics, but the clinical protocols are long lasting, expensive, having side effects and favoring the emergence of drug resistant strains. Several strategies for developing a safe and effective vaccine against rhodococosis have been proposed, however, none has induced a significant protective effect. The main virulence factor of R. equi described and extensively studied is the protein vapA, although other proteins encoded by genes in pathogenicity islands are detected in samples of virulent R. equi, isolated from infected animals. Recent works have demonstrated that the vapG gene is present in all virulent strains, and that this gene is highly expressed when bacteria reside within macrophages, making it a potential vaccine target. Our group has already been working with an attenuated Salmonella enterica Typhimurium strain expressing the VapA protein. Even though our results were very promising, we decided to construct a second vaccine strain expressing the VapG protein. Based on the positive results, it was constructed an attenuated strain of S. enterica Typhimurium 3987 expressing the vapG protein. Interestingly, the VapG-expressing strain induced protection against virulent R. equi in mouse model of infection. We could observe colonization and persistence of Salmonella vaccine cells in target organs, with reduction of bacterial loads of R. equi and induction of a protective immune profile similar to that seen in resistant adult animals. We could also observe increased production of IL-12p70 and IFN- in addition to the presence of increased levels of IL-4 and reduced levels of TNF-. Moreover, we detected an increase in the subpopulation of T helper cells (CD4), with a profile of memory, as well as in the population of B lymphocytes, when compared to control groups. This set of results shows that immunization with Salmonella enterica Typhimurium expressing the VapG protein raises an efficient cellular immune response, making this strain a potential candidate for vaccine vector. Furthermore, this work suggests that other R. equi antigens may be taken into account for vaccine construction, besides the VapA protein utilized in the majority of studies.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:27:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_TamiresFernandaVilasBoas_M.pdf: 3029203 bytes, checksum: 69ac5762ed6eaafac425a284455352cf (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Salmonella enterica é um dos patógenos de origem alimentar mais prevalente. É uma bactéria gram-negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, intracelular facultativa, não formadora de esporo, anaeróbia facultativa, capaz de infectar animais incluindo o homem. Geralmente é adquirida por meio de alimentos contaminados com tal micro-organismo e pode causar em humanos gastroenterite e bacteremia. O presente trabalho propõe a construção de linhagens mutantes de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de proteínas associadas ao nucleóide (NAPs ¿ Nucleoid-Associated Proteins). Tais proteínas auxiliam no enovelamento do DNA, permitindo que o cromossomo bacteriano seja compactado, além disso também influenciam na regulação transcricional de genes, em especial daqueles que respondem a mudanças ambientais. As NAPs são numerosas e o estudo desse grupo é bastante importante, pois vários esclarecimentos ainda precisam ser feitos a respeito de grande parte dessas proteínas. Dados recentes do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que mutantes nulos de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de NAPs são atenuados quanto à virulência e capazes de induzir proteção no modelo murino de infecção. Esses resultados demonstram o importante papel de tais proteínas na virulência bacteriana. Assim, o presente estudo tem como objetivo a construção de mutantes nulos para dois genes codificadores de NAPs (stpA e ybaB) em S. enterica Typhimurium e a avaliação do fenótipo desses mutantes. Não há dados na literatura sobre o papel de tais NAPs com relação à virulência bacteriana. No caso de YbaB, não existem dados na literatura sobre o papel desta NAP em enterobactérias. Foi utilizado o sistema de recombinação ? Red para obtenção dos mutantes. Para observação do fenótipo de tais linhagens, foram feitos experimentos in vitro e in vivo. Os resultados observados nos experimentos in vitro mostram fenótipos interessantes das linhagens mutantes em comparação com as respectivas linhagens selvagens. No caso da mutação ?stpA, foi observada maior sobrevivência de células com essa deleção a certas situações de estresse em comparação com a linhagem selvagem. Já para a mutação ?ybaB, nossos ensaios de motilidade sugerem que a deleção desse gene teve efeito sobre a motilidade das células mutantes. Quanto à virulência dos mutantes construídos, tais mutações não afetaram a patogenicidade de S. enterica de modo considerável. Assim, as linhagens mutantes obtidas no presente trabalho não apresentam potencial de serem aplicadas como vacinas, mas lançam perspectivas para estudos futuros a respeito do papel biológico de YbaB em S. enterica / Abstract: Salmonella enterica is one of the most prevalent foodborne pathogens. It is a gram- negative bacterium, belonging to the Enterobacteriaceae family, intracellular facultative, non-spore forming, anaerobic facultative, capable of infecting animals, including man. It¿s usually acquired through foods contaminated with such microorganism and can cause gastroenteritis and bacteremia in humans. This study proposes the construction of mutant strains of S. enterica Typhimurium for genes encoding nucleoid-associated proteins (NAPs). These proteins help on folding of DNA, allowing the bacterial chromosome to be compressed, also influencing the transcriptional regulation of genes, especially those that respond to environmental changes. The NAPs are numerous and the study of this group is very important, because several explanations still have to be made regarding most of these proteins. Recent data from our research group has shown that null mutants of S. enterica Typhimurium for genes encoding NAPs are attenuated for virulence and capable of inducing protection in a murine model of infection. These results demonstrate the important role of these proteins in bacterial virulence. Thus, the present study aims at the construction of null mutants for two genes encoding NAPs (stpA and ybaB) in S. enterica Typhimurium and at the evaluation of the phenotype of these mutants. There are no data in the literature about the role of such NAPs regarding bacterial virulence. For the YbaB, there are no data in the literature about the role of this NAP in enterobacteria. The ? Red recombination system was used to obtain the mutants. For observation of the phenotype of such strains, in vitro and in vivo experiments were performed. The results obtained in in vitro experiments showed interesting phenotypes of mutant strains compared to their wild-type strains. In the case of ?stpA mutation, increased cell survival was observed on certain stress situations compared to the wild-type strain. For the ?ybaB mutation, our studies suggest that deletion of this gene had effect on motility of mutant cells. For virulence of the constructed mutants, these mutations did not affect the pathogenicity of S. enterica considerably. Thus, the mutant strains obtained in this study have no potential to be applied as vaccines, but this work provides prospects for future studies on the biological role of YbaB in S. enterica / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular