Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Flavia Gontijo de Lima.pdf: 1240048 bytes, checksum: 8f761878f68bc3d24859e788703e5b5c (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 / The species of Brachiaria are important forages from Brazilian tropical regions, mainly the Central-Western region. Some species of Brachiaria have been described as cause of hepatogenous photosensitization in ruminants. Initially, the disease was attributed to the fungus Pithomyces chartarum, but recent studies suggest that the steroidal saponins present in the grasses have toxic principles responsible for the photosensitization. The objective of this study was to evaluate the hepatic function and the performance of lambs fed with B. brizantha hay or sugar cane (Saccharum officinarum L.), by means of clinical examination, laboratory tests, and macro and microscopic analysis of the liver. Twelve Saint Ines lambs were used. The animals were divided into two experimental groups: group hay (six lambs fed with roughage of B. brizantha hay and concentrate) and group sugar cane (six lambs fed with roughage of sugar cane and concentrate). The hay used to feed the lambs did not contain Pithomyces chartarum spores. The clinical examinations occurred at each seven days, the laboratory tests at each 14 days, and the weighings at each 28 days. At the end of 93 days of experiment the lambs were slaughtered, the macroscopic analysis of the the organs was carried out, and the liver fragments were collected for the microscopic analysis. The lambs were clinically healthy, during the whole period, except at the beginning of the experiment, when some animals presented pneumonia. The only biochemistry alterations suggestive of hepatic damage were the increase of the GGT values and the decrease of total cholesterol in both groups. No animal fed with B. brizantha hay presented macroscopic alteration in the liver. The microscopic analysis of the liver revealed preserved hepatocytes and presence of multifocal infiltration of mononuclear inflammatory cells in the hepatic parenchyma and also in the portal triads, characterizing cholangitis in both groups. Degenerations suggestive of hepatic esteatosis were observed in four animals fed with sugar cane. Feeding lambs with B. brizantha hay promoted similar performance than feeding the animals with sugar cane. Regardless of the type of feeding, the lambs presented, as biochemistry alteration of the hepatic function, increase of the serum levels of GGT and decrease of total cholesterol, followed by histological alterations, characteristic of light cholangitis. / As espécies de Brachiaria são importantes forrageiras de regiões tropicais do Brasil, principalmente na região Centro-Oeste. Algumas espécies de Brachiaria têm sido descritas como causadoras de fotossensibilização hepatógena em ruminantes. Inicialmente a enfermidade foi atribuída ao fungo Pithomyces chartarum, mas estudos recentes sugerem que as saponinas esteroidais contidas nas forrageiras possuem princípios tóxicos responsáveis pela fotossensibilização. O objetivo deste estudo foi avaliar a função hepática e o desempenho de ovinos alimentados com feno de B. brizantha ou cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), por meio de exames clínicos, laboratoriais, análise macro e microscópica do fígado. Foram utilizados 12 ovinos da raça Santa Inês que constituíram dois grupos experimentais: grupo feno (seis ovinos alimentados com volumoso feno de Brachiaria brizantha e concentrado) e grupo cana (seis ovinos alimentados com volumoso cana-de-açúcar e concentrado). O feno destinado a alimentação dos animais não possuía esporos do fungo P. chartarum. Os exames clínicos ocorreram a cada sete dias. Os exames laboratoriais a cada 14 dias e as pesagens a cada 28 dias. Ao final de 93 dias de experimento os ovinos foram abatidos, realizada análise macroscópica dos órgãos e colheita de fragmentos de fígado para a análise microscópica. Os animais durante todo o período estiveram clinicamente saudáveis, exceto no início do experimento alguns apresentaram pneumonia. As únicas alterações bioquímicas sugestivas de lesão hepática foram a elevação dos valores de GGT e diminuição de colesterol total em ambos os grupos. Nenhum animal alimentado com feno de B. brizantha apresentou alteração macroscópica no fígado. A análise microscópica dos fragmentos de fígado revelou hepatócitos preservados e presença de infiltrados celulares mononucleares multifocais no parênquima hepático e também no espaço porta, caracterizando-se leve colangite em ambos os grupos. Em quatro animais alimentados com cana-de-açúcar foi observado degenerações micro e macrovacuolares sugestivas de esteatose hepática. A alimentação de ovinos com feno de Brachiaria brizantha promoveu desempenho semelhante a ovinos alimentados com cana-de-açúcar. Independente do tipo de alimentação os ovinos apresentaram como alteração bioquímica da função hepática, elevação nos níveis séricos de GGT e diminuição de colesterol total, acompanhados de alterações histológicas características de leve colangite.