Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) é utilizada como tranqüilizante, seja popularmente ou pela indústria farmacêutica na produção de fitoterápicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar, em camundongos, a atividade geral sobre o Sistema Nervoso Central e o efeito ansiolítico de um extrato hidroetanólico (70%) (EXT) e de duas frações enriquecidas (fração de saponinas - SAP e fração de flavonóides - FLA) obtidos das folhas de P. alata e, também, investigar o envolvimento do complexo receptor GABAA nos efeitos observados. O extrato e as frações foram administrados agudamente, pela via oral, e avaliados nos seguintes modelos: labirinto em cruz elevado, tempo de sono barbitúrico, avaliação da atividade locomotora espontânea, avaliação da coordenação motora em aparelho rota-rod e proteção às convulsões induzidas por pentilenotetrazol. FLA 300 mg/kg e SAP 600 e 900 mg/kg provocaram um efeito do tipo ansiolítico no labirinto em cruz elevado. FLA (CI50= 181,2 μg/mL) e SAP (CI50= 23,4 μg/mL) deslocaram a ligação específica de [3H]-TBOB em membranas sinaptossomais de córtex de ratos adicionadas de GABA (0,3 μM), indicando uma modulação positiva do canal de cloreto ativado por GABA, porém esse efeito não é mediado pelo sítio benzodiazepínico uma vez que ambas as frações não deslocaram a ligação de [3H]-flunitrazepam em concentrações até 300 μg/mL. O extrato hidroetanólico (EXT) provocou efeitodo tipo ansiolítico (300 mg/kg) no labirinto em cruz elevado, o qual foi bloqueado pela administração de flumazenil (6 mg/kg, i.p.). Porém, esse extrato em concentrações até 1000 μg/mL não deslocou a ligação de [3H]-flunitrazepam, indicando que o efeito ansiolítico é mediado pelo sítio benzodiazepínico mas não pela interação direta das substâncias presentes no extrato com este sítio. Na dose de 600 mg/kg não foi observado efeito ansiolítico para o extrato, porém foi verificada uma redução da atividade motora dos animais, indicando um efeito sedativo. EXT 300 e 600 e FLA 300 prolongaram o tempo de sono barbitúrico e SAP (300-900 mg/kg) não apresentou efeito neste teste. Os dados obtidos demonstraram que P. alata apresentou efeito hipnótico-sedativo e ansiolítico em camundongos, os quais parecem ser mediados pela ativação do complexo receptor benzodiazepínico/GABAA e podem estar relacionados com a presença de flavonóides e saponinas. / Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) is used in folk medicine and also by pharmaceutical industry, as raw material in phytotherapy, due its tranquilizing properties. The aims of this work were to evaluate, in mice, the central nervous system general activity and the anxiolytic effect of a hydroethanolic extract (70%) (EXT) and two enriched fractions (saponin fraction – SAP – and flavonoid fraction – FLA), obtained from leaves of P. alata and, also, to investigate the GABAA receptor complex involvement on the observed effects. The extract and the fractions were administrated acutely, by oral route, and evaluated on elevated plus maze, barbiturate sleeping time, locomotor activity, rota-rod, and pentilenotetrazole-induced seizures tests. FLA 300 mg/kg and SAP 300 and 900 mg/kg produced an anxiolyticlike effect on elevated plus maze test. FLA (IC50=181,2 μg/mL) and SAP (IC50=23,4 μg/mL) inhibited the [3H]-TBOB binding to rat cerebral sinaptosomal membranes added of GABA (0,3 μM), which is an indicative of a positive modulation of the chloride channel activated by GABA, but this effect is not mediated by the benzodiazepine binding site, once these fractions in concentrations up to 300 μg/mL did not displaced the [3H]-flunitrazepam. The hidroethanolic extract (EXT) showed anxiolytic-like effect (300 mg/kg) on elevated plus maze test which was prevented by flumazenil (6 mg/kg, i.p.). However, in concentrations up to 1000 μg/mL this extract showed no potency in displacing the [3H]-flunitrazepam binding, indicating that the anxiolytic-like effect is mediated by activation of benzodiazepine binding site, but not by a direct interaction of the compounds presented in this extract at this site. At 600 mg/kg this extract did not show anxiolytic effect but it decreased the motor activity, pointing to a sedative effect. EXT 300 and 600 mg/kg and FLA 300 mg/kg increased the barbiturate sleeping time while SAP (300-900 mg/kg) presented no effects in this test. Taken account of these results, P. alata presented anxiolytic and hypnoticsedative effects in mice. These effects may be mediated by the activation of benzodiazepine/GABAergic complex, and can be related to the presence of both flavonoids and saponins.

Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.

Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) é utilizada como tranqüilizante, seja popularmente ou pela indústria farmacêutica na produção de fitoterápicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar, em camundongos, a atividade geral sobre o Sistema Nervoso Central e o efeito ansiolítico de um extrato hidroetanólico (70%) (EXT) e de duas frações enriquecidas (fração de saponinas - SAP e fração de flavonóides - FLA) obtidos das folhas de P. alata e, também, investigar o envolvimento do complexo receptor GABAA nos efeitos observados. O extrato e as frações foram administrados agudamente, pela via oral, e avaliados nos seguintes modelos: labirinto em cruz elevado, tempo de sono barbitúrico, avaliação da atividade locomotora espontânea, avaliação da coordenação motora em aparelho rota-rod e proteção às convulsões induzidas por pentilenotetrazol. FLA 300 mg/kg e SAP 600 e 900 mg/kg provocaram um efeito do tipo ansiolítico no labirinto em cruz elevado. FLA (CI50= 181,2 μg/mL) e SAP (CI50= 23,4 μg/mL) deslocaram a ligação específica de [3H]-TBOB em membranas sinaptossomais de córtex de ratos adicionadas de GABA (0,3 μM), indicando uma modulação positiva do canal de cloreto ativado por GABA, porém esse efeito não é mediado pelo sítio benzodiazepínico uma vez que ambas as frações não deslocaram a ligação de [3H]-flunitrazepam em concentrações até 300 μg/mL. O extrato hidroetanólico (EXT) provocou efeitodo tipo ansiolítico (300 mg/kg) no labirinto em cruz elevado, o qual foi bloqueado pela administração de flumazenil (6 mg/kg, i.p.). Porém, esse extrato em concentrações até 1000 μg/mL não deslocou a ligação de [3H]-flunitrazepam, indicando que o efeito ansiolítico é mediado pelo sítio benzodiazepínico mas não pela interação direta das substâncias presentes no extrato com este sítio. Na dose de 600 mg/kg não foi observado efeito ansiolítico para o extrato, porém foi verificada uma redução da atividade motora dos animais, indicando um efeito sedativo. EXT 300 e 600 e FLA 300 prolongaram o tempo de sono barbitúrico e SAP (300-900 mg/kg) não apresentou efeito neste teste. Os dados obtidos demonstraram que P. alata apresentou efeito hipnótico-sedativo e ansiolítico em camundongos, os quais parecem ser mediados pela ativação do complexo receptor benzodiazepínico/GABAA e podem estar relacionados com a presença de flavonóides e saponinas. / Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) is used in folk medicine and also by pharmaceutical industry, as raw material in phytotherapy, due its tranquilizing properties. The aims of this work were to evaluate, in mice, the central nervous system general activity and the anxiolytic effect of a hydroethanolic extract (70%) (EXT) and two enriched fractions (saponin fraction – SAP – and flavonoid fraction – FLA), obtained from leaves of P. alata and, also, to investigate the GABAA receptor complex involvement on the observed effects. The extract and the fractions were administrated acutely, by oral route, and evaluated on elevated plus maze, barbiturate sleeping time, locomotor activity, rota-rod, and pentilenotetrazole-induced seizures tests. FLA 300 mg/kg and SAP 300 and 900 mg/kg produced an anxiolyticlike effect on elevated plus maze test. FLA (IC50=181,2 μg/mL) and SAP (IC50=23,4 μg/mL) inhibited the [3H]-TBOB binding to rat cerebral sinaptosomal membranes added of GABA (0,3 μM), which is an indicative of a positive modulation of the chloride channel activated by GABA, but this effect is not mediated by the benzodiazepine binding site, once these fractions in concentrations up to 300 μg/mL did not displaced the [3H]-flunitrazepam. The hidroethanolic extract (EXT) showed anxiolytic-like effect (300 mg/kg) on elevated plus maze test which was prevented by flumazenil (6 mg/kg, i.p.). However, in concentrations up to 1000 μg/mL this extract showed no potency in displacing the [3H]-flunitrazepam binding, indicating that the anxiolytic-like effect is mediated by activation of benzodiazepine binding site, but not by a direct interaction of the compounds presented in this extract at this site. At 600 mg/kg this extract did not show anxiolytic effect but it decreased the motor activity, pointing to a sedative effect. EXT 300 and 600 mg/kg and FLA 300 mg/kg increased the barbiturate sleeping time while SAP (300-900 mg/kg) presented no effects in this test. Taken account of these results, P. alata presented anxiolytic and hypnoticsedative effects in mice. These effects may be mediated by the activation of benzodiazepine/GABAergic complex, and can be related to the presence of both flavonoids and saponins.

Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este estudo investiga os efeitos gastroprotetores da hecogenina, uma saponina esterÃide, isolada de Agave sisalana, em modelos experimentais de Ãlcera gÃstrica. Camundongos Swiss machos foram utilizados nos modelos de Ãlcera gÃstrica induzida pelo etanol e indometacina. Para identificarmos os mecanismos de aÃÃo da hecogenina, os papÃis de Ãxido nÃtrico (NO), do grupos sulfidrilicos nÃo protÃicos (GSH), dos canais de K+ ATP e das prostaglandinas foram tambÃm investigados assim como determinaÃÃes da peroxidaÃÃo lipÃdica (TBARS) e dos nÃveis de nitrito no estÃmago de animais tratados com hecogenina e de grupos controle foram realizadas. AlÃm disso, foi avaliado o efeito da hecogenina sobre a contagem de mastÃcitos, bem como sobre a liberaÃÃo da mieloperoxidase (MPO), um biomarcador de inflamaÃÃo foram estudados em neutrÃfilos humanos in vitro. Foram avaliados a atividade antimicrobina para o Helicobacter pylori e a expressÃo de COX-2, TNF-α, IL-1β, Ãxido nÃtrico sintase induzida (iNOS), NF-kB-p50 NLS (sequÃncia de localizaÃÃo nuclear) atravÃs da tÃcnica de imunohistoquÃmica em modelo de Ãlcera gÃstrica agudo e crÃnico. Os nossos resultados mostraram que a hecogenina (15, 30,60 e 90 mg/ kg, p.o.) administrada de forma aguda, antes do etanol ou indometacina, exibiu um potente efeito gastroprotetor, bem como reduziu o nÃmero de mastÃcitos. Embora os prÃ-tratamentos com L-NAME, um inibidor de iNOS, e capsazepina, um agonista do receptor TRPV1, nÃo foram capazes de reverter o efeio da hecogenina, este foi revertido por glibenclamida, um bloqueador de K+ATP e por indometacina no modelo de Ãlcera induzida por etanol. O prÃ-tratamento com hecogenina reduziu de modo significativo os nÃveis de GSH, peroxidaÃÃo lipÃdica e nitrito no modelo de lesÃo gÃstrica induzida por etanol. A droga por si sà aumentou a expressÃo de COX-2, e este efeito foi ainda melhor na presenÃa de etanol tendo diminuido tambÃm a liberaÃÃo de MPO. A hecogenina nÃo demonstrou efeitos significativos sobre o modelo de ligadura do piloro e trÃnsito intestinal em camundongos. No modelo crÃnico, o tratamento com a hecogenina foi capaz de melhorar a cicatrizaÃÃo de Ãlceras gÃstricas induzidas pelo Ãcido acÃtico promovendo significativa regeneraÃÃo da mucosa gÃstrica. Ademais, hecogenina 90 mg/Kg diminuiu a marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-α, NOSi, IL-1β, NF-kB-p50 NLS na mucosa gÃstrica tanto em experimento agudo como no crÃnico. Em conclusÃo, os resultados obtidos indicam que a hecogenina possui atividade gastroprotetora em modelos agudo e crÃnico e capacidade de promover cicatrizaÃÃo de Ãlcera da mucosa gÃstrica. AlÃm disso, demonstramos que a hecogenina apresenta um efeito gastroprotetor significativo que parece ser mediado pela abertura de canais de K+ATP pela via COX- 2/PG. AlÃm disso, as propriedades antioxidantes e anti-inflamatÃrias podem desempenhar um papel no efeito gastroprotetor da droga. Constata-se tambÃm que o efeito anti-Ãlcera pode ser devido Ãs suas propriedades de aumentar o mecanismo de defesa da mucosas e atravÃs da supressÃo da inflamaÃÃo mediada por TNF-α, NOSi, IL-1β, NF-kB. / This study investigates the gastroprotective effects of hecogenin, a steroid saponin isolated from Agave sisalana, on experimental models of gastric ulcer. Male Swiss mice were used in the models of ethanol- and indometacin-induced gastriculcer. To clarify the hecogenin mechanism of action, the roles of nitric oxide (NO), sulfhydryls (GSH), K+ATP channels and prostaglandins were also investigated, and measurements of lipid peroxidation (TBARS assay) and nitrite levels in the stomach of hecogenin-treated and untreated animals were performed. Furthermore, the effects of hecogenin on myeloperoxidase (MPO) release from human neutrophils were assessed in vitro. Our results showed that hecogenin (3.1, 7.5, 15, 30, 60 and 90 mg/kg, p.o.) acutely administered, before ethanol or indomethacin, exhibited a potent gastroprotective effect. Although the pretreatments with L-NAME, an iNOS inhibitor, and capsazepine, a TRPV1 receptor agonist, were not able to reverse the hecogenineffect, this was reversed by glibenclamide, a K+ATP blocker, and indomethacin in the model of ethanol-induced gastric lesions. The hecogenin pretreatment normalized GSH levels and significantly reduced lipid peroxidation and nitrite levels in the stomach, as evaluated by the ethanol-induced gastric lesion model. The drug alone increased COX-2 expression and this effect was further enhanced in the presence of ethanol. It also decreased MPO release and significantly protected the gastric mucosa. In conclusion, we showed that hecogenin presents a significant gastroprotective effect that seems to be mediated by K+ATP channels opening and the COX-2/PG pathway. In addition, its antioxidant and anti-inflammatory properties may play a role in the gastroprotective drug effect.

Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) é utilizada como tranqüilizante, seja popularmente ou pela indústria farmacêutica na produção de fitoterápicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar, em camundongos, a atividade geral sobre o Sistema Nervoso Central e o efeito ansiolítico de um extrato hidroetanólico (70%) (EXT) e de duas frações enriquecidas (fração de saponinas - SAP e fração de flavonóides - FLA) obtidos das folhas de P. alata e, também, investigar o envolvimento do complexo receptor GABAA nos efeitos observados. O extrato e as frações foram administrados agudamente, pela via oral, e avaliados nos seguintes modelos: labirinto em cruz elevado, tempo de sono barbitúrico, avaliação da atividade locomotora espontânea, avaliação da coordenação motora em aparelho rota-rod e proteção às convulsões induzidas por pentilenotetrazol. FLA 300 mg/kg e SAP 600 e 900 mg/kg provocaram um efeito do tipo ansiolítico no labirinto em cruz elevado. FLA (CI50= 181,2 μg/mL) e SAP (CI50= 23,4 μg/mL) deslocaram a ligação específica de [3H]-TBOB em membranas sinaptossomais de córtex de ratos adicionadas de GABA (0,3 μM), indicando uma modulação positiva do canal de cloreto ativado por GABA, porém esse efeito não é mediado pelo sítio benzodiazepínico uma vez que ambas as frações não deslocaram a ligação de [3H]-flunitrazepam em concentrações até 300 μg/mL. O extrato hidroetanólico (EXT) provocou efeitodo tipo ansiolítico (300 mg/kg) no labirinto em cruz elevado, o qual foi bloqueado pela administração de flumazenil (6 mg/kg, i.p.). Porém, esse extrato em concentrações até 1000 μg/mL não deslocou a ligação de [3H]-flunitrazepam, indicando que o efeito ansiolítico é mediado pelo sítio benzodiazepínico mas não pela interação direta das substâncias presentes no extrato com este sítio. Na dose de 600 mg/kg não foi observado efeito ansiolítico para o extrato, porém foi verificada uma redução da atividade motora dos animais, indicando um efeito sedativo. EXT 300 e 600 e FLA 300 prolongaram o tempo de sono barbitúrico e SAP (300-900 mg/kg) não apresentou efeito neste teste. Os dados obtidos demonstraram que P. alata apresentou efeito hipnótico-sedativo e ansiolítico em camundongos, os quais parecem ser mediados pela ativação do complexo receptor benzodiazepínico/GABAA e podem estar relacionados com a presença de flavonóides e saponinas. / Passiflora alata Curtis (PASSIFLORACEAE) is used in folk medicine and also by pharmaceutical industry, as raw material in phytotherapy, due its tranquilizing properties. The aims of this work were to evaluate, in mice, the central nervous system general activity and the anxiolytic effect of a hydroethanolic extract (70%) (EXT) and two enriched fractions (saponin fraction – SAP – and flavonoid fraction – FLA), obtained from leaves of P. alata and, also, to investigate the GABAA receptor complex involvement on the observed effects. The extract and the fractions were administrated acutely, by oral route, and evaluated on elevated plus maze, barbiturate sleeping time, locomotor activity, rota-rod, and pentilenotetrazole-induced seizures tests. FLA 300 mg/kg and SAP 300 and 900 mg/kg produced an anxiolyticlike effect on elevated plus maze test. FLA (IC50=181,2 μg/mL) and SAP (IC50=23,4 μg/mL) inhibited the [3H]-TBOB binding to rat cerebral sinaptosomal membranes added of GABA (0,3 μM), which is an indicative of a positive modulation of the chloride channel activated by GABA, but this effect is not mediated by the benzodiazepine binding site, once these fractions in concentrations up to 300 μg/mL did not displaced the [3H]-flunitrazepam. The hidroethanolic extract (EXT) showed anxiolytic-like effect (300 mg/kg) on elevated plus maze test which was prevented by flumazenil (6 mg/kg, i.p.). However, in concentrations up to 1000 μg/mL this extract showed no potency in displacing the [3H]-flunitrazepam binding, indicating that the anxiolytic-like effect is mediated by activation of benzodiazepine binding site, but not by a direct interaction of the compounds presented in this extract at this site. At 600 mg/kg this extract did not show anxiolytic effect but it decreased the motor activity, pointing to a sedative effect. EXT 300 and 600 mg/kg and FLA 300 mg/kg increased the barbiturate sleeping time while SAP (300-900 mg/kg) presented no effects in this test. Taken account of these results, P. alata presented anxiolytic and hypnoticsedative effects in mice. These effects may be mediated by the activation of benzodiazepine/GABAergic complex, and can be related to the presence of both flavonoids and saponins.

Saponinas triterpênicas incluem uma ampla variedade de moléculas com diversas aplicações farmacológicas. As saponinas das folhas de Quillaja brasiliensis, espécie nativa do Sul do Brasil, são estrutural e funcionalmente semelhantes às encontradas nas cascas da espécie chilena Quillaja saponaria, as quais são utilizadas atualmente como adjuvantes em formulações comerciais de vacinas. O perfil de acúmulo da fração imunoadjuvante de saponinas triterpênicas de Q. brasiliensis (QB-90) foi avaliado em resposta a diferentes fatores de estresse. O conteúdo de QB-90 em discos foliares aumentou significativamente com a aplicação de diferentes agentes de estresse osmótico. Também pôde ser observado aumento nos teores de saponinas pela exposição de discos foliares a ácido salicílico, ácido jasmônico, ultrassom e luz ultravioleta C. Experimentos com plântulas indicaram um aumento significativo nos teores de QB-90 com o aumento moderado de irradiância luminosa e pela aplicação de dano mecânico nas folhas. Os resultados obtidos apoiam o papel de defesa induzida que estes metabólitos apresentam in planta. Com o objetivo de avançar os estudos de atividade adjuvante de Q. brasiliensis e ampliar a extensão de antígenos testados, uma vacina contra poliovírus foi avaliada em camundongos. Resultados demonstraram que as formulações de vacinas contendo saponinas da espécie brasileira aumentaram níveis de anticorpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a, sugerindo um estímulo de ambos tipos de resposta imune (Th1 e Th2). A resposta celular foi confirmada por ensaios de DTH e pela avaliação dos níveis de mRNA das citocinas IL-2 e IFN- em esplenócitos murinos. A resposta imune de mucosas foi demonstrada pelos aumentos nos níveis de IgA em bile, fezes e lavados vaginais. O segundo objeto de estudo desta Tese é a espécie Centella asiatica (L.) Urban, que também apresenta saponinas triterpênicas bioativas em suas partes aéreas. Uma enzima responsável pela glicosilação de ácido asiático e ácido madecássico foi parcialmente purificada. Usando técnicas de proteômica e dados de sequências de cDNA, a sequência completa do clone que codifica uma glicosiltransferase foi obtida. O produto gênico recombinante, UGT73AD1, foi funcionalmente expresso em Escherichia coli, purificado por cromatografia de afinidade por metal imobilizado e funcionalmente caracterizado. UGT73AD1 foi identificada como sendo uma glicosiltransferase triterpênica de ácidos carboxílicos, provavelmente envolvida na biossíntese de monodesmosídeos da espécie. / Triterpene saponins include a large variety of molecules that find several applications in pharmacology. The saponins from leaves of Quillaja brasiliensis, a native species from Southern Brazil, show structural and functional similarities to those of Quillaja saponaria barks, which are currently used as adjuvants in vaccine formulations. The accumulation patterns of an immunoadjuvant fraction of leaf triterpene saponins (QB-90) in response to stress factors were examined. The content of QB-90 in leaf disks was significantly increased by application of different osmotic stress agents. Higher yields of bioactive saponins were also observed upon exposure to salicylic acid, jasmonic acid, ultrasound and UV-C light. Experiments with shoots indicated a significant increase in QB-90 yields with moderate increases in white light irradiance and by mechanical damage applied to leaves. These results support a general induced defense role for these metabolites in planta. Aiming at advancing the studies of Q. brasiliensis adjuvant activity and amplifying the range of antigens tested, an inactivated virus-based vaccine against poliovirus was evaluated in mice. Results demonstrated that saponin formulations were able to enhance poliovirus- specific total IgG, IgG1 and IgG2a, suggesting stimulation of both Th1 and Th2 immune responses. Cellular response stimulation was confirmed by DTH assays and by evaluating the enhancement of IL-2 and IFN-γ cytokine mRNA expression in mice splenocytes. Mucosal immune responses demonstrated that the QB-90-adjuvanted vaccine enhanced IgA titers in bile, feces and vaginal washings. Centella asiatica (L.) Urban, a species accumulating triterpene bioactive saponins in its shoots, was also subject of study in this Thesis. An enzyme capable of glucosylating asiatic and madecassic acids was partially purified. Using proteomic methods and cDNA sequence data, a full-length cDNA clone encoding the glucosyltransferase was obtained. The recombinant gene product, UGT73AD1, was functionally expressed in Escherichia coli, purified by immobilized metal-affinity chromatography and functionally characterized. UGT73AD1 was identified as a triterpene carboxylic acid glucosyltransferase, likely involved in monodesmoside biosynthesis in C. asiatica.

This thesis examined the antimicrobial activity of select neotropical plants from Costa Rica and traditional Q’eqchi Maya medicines from Belize. In particular the potential for interference with bacterial quorum sensing (QS) and biofilm formation as well as fungal growth were assessed. Of one hundred and twenty six extracts collected from Costa Rica, one third showed significant QS inhibition while 13 species displayed more biofilm inhibitory activities than the positive control allicin. The active species belonged to the Lepidobotryaceae, Melastomataceae, Meliaceae, Sapindaceae, and Simaroubaceae. Twelve Marcgraviaceae species were tested for the same biological activities; of these, three showed similar QS inhibition to that of the positive control Delisea pulchra (Greville) Montagne and five with at least 30% biofilm inhibition. Only one species inhibited fungal growth – Marcgravia nervosa Triana & Planch. Bioassay-guided isolation of this plant resulted in the identification of the active principle as a naphthoquinone, with a minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 85 to 100 μM against Saccharomyces cerevisiae. Similarly, sixty one Q’eqchi’ Maya medicinal plant species were evaluated for their antimicrobial activities. Of these, four species showed more QS inhibition than D. pulchra, seven with comparable biofilm inhibitory activities that of allicin, and two with similarly antifungal activity to berberine. Two spirostanol saponins were isolated from Cestrum schlechtendahlii G.Don, an active antifungal plant. The major saponin showed growth inhibition against Saccharomyces cerevisiae and Fusarium graminearum, with MICs of 16.5 μM and 132 μM, respectively. Further analyses of this compound using chemical genomics suggested that its antifungal mechanism of action is pleiotropic, affecting multiple targets. Taken together, these findings showed that neotropical plants and traditional Q’eqchi’ Maya medicines contain phytochemicals that interfere with bacterial biofilm formation and quorum sensing as well as fungal growth.

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Although the molecular mechanisms underlying the onset and progression of cancer has been unraveled to a great extend, cancer continues to remain a leading cause of death around the world. Clinical efficacy of the existing anticancer drugs are largely compromised by the inherent and acquired resistance of cancer cell types and the severe side effects evoked by chemotherapeutic agents. Hence, the search for novel anticancer drugs with minimum side effects remains an active area of cancer research. Although molecular targeted drugs are preferred over the conventional cytotoxic chemotherapy, the screening of natural compounds with cytotoxic potentialities continues as they can serve as lead structures for the development of tumor selective anticancer drugs. Plants and microorganisms have been the prominent sources of therapeutic agents. Microorganisms being readily renewable, inexhaustible sources of diverse bioactive secondary metabolites are preferred over plants as sources of bioactive compounds. Endophytes are microorganisms that reside within the living tissue of host plant and they enhance the survival value of the host plant by mediating various stress tolerance mechanisms. Endophytic fungi have gained attention as potential sources of bioactive secondary metabolites following the discovery of a taxol producing endophytic fungus Taxomyces adrenae, from Taxus brevifolia. Moreover, endophytes occupy a unique biological niche in which they maintain a balanced interaction with the host organism and other co-inhabiting microorganisms. All these factors contribute to the chemical diversity of the metabolites they produce. Plants restricted to extreme or unique habitats or those with ethnobotanical value are likely to lodge endophytes that possess a unique hoard of secondarymetabolites. Saraca asoca is a traditionalmedicinal plant with its occurrence restricted to countries such as India, Sri Lanka, Burma and Malaysia. The purpose of the present study is to explore the endophytic fungal population associated with S. asoca in search of novel anticancer lead structures. S. asoca was found to house a diverse endophytic fungal population belonging to 37 different species. Identification of the fungal isolates was based on ITS (internal transcribed spacer region) sequence analysis as well as colony and spore characteristics. The organic extracts of all fungal species were assessed for their in vitro cytotoxicities in three human cancer cell lines, HeLa, HepG2 and PC3 byMTT assay. 18 species exhibited remarkable cytotoxic activities, among which Pestalotiopsis sp. 6 exhibited themost significant cytotoxicity. The strain with second highest activity was Lasiodiplodia theobromae. In order to identify the active principle present in the organic extracts of Pestalotiopsis sp. 6 and L. theobromae, the organic extracts were chromatographed on TLC plates and individual compounds were recovered by scraping off from the TLC plates and extracting with methanol. The cytotoxicity assay of the TLC purified compounds suggested the cytotoxic activity of Pestalotiopsis sp.6 to be a synergetic effect of two or more compounds whereas the cytotoxicity of L. theobromae organic extract was largely due to a single compound. Hence the active principle present in L. theobromae organic extract was purified by bioassay - guided column chromatography. Repeated chromatography of the crude extract using three silica gel columns resulted in the isolation of anticancer compound. Based on the analysis of ESI-MS, IR, NMR and UV spectral data, the isolated compound was identified as a novel steroidal saponin, cholestan-3-O-¯-Dglucopyranoside (cholestanol glucoside - CG). The in vitro cytotoxic effects of CG towards seven human cancer cell lines, HeLa, HepG2, PC3, U251,MCF 7, OVCAR3 and A549 were examined. Among the cell lines screened, HeLa cells weremost vulnerable to CG treatment, with an IC50 value of 3.2 ¹M. Hence themode of cell death induction in HeLa cells by CG was further investigated. Analysis of cell cycle progression by propidium iodide (PI) staining revealed that CG arrests the cells in S phase of cell cycle prior to the induction of cell death. The morphological and biochemical features of apoptosis were investigated by nuclear staining, DNA fragmentation assay and Annexin V-FITC/ PI dual staining. All these results suggested that CG effectively induced apoptosis in HeLa cells in a concentration dependent manner. It was also found that CG treatment induced remarkable ROS generation and mitochondrial membrane potential loss. The pretreatment of cells with an antioxidant, N-acetyl cysteine (NAC), blocked CG induced ROS generation, mitochondrialmembrane depolarization and apoptotic cell death. Hence it could be concluded that CG kills the cancer cells by augmenting their basal oxidative stress and hence is less likely to be toxic to normal cells. Moreover, a high Bax to Bcl-2 ratio, high levels of Apaf-1 and p53, activation of procaspase-3 and procaspase-9 and cleavage of PARP were observed in CG treated HeLa cells. Taken together, our results suggested that CG induced apoptosis in HeLa cells via ROS mediated mitochondria dependent pathway. Biosynthesis of secondarymetabolites by filamentous fungi is influenced by the availability of nutrient factors. Therefore, it is essential to optimize the culturemedium components to ensure a maximum and consistent yield of desired metabolite by the fungal isolate. We designed a chemically defined production medium for CG production by L. theobromae. Carbon source, nitrogen source and microelements in the production medium were further optimized in stationary flask cultures to improve the mycelial growth and yield of CG by L. theobromae. The conventional one-factor at a time (OFAT)method was employed for the optimization of carbon and nitrogen sourceswhose contribution effects towards the final yield are large. Response surface methodology (RSM) was employed for the optimization of microelements. Optimization of culturemedium enhanced the yield of CG from 10mg L¡1 to 50mg L¡1. Various secondarymetabolites are produced by organisms in response to different stress conditions. This knowledge has been exploited in plant cell culture systems to increase the yield of particular secondary metabolites by artificial implementation of stress conditions. We investigated the effect of oxidative, osmotic and heat shock stresses on the production of CG by L. theobromae. Heat shock and osmotic stresses in liquid cultures were found to enhance the yield of CG by 1.2-fold, relative to the controls. Oxidative stress by both menadione and H2O2 enhanced the yield by 1.8-fold compared to the controls. Thus oxidative stress proved to be an efficient enhancer of CG production by L. theobromae. These findings ensure a large scale, cost-effective production of CG.