Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 80-96).

Spt6 is a conserved eukaryotic transcription factor, known to interact with both nucleosomes and RNA polymerase II (RNAPII) to control transcription. We have initiated study of Spt6 in S. pombe in order to identify both novel and conserved roles in regulation of transcription and chromatin. We first constructed and analyzed spt6 mutants by several approaches. As Spt6 is known to be required for histone H3K36 methylation in both Saccharomyces cerevisiae and human cells, we examined the global levels of several histone modifications; we found that in S. pombe, Spt6 is required for both H3K4 and H3K36 trimethylation. We examined the chromatin state at two highly expressed genes, \(act1^+\) and \(pma1^+\), and found that there is a defect in recruitment of the methyltransferases responsible for those marks, Set1 and Set2, respectively. We also observed loss of nucleosomes, as well as a decrease in histone H2B monoubiquitylation. These results suggest that Spt6 plays an important role in chromatin regulation during transcription. We also conducted transcriptional analysis of an spt6 mutant by both microarray and high-throughput sequencing (RNA-seq) and discovered that Spt6 plays a critical role in maintaining the integrity of transcription genome-wide. We found that Spt6 is required to repress antisense transcription, with nearly 70% of genes having antisense transcripts increased by at least two-fold in an spt6 mutant. We also found that transcription of most long terminal repeats (LTRs) is derepressed. Finally, we found that a major class of transcripts elevated in the spt6 mutant is derived from heterochromatin, which is normally silenced. To study the heterochromatic silencing defect in greater detail, we analyzed the chromatin state of the pericentric repeats and found a decrease in H3K9 trimethylation, elevated levels of H3K14 acetylation, reduced recruitment of several known silencing factors and a loss of siRNA production. We also see a very modest increase in RNAPII recruitment. Based on this combination of phenotypes, Spt6 is likely to contribute to both transcriptional and post-transcriptional silencing mechanisms. Taken together, we have found that Spt6 plays several important roles to control transcription in both euchromatin and heterochromatin in S. pombe.

L?????tude qui vous est pr??sent??e dans ce m??moire est r??alis??e chez l???organisme Schizosaccharomyces pombe et elle porte sur la caract??risation de la prot??ine Nab2, une prot??ine liant les queues poly(A) ainsi que sur son implication dans la r??gulation g??nique. Tout d???abord, il faut savoir qu???il existe quatre modes de r??gulation (transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel) dans lesquels interviennent diff??rents types de prot??ines, en particulier des prot??ines liant les queues poly(A) des ARN, aussi connues sous le nom de PABPs. Ces prot??ines reconnaissent l???ARN ?? l???aide de diff??rents domaines de liaison et elles se subdivisent en deux cat??gories : les PABPs nucl??aires ou cytoplasmiques, repr??sent??es respectivement par PABPN1 et PABPC1 chez les mammif??res. Comprendre la fonction des PABPs rev??t un int??r??t particulier puisqu???elles sont impliqu??es ?? diff??rents stades de la r??gulation g??nique. Des maladies ont aussi ??t?? associ??es ?? deux PABPs nucl??aires humaines, PABPN1 et ZC3H14, mais aucune association entre leur fonction r??ciproque et la maladie n???a pu ??tre ??tablie. Une des fa??ons de comprendre leur r??le est d?????tudier celui de leurs orthologues respectifs. Chez la levure ?? fission, un orthologue de PABPN1 a ??t?? caract??ris?? et il s???agit de Pab2. S. pombe poss??de cependant une seconde PABP nucl??aire, Nab2, qui est caract??ris??e dans ces travaux. Des m??thodes in vivo et in vitro ont ??t?? utilis??es afin de confirmer le statut de la prot??ine, ?? savoir qu???il s???agit bel et bien d???une PABP nucl??aire et que celle-ci est non essentielle. L???identification de partenaires prot??iques de Nab2 par spectrom??trie de masse a aussi permis de relier Nab2 avec des processus de r??gulation g??nique tels que l?????pissage et la d??gradation. Puisque Pab2 est aussi associ??e ?? des fonctions en lien avec la d??gradation, il est possible de faire un parall??le entre ces deux prot??ines et de supposer qu???elles interagissent ensemble. La deuxi??me partie de ces travaux porte donc sur l?????tude de la relation fonctionnelle entre Nab2 et Pab2 et elle a permis de montrer un m??canisme de r??gulation opportuniste bas?? sur la liaison de la cible ARN par l???une ou l???autre de ces PABPs. En effet, l?????tude de la r??gulation du g??ne mod??le RPL30-2 indique que Nab2 et Pab2 ont des r??les oppos??s puisqu???ils sont respectivement des r??gulateurs positifs et n??gatifs de l???expression de son transcrit.

In eukaryotes, the endoplasmic reticulum is the site where folding of secretory proteins and the assembly of multimeric cell surface receptors take place. These processes are mediated by molecule chaperones that include the ER membrane bound chaperone calnexin and the sequence related calreticulin. Using a PCR strategy, a homologue for the mammalian calnexin/calreticulin family, CNE1, was isolated in S. cerevisiae. The CNE1 gene product, Cne!p, is an integral membrane glycoprotein of the ER. Disruption of the CNE1 gene did not lead to inviable cells or to gross effects on the levels of secreted wild type proteins. However, in CNE1 disrupted cells, there was an increase in the cell-surface expression of a normally intracellularly retained temperature sensitive mutant of the $ alpha$-pheromone receptor, Ste2-3p. In addition, an increase in the secretion of heterologously expressed mammalian $ alpha sb1$-antitrypsin was also observed in CNE1 disrupted cells. In order to study calnexin function in another genetically manipulable organism, a Schizosaccharomyces pombe calnexin homologue was sought. Using a similar PCR strategy, a S. pombe calnexin homologue, $cnx1 sp+$, was identified. The $cnx1 sp+$ gene product, Cnx1p, was shown to be a calcium binding type I integral membrane glycoprotein. Unlike the sequence related S. cerevisiae CNE1 gene, the $cnx1 sp+$ gene was essential for cell viability. Full length Cnx1p was able to complement the $cnx1 sp+$ gene disruption but full length mammalian calnexin could not. The ER lumenal domain of Cnx1p, which was secreted from cells, was capable of complementing the $cnx1::ura4 sp+$ lethal phenotype. Both wild type PI M1 (Val 213) $ alpha sb1$-antitrypsin and the ER retained PI Z variant were expressed in S. pombe cells. As in mammalian cells, wild type $ alpha sb1$-antitrypsin was normally secreted whereas the PI Z variant was retained intracellularly. Rescue of the secretion defective phenotype of the PI Z variant occurred in

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Stuttgart, Univ., Diss., 2008.

Thesis (Ph. D. in Cell and Developmental Biology)--Vanderbilt University, May 2005. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

Peu de données sont connues à savoir comment des protéines méiotiques régulent la recombinaison homologue de façon biochimique. Lors d'études effectuées chez l'humain, il a été démontré que hRad51 se comporte sensiblement comme le fait son homologue bactérien, RecA. Malgré que hDmc1 possède une séquence d'acides aminés possédant 52% d'identité à celle de hRad51, ses caractéristiques et ses capacités sont différentes. Afin d'étudier si cette disparité est conservée chez l'organisme Schizosaccharomyces pombe nous avons purifié et étudié biochimiquement la protéine Dmc1 de cet organisme. Nous montrons que spDmc1 lie préférentiellement l'ADN simple brin et protubérant à l'ADN double brin, une propriété similaire à son homologue bactérien RecA. SpDmc1 purifiée est capable de catalyser des réactions d'échange de brins, telles que rencontrées durant la recombinaison homologue. Contrairement à la protéine humaine, spDmc1 a la capacité de lier l'ADN et d'y former un filament hélicoïdal, la signature des recombinases classiques.

Afin de mieux comprendre la fonction et l'importance de l'interférence à l'ARN (iARN) chez les eucaryotes, l'identification des protéines cellulaires pouvant moduler ou être requises pour le fonctionnement de l'iARN, en particulier pour la fonction de la ribonucléase Dicer, et des protéines régulées par l'iARN est essentielle. Dans le premier volet de cette étude, nous avons réalisé des coimmunoprécipitations pour identifier les protéines cellulaires pouvant interagir avec Dicer chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Deux protéines ont ainsi été identifiées par analyse protéomique, soit la protéine ribosomale L12 et la protéine Byr3. Le deuxième volet de cette étude a consisté à identifier les protéines régulées par la voie de l'iARN chez S. pombe. Nous avons donc procédé à des analyses par gel 2D du protéome des lignées Hu303 (type sauvage) et Hu679 (Dcr1?). Ces analyses suggèrent un rôle possible de la voie de l'iARN dans le contrôle de la glycolyse.