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Plusieurs rapports ont suggéré que les formes réactives de l'oxygène (FRO) et d'azote sont impliquées dans la pathogénèse de la ScS. Les fibroblastes ScS de la peau et des organes internes surproduisent des FRO qui déclenchent la prolifération des fibroblastes et la synthèse de collagène de type I, conduisant à l'initiation et à la progression de la ScS. Le laboratoire a mis au point un modèle de souris ScS, induite par injections itératives de HOCl. Comme dans la ScS humaine, les fibroblastes de la peau de souris ScS produisent de manière constitutive de grandes quantités de FRO. Nous avons utilisé cette propriété pour induire sélectivement l'apoptose de fibroblastes de souris ScS. Le catalyseur organotelluride-(PHTE) 2NQ et le composé naturel Dipropyltertrasulfide (DPTTS) sont capables d'augmenter specifiquement la production de FRO par les fibroblastes et d’induire un stress oxydatif létal dans les fibroblastes sclérodermiques. Ce phénomène n'a aucun impact sur les fibroblastes normaux qui présentent des taux de FRO basaux faible et un statut oxydant / antioxydant normal. De nombreuses études ont également prouvé l’importance des espèces azotées dans la l’induction de la ScS. Chez les patients atteints de SSc, le taux sérique de l'oxyde nitrique est considérablement accru. De plus, le NO peut se combiner avec d'autres radicaux libres comme l'anion superoxyde (O•-2) pour former le peroxynitrite (ONOO-) qui est hautement cytotoxique et contribue à l'inflammation, la fibrose et l'apoptose des cellules endothéliales. La production de NO par les cellules endothéliales ou les fibroblastes peut être stimulée par l'angiotensine II, principal peptide de la voie rénine-angiotensine (RAS). Comme chez les patients atteints de sclérodermie, les souris HOCl/ScS présentent des taux sériques d'angiotensine II élevés, ce qui est favorable à la prolifération des fibroblastes, à la fibrose, et à l'inflammation. Ces observations nous ont conduites à tester les effets de l'Irbésartan, un antagoniste des récepteurs de l’angiotensine II de type I (AT1 RA) dans le ScS modèle murin. Un nouveau modèle animal basé sur l'exposition chronique à des ROS et présentant de nombreuses similitudes avec la maladie humaine, m'a permis d'étudier de nouveaux traitements de la ScS. Ces nouvelles approches sont basées sur l'action cytotoxique de composés pro-oxydants - (PHTE) 2NQ et DPTTS - et sur les effets anti-nitrosatifs de molécules comme l'Irbésartan. Ces stratégies thérapeutiques originales ouvrent des perspectives intéressantes dans le traitement de la ScS, où l'arsenal thérapeutique est actuellement encore limité. / Several reports have suggested that reactive oxygen and nitrogen species are involved in SSc pathogenesis. SSc fibroblast from skin and internal organs overproduce ROS that trigger the proliferation of fibroblasts and the synthesis of type I collagen leading to the initiation and progresion of SSc. As in human SSc, skin fibroblasts from SSc mice constitutively produce large amounts of ROS. We have used this property to selectively induce apoptosis in the diseased fibroblast of SSc mice. Indeed, the organotelluride catalyst-(PHTE)2NQ and natural organosulfur compound – Dipropyltertrasulfide (DPTTS) are able of increasing ROS production by fibroblasts and inducing a lethal oxidative stress specificaly in SSc fibroblasts. This phenomenon has no impact on normal fibroblasts that present normal levels of ROS and a normal oxidant/antioxidant status. Many studies have also proved an importance of nitrogen species in the pathogenesis of SSc. In patients with SSc, the serum level of nitric oxide is significantly increased. Furthermore, NO can combine with other free radicals like superoxide anion (O•-2) to form the highly cytotoxic peroxynitrite (ONOO−) that contributes to inflammation, fibrosis and apoptosis of endothelial cells. Production of NO by endothelial cells or by fibroblasts can be stimulated by angiotensin II, the main peptide of the renin-angiotensin system (RAS). The level of angiotensin II is increased in SSc patients as well as in our HOCl mouse model and can promote proliferation of fibroblasts, fibrosis, and inflammation. These observations led us to test irbesartan, an angiotensin II type I receptor antagonist (AT1 RA) in the murine model of SSc. A new animal model based on chronic exposure to ROS and with many similarities to the human disease, allowed me to study new therapeutic approaches in SSc based on the cytotoxic action of pro-oxidative compounds - (PHTE)2NQ and DPTTS - and on the anti- nitrosative effect of irbesartan. These new therapeutic strategies open interesting perspectives in the treatment of SSc, where the therapeutic arsenal is currently still limited.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie qui peut engager le pronostic vital des malades de façon très rapide. La pathogénie de la maladie reste encore obscure mais est liée aux atteintes vasculaires probablement en lien avec la fibrose cutanée. La thérapeutique de cette maladie est difficile. Aucun traitement étiologique n'existe et la prise en charge est plutôt axée sur les traitements des différentes atteintes. La iontophorèse cutanée est un dispositif qui permet la diffusion de molécules en solution à travers la peau grâce à une stimulation électrique de manière non invasive. Cette technique a été utilisée initialement comme test physiologique. Notre objectif est d'évaluer et de développer la iontophorèse thérapeutique, notamment avec des molécules vasodilatatrices, pour pouvoir l'utiliser dans des applications thérapeutiques telles que la pris en charge des ulcérations digitales (ou troubles trophiques cutanés) de la ScS. Trois parties ont été développées. La première partie consiste en l'association de deux molécules vasodilatatrices (une per os, le sildenafil, et en iontophorèse, le nitroprussiate de sodium (SNP), en étudiant la tolérance de l'association et son effet sur le flux vasculaire cutané chez le volontaire sain (étude INFLUX-VS). La deuxième partie correspond à un screening de molécules ayant une action vasodilatatrice et étant délivrées en iontophorèse chez le rat : l'étude INFLUX-RAT conclue à l'obtention d'une vasodilatation cutanée chez le rat avec les analogues de la prostacycline. La troisième partie correspond à l'évaluation chez le volontaire sain de la iontophorèse des analogues de la prostacycline : l'étude INFLUX-IT-VS conclue à une dilatation du flux sanguin cutané avec le tréprostinil et avec une bonne tolérance cutanée et systémique. La dernière partie correspond aux avancées parallèles des travaux tant dans le domaine de la reproductibilité des techniques d'acquisition des signaux du flux sanguin cutané que les études réalisées avec les patients sclérodermiques à qui on pourrait espérer un jour voir proposer une iontophorèse thérapeutique. / Systemic scleroderma (ScS) is a rare disease that may be associated with a poor prognosis. The pathogenesis of the disease remains still unclear but comprises vascular abnormalities related to skin fibrosis. ScS disease treatment is difficult. No etiologic therapy is available and patient's management is rather centred on the treatments of the different organs failure symptoms. Skin iontophoresis is a non invasive technique, which allows a transcutaneous diffusion of molecules in solution thanks to an electrical stimulation. This technique was initially used as physiological test. Our objective is to test and to develop therapeutic iontophoresis, in particular with molecules possessing vasodilator properties. The final objective is to use it in therapeutic applications such as the treatment of ScS digital ulcerations. Three parts will be developed in the present work. The first part describes the association of two vasodilatator drugs (sildenafil used per os, associated with sodium nitroprusside used through cathodal iontophoresis. We studied the safety of the association and its effect on the skin vascular flow in healthy volunteers (INFLUX-VS study). The second part describes the screening of vasodilatator drugs delivered through cutaneous iontophoresis in rats (INFLUX-RAT study). The aim of the study was to select the more potent drugs in term of maximal rat skin vasodilatation. The more potent drugs were prostacyclins analogues. The third part describes the iontophoresis of prostacyclins analogues in healthy volunteers: the INFLUX-IT-VS study. The more potent cutaneous vasodilatation was observed with treprostinil, with a good skin and systemic tolerance. The last part decribes the reproducibility of the techniques used to quantify skin blood flow along with studies using these techniques in scleroderma patients. These are required to enable a reproducible evaluation of the effect of skin iontophoresis in patients with scleroderma

La Sclérodermie Systémique (ScS) est une maladie auto-immune rare et complexe, cliniquement divisée en deux sous-groupes : la ScS cutanée diffuse (dc-ScS) et la ScS cutanée limitée (lc-ScS). Les anticorps anti-topoisomérase et anti-centromère (ATA et ACA) sont respectivement les marqueurs de chaque sous-groupe. Beaucoup d'études ont analysé les gènes des Antigènes leucocytaires humains (HLA), fort facteur de risque, dans plusieurs groupes ethniques de patients atteints de ScS. La plupart des allèles de susceptibilité HLA-DRB1 (*11:01, *11:04, *15:01, *08:02…) et DQB1 (*03:01, *03:02, *06:01 and *06:02) ont en commun une séquence d'acides aminés, respectivement 67FLEDR71 et 71TRAELDT77 sur leurs chaînes β. Pour la première fois, nous évaluons le risque relatif conféré par une ou deux doses de 67FLEDR71 et/ou une ou deux doses de 71TRAELDT77 chez des patients Caucasiens Français atteints de SSc. Nous montrons que le motif 67FLEDR71 est fortement associé à la dc-ScS et encore plus à la production d'ATA, alors que l'association de 71TRAELDT77 est plus faible dans les deux sous-groupes. Notre groupe a montré récemment dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) que les patients qui n'ont pas les allèles de susceptibilité à la PR peuvent acquérir ces allèles via les cellules fœtales et/ou maternelles, aussi appelé Microchimérisme (Mc). Nous avons testé la même hypothèse dans la ScS. Contrairement à la PR, nos résultats n'ont pas démontré un tel transfert de susceptibilité via le Mc dans la SSc. Finalement, la présence d'auto-anticorps, liée à un génotype HLA, est précieuse au diagnostic et /ou pronostic de la maladie (ex : ACA ou ATA). / Systemic sclerosis (SSc) is a rare and complex autoimmune disease clinically divided into two subgroups: diffuse cutaneous (dcSSc) and limited cutaneous (lcSSc). Anti-topoisomerase and anti-centromere antibodies (ATA and ACA) are respectively markers of each subset. Many studies have analyzed Human Leukocyte Antigen (HLA) genes, the strongest genetic risk factor, in several ethnic groups in patients with SSc. Most common HLA-DRB1 (*11:01, *11:04, *15:01, *08:02…) and HLA-DQB1 (*03:01, *03:02, *06:01 and *06:02) susceptibility alleles have in common an amino acid sequence, respectively 67FLEDR71 and 71TRAELDT77 on their β chains. For the first time, we evaluate the relative risk conferred by one or two 67FLEDR71 and/or one or two 71TRAELDT77 motives among Caucasian French patients with SSc. We show that 67FLEDR71 motif is highly associated with dcSSc and even more with ATA production, whereas 71TRAELDT77 association is weaker in both subgroups. Our group has recently shown in Rheumatoid Arthritis (RA) that patients who lack the RA HLA susceptibility that it could be transferred to patients via fetal and/or maternal cells, also called microchimerism (Mc). We test the same hypothesis in SSc. Contrary to RA, our results fail to demonstrate such transfer of HLA susceptibility via Mc in SSc. Finally linked to a particular HLA genotype is the presence of autoantibodies, helpful for disease diagnosis and/or prognosis (i.e. ACA or ATA). Patients who do not have these markers are difficult to diagnose or classify. By ProtoArray® technique, we identify 6 new auto-antigens in the plasmas of SSc patients.

Près de la moitié des patients atteints de sclérodermie systémique (ScS) présentent des troubles de la pigmentation cutanée. La mélanogenèse est sous la dépendance, outre les facteurs épidermiques, de facteurs dermiques produits par les fibroblastes et les cellules endothéliales. Parmi ces facteurs se trouve NOV (CCN3) (protéine appartenant à la même famille que CTGF (CCN2), protéine pro-fibrotique augmentée dans la ScS) qui aurait un rôle anti-fibrotique. Nous souhaitons ainsi disséquer le lien entre la composante fibrotique dermique et la pigmentation épidermique. Pour cela, des biopsies cutanées ont été réalisées chez 21 patients ScS, en zone lésionnelle (scléreuse avec ou sans trouble de pigmentation) et non lésionnelle pour 12 d’entre eux. Ces biopsies ont été séparées en 3 fragments qui ont été soit fixés pour analyses histologiques et immunohistochimiques, soit congelés à -80°C pour analyse protéomique ou transcriptomique, soit dissociés pour isoler les cellules cutanées afin de les analyser en protéomique ou transcriptomique. Des témoins de peau et des cellules saines sont utilisées en contrôle. Nous avons dégagé deux types de troubles pigmentaires : une hyperpigmentation s’apparentant à un photo-vieillissement, et une dépigmentation péri-folliculaire apparaissant de manière précoce. Les niveaux d’expression de CCN2 et CCN3 varient chez les patients en fonction des données cliniques, aussi bien au niveau protéique qu’au niveau immunohistochimique. S’il existe des différences en fonction de l’atteinte pigmentaire, il semble que dans les fibroblastes sclérodermiques, la balance CCN2/CCN3 soit déséquilibrée tant au niveau de la zone lésionnelle que cliniquement non lésionnelle, suggérant que CCN2 et 3 pourraient être dérégulés intrinsèquement ou à des stades précoces. Ce travail pourrait aboutir à l’identification d’un phénotype précoce basé sur l’atteinte pigmentaire, et au développement d’une thérapie basée sur la rééquilibration du ratio CCN2/CCN3. / Systemic Sclerosis (SSc) is a rare but potentially deadly connective tissue disease. Its pathophysiology remains partly unknown but combines auto-immunity, small and large vessels involvement and fibrosis of the connective tissue, affecting all organs. Skin features are considered as diagnostic and prognosis markers and include for some patients the presence of pigmentary disorders. In this work, we looked into pigmentary disorders in SSc and their relationship with the pathophysiology of the disease. First, we analyzed the presence of pigmentary disorders among a local cohort of 239 patients as well as their association with systemic involvement in the disease. We have found that diffuse hyperpigmentation was associated with an increased risk of vascular involvement in SSc, particularly digital ulcers. Then, we investigated the molecular basis behind this association. Proteins of the CCN (CYR61 / CTGF / NOV) family are multimodular proteins secreted in the extra-cellular matrix, where they take part in numerous biological processes, such as cell proliferation, adhesion, collagen secretion. Within this family, CCN3 (also called NOV) is a promising candidate, being implicated both in angiogenesis and epidermal homeostasis. We studied CCN3 expression in the skin of SSc patients presenting or not pigmentary disorders, as compared to healthy controls. We found that CCN3 expression was particularly decreased in the dermal vessels in situ, as well as in endothelial cells in vitro. CCN3 inhibition in endothelial cells resulted in altered angiogenesis in vitro, through a decrease in cell migration. We also studied CCN3 expression in SSc epidermis. SSc patients presenting hyperpigmentation exhibited decreased CCN3 in their melanocytes as well as increased CCN3 in their keratinocytes, compared to patients without pigmentary disorders. Overall, CCN3 represents a promising therapeutic lead for SSc patients with vascular involvement, which could bespotted early thanks to the presence of hyperpigmentation.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie qui peut engager le pronostic vital des malades de façon très rapide. La pathogénie de la maladie reste encore obscure mais est liée aux atteintes vasculaires probablement en lien avec la fibrose cutanée. La thérapeutique de cette maladie est difficile. Aucun traitement étiologique n'existe et la prise en charge est plutôt axée sur les traitements des différentes atteintes. La iontophorèse cutanée est un dispositif qui permet la diffusion de molécules en solution à travers la peau grâce à une stimulation électrique de manière non invasive. Cette technique a été utilisée initialement comme test physiologique. Notre objectif est d'évaluer et de développer la iontophorèse thérapeutique, notamment avec des molécules vasodilatatrices, pour pouvoir l'utiliser dans des applications thérapeutiques telles que la pris en charge des ulcérations digitales (ou troubles trophiques cutanés) de la ScS. Trois parties ont été développées. La première partie consiste en l'association de deux molécules vasodilatatrices (une per os, le sildenafil, et en iontophorèse, le nitroprussiate de sodium (SNP), en étudiant la tolérance de l'association et son effet sur le flux vasculaire cutané chez le volontaire sain (étude INFLUX-VS). La deuxième partie correspond à un screening de molécules ayant une action vasodilatatrice et étant délivrées en iontophorèse chez le rat : l'étude INFLUX-RAT conclue à l'obtention d'une vasodilatation cutanée chez le rat avec les analogues de la prostacycline. La troisième partie correspond à l'évaluation chez le volontaire sain de la iontophorèse des analogues de la prostacycline : l'étude INFLUX-IT-VS conclue à une dilatation du flux sanguin cutané avec le tréprostinil et avec une bonne tolérance cutanée et systémique. La dernière partie correspond aux avancées parallèles des travaux tant dans le domaine de la reproductibilité des techniques d'acquisition des signaux du flux sanguin cutané que les études réalisées avec les patients sclérodermiques à qui on pourrait espérer un jour voir proposer une iontophorèse thérapeutique.

La sclérodermie (SSc) est une pathologie grave caractérisée par une atteinte microvasculaire combinée à une fibrose cutanée. Au niveau des extrémités, ce phénomène provoque des ulcères digitaux (UD) particulièrement douloureux et qui contribuent à diminuer la qualité de vie des patients atteints. La cicatrisation des UD est difficile et souvent de mauvais pronostic avec d’importants risques d’infection voire d’amputation. A ce jour, les injections intraveineuses d’iloprost, un analogue de la prostacycline, sont le seul traitement reconnu mais leur utilisation entraîne des effets secondaires et requiert une hospitalisation. Le treprostinil, un autre analogue de la prostacycline, est susceptible d’induire une importante vasorelaxation ce qui en fait une molécule d’intérêt majeur dans la prise en charge des UD. La sclérodermie est une pathologie complexe et aucun modèle animal ne présente l’ensemble de ses caractéristiques physiopathologiques. Parmi les modèles existants nous avons sélectionnés deux modèles murins (HOCL et uPAR-/-) récemment décrits comme étant prometteurs pour développer de nouvelles approches thérapeutiques dans la prise en charge des symptômes de la SSc.L’objectif de cette étude est d’évaluer l’iontophorèse de treprostinil comme stratégie locale pour induire une accélération de la cicatrisation d’ulcères provoqués sur modèles de SSc. Brièvement, une lésion a été réalisée par excision de peau au niveau du dos de souris. Les animaux ont été répartis aléatoirement dans trois groupes : « témoin », « contrôle » et « treprostinil » et les plaies ont été suivies jusqu’à cicatrisation complète.Les animaux traités par iontophorèse de treprostinil présentent une cicatrisation accélérée. Ces résultats ont été observés pour les deux modèles de SSc. L’effet le plus important a été mesuré au cours de la phase précoce de la cicatrisation.Cette étude est la première a démontré que la iontophorèse de treprostinil s’avère être une piste prometteuse dans la prise en charge thérapeutique des UD chez les patients atteints de SSc. D’autres études précliniques devront être menées pour mieux comprendre les mécanismes et une étude clinique devra confirmer ce résultat sur des patients. / Systemic Sclerosis (SSc) is a serious disease affecting the skin microcirculation and characterized by fibrosis. Digital ulcers (DU) are the principal manifestation of this microvascular dysfunction in the extremities. DUs are frequent, painful, can cause functional impairment and have a major negative impact on the quality of life. Wound healing of DU is delayed and this can result in gangrene and amputation. To date, intravenous prostacyclin analogues (iloprost) are the only approved treatment for active SSc-related DU but their use is limited by serious vasodilation-induced side effects and usually requires hospitalization. Treprostinil is a prostacyclin receptor agonist that induces vascular relaxation and is used to treat advanced digital ischemia. Treprostinil is a very interesting candidate to enhance wound healing of ulcers in fibrotic skin. Scleroderma is a complex pathology and there is none existing animal model that can encompass all aspects of the disease related to fibrosis and vasculopathy. Among existing models, we selected two murin models (HOCL and uPAR-/-) that were recently described as promising tool to study SSc-related vasculopathy and fibrosis such as digital ulcers.The main objective of this study was to evaluate the therapeutic effect of topical administration of treprostinil on wound healing in two different preclinical models of SSc. Briefly, cutaneous excisional wounds were induced on mice. Animals were randomized into 3 sub-groups according the treatment to be administered: “sham”, “control” and “treprostinil” and wound process was followed until full recovery.Treprostinil iontophoretically-administered induced a significant acceleration in wound healing process in both models of SSc. The most significant effect was observed during the early phase of the healing process.This study demonstrated that iontophoresis of treprostinil could be proposed as a local therapeutic strategy to SSc patients with digital ulcers. Further pre-clinical studies should be realized to explore the underlying pharmacological and electrical mechanisms involved and clinical study should be started soon to assess the potential effect on SSc-related ulcers.

La sclérodermie systémique (ScS) est une connectivite associant atteinte vasculaire, auto-immunité et fibrose. Cette pathologie est associée à une morbi-mortalité importante, et les ressources thérapeutiques sont limitées. La physiopathologie de la ScS n’est que partiellement connue, mais il apparait que les liens entre le système immunitaire et la fibrose sont étroits. Ainsi, la ScS peut être considérée comme un modèle prototypique d’étude des liens immunité-fibrose. Il s’agit d’une maladie hétérogène, c’est-à-dire que les phénotypes cliniques présentés par les patients sont variables, rendant complexe l’établissement d’une classification des patients en groupes homogènes. Mieux comprendre cette hétérogénéité est un préalable indispensable à la constitution d’endotypes, permettant l’étude des mécanismes physiopathologiques propres à chacun d’entre eux.L’objectif de cette Thèse a été de mieux appréhender cette hétérogénéité clinique et d’étudier la place des marqueurs immunologiques, en particulier les auto-anticorps, en tant que biomarqueurs de cette hétérogénéité.Le premier travail a été une classification sans a priori des patients de la cohorte européenne EUSTAR (European Scleroderma Trials and Research Group) par une analyse en cluster sur 24 variables sélectionnées (atteintes cliniques, auto-anticorps). Deux puis 6 groupes de patients homogènes ont été obtenus, dont la survie était significativement différente. Ce travail a suggéré qu’il existait des groupes homogènes de patients au-delà de la dichotomie historique forme cutanée diffuse vs. limitée. La présence d’atteintes viscérales et le statut des auto-anticorps apparaissent comme des éléments importants dans la constitution des groupes.Le deuxième travail s’est intéressé au dosage des chaines légères libres sériques (serum free light chain : SFLC) dans la ScS. Le taux de SFLC est plus élevé chez les patients ScS que chez les contrôles et est associé à des paramètres de gravité de la maladie tels que le score de Rodnan, les scores d’activité, les pressions pulmonaires et la DLCO. Cette étude apporte des arguments supplémentaires pour évoquer la participation active des lymphocytes B à la physiopathologie de la ScS.Nous avons ensuite réalisé une estimation de la prévalence des anticorps anti-ARN polymérase de type III dans notre cohorte de patients avec ScS avant d’inclure ces données dans une revue systématique avec méta-analyse. Ce travail a montré que la prévalence de ces anticorps était hétérogène entre les centres. Les facteurs potentiels pouvant expliquer une partie de cette hétérogénéité sont des facteurs géographiques, suggérant l’implication de facteurs génétiques et/ou environnementaux.Le dernier travail a été dédié à l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) des connectivites, en particulier de la ScS. A partir d’une cohorte de patients provenant du centre de référence de l’HTAP du Royaume-Uni, les anticorps anti-U1RNP ont été analysés en tant que marqueur pronostique. Ces anticorps sont associés de façon significative à une meilleure survie des patients avec connectivite et HTAP. Dans la ScS, on observe une tendance vers une meilleure survie également chez les patients porteurs de ces anticorps.Les auto-anticorps constituent donc des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques puissants dans la ScS. Ils permettent de mieux cerner l’hétérogénéité de cette pathologie, et devraient probablement être intégrés dans les futures classifications. Leur rôle pathogénique reste encore à démontrer. Les perspectives de notre travail sont d’identifier de nouveaux auto-anticorps et d’étudier leurs effets sur le fibroblaste, cellule effectrice centrale de la fibrose. / Systemic sclerosis (SSc) is a connective tissue disease (CTD) characterized by vasculopathy, auto-immunity and fibrosis. This condition is associated with a significant morbi-mortality, and the therapeutic armamentarium is limited. The pathological mechanisms of SSc are partially known, but the links between the immune system and fibrosis appear tight. ScS can be considered as a prototypical model for the study of the links between immunity and fibrosis. There is a high heterogeneity in SSc. The clinical phenotypes of patients are highly variable, making the classification of patients into homogeneous groups complex. A better understanding of this heterogeneity could lead to the identification of endotypes, which are needed to study the pathophysiological processes of each group.This PhD Thesis aimed to better decipher this clinical heterogeneity and to assess the immunological components, in particular auto-antibodies, as biomarkers of heterogeneity.The first work was a without any a priori cluster analysis in the EUSTAR (European Scleroderma Trials and Research Group) cohort using 24 selected variables (encompassing clinical involvement and auto-antibodies). Two then 6 homogeneous clusters were obtained, with significantly different survival curves. We suggested that there could be homogeneous groups of patients beyond the classical dichotomy diffuse cutaneous form vs. limited. Organ involvement as well as antibody status were suggested to play a major role in defining homogeneous groups of patients with different prognosis.Our second work assessed the value of serum free light chain (SFLC) in SSc. The SFLC level was higher in SSc patients than in controls and was associated with severity parameters, such as Rodnan skin score, disease activity score, pulmonary pressures and DLCO. This study suggested that B cells could play an active role in the mechanisms of SSc.Then we estimated the prevalence of anti-RNA polymerase III antibodies in SSc in our cohort of patients followed by a systematic review with meta-analysis. We showed that the prevalence was highly heterogeneous between centers. Potential factors explaining partly the observed heterogeneity were geographical factors, which underscore the probable implication that genetic background and environmental factors play a role.Finally we focused on CTD-associated pulmonary arterial hypertension (PAH) in a large cohort of patients from the United Kingdom national reference center for PAH. We assessed whether anti-U1 RNP antibodies could be a prognostic factor in CTD-associated PAH with a focus on SSc- associated PAH. Anti-U1RNP antibodies were significantly associated with a decreased mortality in CTD-PAH patients. There was a trend towards a decreased mortality in SSc-PAH patients with anti-U1RNP antibodies.Auto-antibodies are strong biomarkers of diagnosis and prognosis in SSc. They allow to partly capture the clinical heterogeneity of this condition, and should be integrated in the future classifications of patients. Their pathogenic role remains to be shown. We plan to identify new auto-antibodies in SSc and to study their direct effects on the fibroblast, which is the key effector cell of fibrosis.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie rare et incurable, caractérisée par une fibrose cutanée et la production d’auto-anticorps (maladie auto-immune). Le pronostic vital est engagé dans les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, responsables de fibrose pulmonaire. Par leurs propriétés immunomodulatrices et anti-fibrotiques, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) constituent une approche prometteuse pour traiter la ScS. Ce travail a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique des CSM dans un modèle préclinique de forme diffuse de la maladie (d-ScS).Patients et Méthodes : Nous avons évalué l’effet de différentes modalités d’injections des CSM par voie intraveineuse dans le modèle murin de ScS-HOCl. Ce modèle, basé sur l’injection d’acide hypochloreux (HOCl), induit un phénotype proche des formes d-ScS. Nous avons notamment comparé un traitement préventif et curatif, des approches syngénique, allogénique et xénogénique, et l’utilisation de CSM d’origine adipocytaire (ASC) à celle de CSM de moelle osseuse (CSM-MO).Résultats : Le modèle ScS-HOCl est caractérisé par l’installation d’un phénotype de d-ScS, avec fibrose cutanée, pulmonaire et production d’anticorps anti-topoisomérase 1. Nous montrons l’effet bénéfique d’une injection préventive ou curative de CSM syngéniques, réduisant la fibrose cutanée et pulmonaire. Cet effet thérapeutique passe par une diminution de la réponse immune réduisant l’inflammation tissulaire et la production d’auto-anticorps, ainsi que par l’induction du remodelage tissulaire via l’activation de métalloprotéases, et l’augmentation des défenses anti-oxydantes. Un bénéfice similaire est obtenu lors d’approches allogénique et xénogénique. Les ASC présentent des capacités immunosuppressives et de remodelage supérieures aux CSM-MO.Discussion et conclusion : Nos travaux démontrent l’effet anti-fibrotique des CSM dans un modèle préclinique pertinent de ScS, mimant les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, pour lesquelles les besoins thérapeutiques sont importants. Le mode d’action pléiotropique des CSM, combinant propriétés anti-inflammatoires, pro-remodelage et anti-oxydantes, est prometteur en vue des applications cliniques à venir dans cette maladie.Mots-clés : sclérodermie systémique, cellules souches mésenchymateuses, HOCl / Systemic sclerosis (SSc) is a rare intractable disease characterized by skin fibrosis and autoimmunity. Diffuse and rapidly progressive SSc (d-SSc) is associated with life-threatening involvements such as lung fibrosis, where there still is an unmet medical need. Displaying immunomodulatory and antifibrotic properties, mesenchymal stem cells (MSC) are an attractive cure for SSc. In this study, we aim at evaluating the therapeutic potential of MSC in a preclinical model of d-ScS.Patients and Methods: We evaluated the effects of MSC infusion in the murine model of ScS-HOCl, based on repeated injections of hypochlorite (HOCl). We compared several approaches using MSC in a preventive and curative approach, in syngeneic, allogeneic and xenogeneic settings, and using MSC isolated from adipose tissue (ASC) or bone marrow (BM-MSC).Results: ScS-HOCl is close to d-ScS phenotype, leading to skin and lung fibrosis, together with anti-topoisomerase 1 antibody production. We show beneficial effects of a preventive or curative injection of syngeneic MSCs, reducing tissue fibrosis. Fibrosis reduction following MSC treatment involves immunosuppressive effects, tissue remodeling via metalloprotease activation, and anti-oxydant activity. Similar benefits are observed in allogeneic and xenogeneic settings. ASC display greater immunosuppressive and remodeling capacities than BM-MSCs.Discussion and conclusion: Our study demonstrates the anti-fibrotic effects of MSCs in a relevant preclinical model of ScS, mimicking diffuse and rapidly progressive ScS. Pleiotropic capabilities of MSCs, combining anti-inflammatory, remodeling and antioxidant properties, are promising for future clinical applications in this disease.Keywords: systemic sclerosis, mesenchymal stem cells, HOCl

La pneumopathie interstitielle (PI) est devenue la principale cause de décès de la sclérodermie systémique (ScS). Au cours de PI, l’activation immunitaire déclenche une forte production du monoxyde d’azote (NO) et l’augmentation de la concentration de NO dans l’air expiré des patients atteints de ScS avec PI suggère que cette méthode pourrait détecter précocement l’alvéolite, afin de traiter à temps la PI pour éviter son évolution vers la fibrose pulmonaire. En utilisant le modèle à deux compartiments séparant le NO alvéolaire (CANO) du NO bronchique, nous avons montré que la CANO est : (1) augmentée chez les patients atteints de ScS comparativement aux volontaires sains; (2) associée à l’alvéolite et (3) corrélée à la sévérité de la PI. De plus, une valeur de CANO = 10,8 ppb permettait d’affirmer la présence de la PI et une valeur = 3,8 ppb, d’écarter l’existence d’une PI avec une valeur prédictive= 95%. Le modèle bi-compartimenté néglige la distribution arborisée des voies aériennes et la diffusion axiale du NO, que prend en compte le nouveau « modèle de la trompette ». Les résultats de CANO des 2 méthodes sont comparables (rho=0,98, p<0.001). Enfin, La capacité des sérums à induire la prolifération des fibroblastes pulmonaires et sa conversion en myofibroblaste est augmentée chez les patients atteints de ScS avec une CANO > 5ppb par rapport à celle des patients atteints de ScS qui ont une CANO = 5 ppb et à celle des volontaires sains. Nos résultats suggèrent une relation possible entre l’inflammation alvéolaire et la fibrose pulmonaire au cours de la ScS / Interstitial lung disease (ILD) has become the main cause of death in systemic sclerosis (SSc). In ILD, immune activation leads to strong nitric oxide (NO) output by inducible NO synthase. Increased the whole fractional rate of NO in exhaled air has been reported in SSc patients with ILD and suggested that exhaled NO can be an accurate none-invasive marker of early alveolar inflammation in order to initiate in time treatment. The two compartment-model method partitioned exhaled NO into alveolar concentration (CANO) and conducting airway flux, We hypothesized that overproduction of NO in the lung eventually leads to ILD in SSc. We have found that CANO is significantly increased in SSc patients as compared with healthy controls. We have also demonstrated that high levels of CANO were related to alveolitis and the severity of ILD in SSc. Moreover, we have found that ILD could be ruled in (positive predictive value > 95%) when CANO = 10.8 ppb, and ruled out when CANO values = 3.8 ppb (negative predictive value > 95%). The two-compartment model neglected the trumpet shape of airway tree and the axial diffusion of NO that the advanced “trumpet model” takes account. We have found that CANO levels assessed by the two models were comparable (rho=0,98, p<0.001). Finally, we have found that the serum ability to induce lung fibroblast proliferation and myofibroblast transition was increased in SSc patients with high levels of CANO (>5ppb) as compared to SSc patients with low levels of CANO (=5ppb) and healthy controls. Our findings suggest a possible link between alveolar inflammation, and lung fibrosis in SSc. 1624 caractères avec espace