Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-23T13:12:54Z No. of bitstreams: 1 2016_CarlosJoseCorreiaSantana.pdf: 4211658 bytes, checksum: 205d3007401d3ab41de38c51de3078b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:10:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CarlosJoseCorreiaSantana.pdf: 4211658 bytes, checksum: 205d3007401d3ab41de38c51de3078b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:10:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CarlosJoseCorreiaSantana.pdf: 4211658 bytes, checksum: 205d3007401d3ab41de38c51de3078b1 (MD5) / Atualmente, é crescente o número de micro-organismos resistentes aos antibióticos convencionais sendo imprescindível o desenvolvimento de novas alternativas que possam conter o aumento da resistência microbiana. Os peptídeos antimicrobianos surgem como uma alternativa interessante, pois atuam sobre a membrana plasmática, reduzindo a possibilidade de resistência. A secreção cutânea de anfíbios é uma fonte rica de peptídeos antimicrobianos e muitos destes também apresentam atividade antiproliferativa e citotóxica sobre células tumorais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a secreção cutânea de Hypsiboas raniceps quanto à presença de peptídeos com atividade antiproliferativa e citotóxica sobre bactérias e fungos patogênicos, bem como células de melanoma murino (B16F10). Foram identificados e purificados dois peptídeos inéditos, denominados Hr22 e Hr24, com potente atividade sobre bactérias, principalmente sobre patógenos Gram-positivos e também mostraram-se ativos sobre eritrócitos humanos, células de melanona (B16F10) e fibroblastos normais (NIH3T3). No caso dos efeitos sobre células de melanoma, observou-se que os peptídeos também foram tóxicos para as células normais testadas, entretanto o peptídeo Hr24 indicou uma provável seletividade em relação às células de câncer, com uma dose efetiva com cerca da metade do valor obtido para as células normais. O tratamento empregando-se a dose correspondente ao IC75 do peptídeo Hr22 reduziu o número de células viáveis e a maioria das células apresentaram membrana plasmática danificada. Ambos os peptídeos induziram uma maior exposição de fosfatidilserina (marcada com anexina V-FITC) e não apresentaram marcação somente com iodeto de propídio (PI) quando testados na dose correspondente ao IC50. Empregando-se a dose do IC75 do peptídeo Hr22, observou-se alterações no potencial de membrana mitocondrial, além da fragmentação de DNA e alterações no ciclo celular, sugerindo morte celular por apoptose. Mais estudos são necessários para a melhor compreensão de como agem estes peptídeos. A produção de análogos com modificações estruturais podem melhorar suas atividades e especificidades tanto para micro-organismos quanto para células de câncer. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Currently, the number of microorganisms resistant to conventional antibiotics is rising, thus the development of new alternatives that may hold back this increase in resistance is essential. The antimicrobial peptides emerged as an attractive alternative because they act on the plasma membrane, reducing the possibility of resistance. Amphibian skin secretion is a rich source of these peptides and many of them also have activity on tumor cells. The present study aimed to evaluate Hypsiboas raniceps skin secretion for the presence of peptides with antiproliferative and cytotoxic activity against pathogenic bacteria and fungi, as well as murine melanoma cells (B16F10). Two novel peptides were identified, named Hr22 and Hr24, with potent activity against bacteria, especially on Gram-positive pathogens, also showing activity on human red blood cells, melanoma cells (B1F10) and normal fibroblasts (NIH3T3). In respect to the effects on melanoma cells, the peptides were also toxic to normal cell lines tested, however the Hr24 peptide indicated a probable selectivity in relation to cancer cells, with an effective dose of about half of the value obtained for normal cells. Treatment employing the corresponding IC75 dose of the Hr22 peptide reduced the number of viable cells and most cells showed plasma membrane damaged. Both peptides induced a higher exposure of phosphatidylserine (anexin V-FITC labeled) and were not labeled only with propidium iodide (PI) when tested with the corresponding IC50. Employing the IC75 dose of the Hr22 peptide, alterations were observed in the mitochondrial membrane potential, as well as DNA fragmentation and alterations in the cell cycle, suggesting cell death by apoptosis. More studies are needed to better understand how these peptides act. The production of analogs with structural modifications can improve their activities and specificities for both micro-organisms and cancer cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós-graduação, Departamento de Biologia Animal, 2014. / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-20T19:38:59Z No. of bitstreams: 1 2014_DiegoAlejandroFalico.pdf: 11887714 bytes, checksum: 2ee479f958a7bbf12e17ec4ccbb0f4e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T10:42:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DiegoAlejandroFalico.pdf: 11887714 bytes, checksum: 2ee479f958a7bbf12e17ec4ccbb0f4e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T10:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DiegoAlejandroFalico.pdf: 11887714 bytes, checksum: 2ee479f958a7bbf12e17ec4ccbb0f4e8 (MD5) / O estudo de novas fontes de compostos bioativos permitiu o desenvolvimento de muitos produtos biotecnológicos, incluindo drogas com importantes atividades biológicas, muitas das quais são usadas atualmente no tratamento de doenças relevantes, especialmente de natureza infecciosa. No presente trabalho, foi realizada uma varredura por peptídeos com atividade antifúngica a partir da secreção cutânea da rã brasileira Hypsiboas raniceps. Indivíduos adultos de H. raniceps foram coletados no estado de Goiás, Brasil. As secreções cutâneas foram obtidas por meio de estimulação elétrica moderada, congeladas, secas e fracionadas por HPLC empregando-se coluna de fase reversa C18. Todas as frações cromatográficas foram testadas quanto à capacidade de inibir a proliferação do fungo Candida albicans e as frações ativas foram analisadas por espectrometria de massas (MALDI-TOF MS). O perfil cromatográfico resultou em cerca de 30 frações, oito das quais promoveram redução na proliferação do fungo C. albicans acima de 25%. As frações com atividade antifúngica apresentaram componentes de massa molecular variando entre 1000 e 3000 Da. As frações 27 e 28 foram as mais ativas, mas a análise por MS revelou a presença de vários componentes nessas frações. A fração 28 foi selecionada e submetida a uma passo cromatográfico adicional, levando à obtenção do peptídeo bioativo presente nessa fração. O peptídeo HR 36 puro foi acumulado e testado contra o fungo C. albicans. Este novo peptídeo apresenta massa molecular igual a 3 kDa e é capaz de inibir a proliferação de C. albicans na concentração de 128 M em 50%. No presente estudo, foi constatada que a secreção cutânea de H. raniceps é uma fonte de peptídeos antifúngicos e um novo peptídeo antifúngico de 3 kDa foi obtido em alto grau de pureza de modo a permitir a sua caracterização biológica e química. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The study of new sources of bioactive compounds allowed the development of many biotechnological products, including drugs with important biological activities, many of which are used today for the treatment of relevant diseases, especially those of infectious nature. In the present study we performed a screening for peptides with antifungal activity from the skin secretion of the Brazilian frog Hypsiboas raniceps. Adult specimens of H. raniceps were collected in Goiás, Brazil. Skin secretions were obtained by mild electric stimulation, freeze-dried and fractionated by HPLC using a C18 reversed-phase column. All fractions were tested for inhibitory activity against the fungus Candida albicans, and the bioactive fractions were submitted to mass spectrometric analysis (MALDI-TOF MS). The typical chromatographic profile showed approximately 30 fractions, eight of which promoted reduction in yeast cell proliferation above 25%. The antifungal fractions showed molecular mass components ranging from 1000 to 3000 Da. Fractions 27 and 28 were the most active but the MS analysis revealed multiple components present in these fractions. Fraction 28 was selected and submitted to an additional chromatographic step in order to obtain the major bioactive peptide present in this sample. Peptide HR 36 was acumulated and tested against C. albicans. This new peptide has a molecular mass of 3 kDa and is able to inhibit the proliferation of C. albicans at 128 M in 50%. It was observed that H. raniceps skin secretion is a source of antifungal peptides and one new 3 kDa antifungal peptide was obtained in high-purity which will allow in its biological and chemical characterization.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008. / Submitted by Luana Patrícia de Oliveira Porto (luana_porto_23@hotmail.com) on 2010-03-12T20:33:00Z No. of bitstreams: 1 2008_MichelledaSilvaLiberio.pdf: 6096417 bytes, checksum: 5931809225d410af1726c5387c700412 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T18:28:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MichelledaSilvaLiberio.pdf: 6096417 bytes, checksum: 5931809225d410af1726c5387c700412 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T18:28:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MichelledaSilvaLiberio.pdf: 6096417 bytes, checksum: 5931809225d410af1726c5387c700412 (MD5) Previous issue date: 2008 / Atualmente, o surgimento de resistência às drogas disponíveis no mercado pelos microorganismos e pelas células de câncer tornou o desenvolvimento de novas formas terapêuticas imprescindível. A secreção cutânea dos anfíbios é uma rica fonte natural de peptídeos com atividades anticarcinogênica (PAC) e antimicrobiana (PAM). Entretanto, o veneno desses animais também é constituído de outras macromoléculas, por exemplo, enzimas, as quais têm sido pouco investigadas. O presente estudo teve como objetivo caracterizar, de forma geral, a secreção glandular da rã-pimenta Leptodactylus labyrinthicus. Especificamente, buscou-se identificar e caracterizar química e biologicamente alguns dos peptídeos presentes, além de investigar a presença de atividades enzimáticas. O estudo revelou a ocorrência de inúmeros peptídeos e proteínas, demonstrando a riqueza e o potencial biológico desse veneno. Os dois peptídeos antimicrobianos purificados foram fallaxin e pentadactylin, os quais já haviam sido isolados de outras espécies do gênero Leptodactylus. Ambos apresentaram atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; e fallaxin foi identificado como fracamente hemolítico. Como vários PAMs de amplo espectro de ação também são citotóxicos para células de câncer, os dois peptídeos isolados foram testados contra as linhagens celulares de câncer HeLa, MCF-7 e B16F10, demonstrando-se efetivos contra todas as linhagens. Observou-se também que os dois PACs são pouco seletivos, pois foram mais tóxicos para células normais de fibroblasto (FHN) do que para as células tumorais. Portanto, o uso terapêutico desses PACs deverá ser via estratégias que aumentem a especificidade dos mesmos. Os estudos de mecanismo de ação com pentadactylin não foram conclusivos, sugerindo a morte de células de MCF-7 via apoptose, podendo ser seguida pelo processo necrótico. Além desses, o fragmento Flx-16 de fallaxin e o peptídeo PGL-Ll, rico em glicina e leucina, foram testados, contudo nenhuma atividade biológica foi detectada. A investigação da atividade enzimática da secreção revelou a presença de enzimas proteolíticas pertencentes aos clãs das metalo- e serino-peptidases e que atuam de maneira ótima em pH neutro a ligeiramente básico; e de fosfolipases do tipo A2. O estudo e caracterização da composição da secreção cutânea de anfíbios são de extrema relevância, podendo ajudar a esclarecer questões taxonômicas, identificar drogas terapêuticas em potencial, além de auxiliar no entendimento da biologia dos anfíbios. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nowadays, the emergence of resistance to the current available chemotherapeutic drugs by microorganisms and cancer cells make the development of new agents imperative. The skin secretion of amphibians is a natural rich source of antimicrobial (PAM) and anticancer peptides (PAC). Nevertheless, the venom of these animals is also composed by other macromolecules, such as enzymes, which have not been studied extensively yet. The aim of this study was to characterize the glandular secretion of the pepper-frog Leptodactylus labyrinthicus, targeting to identify and characterize chemically and biologically some of the peptides present, besides detecting enzymatic activities. The research has found a variety of peptides and proteins, showing the richness and the biological potential of this venom. Two PAMs were purified, fallaxin and pentadactylin, which have already been isolated from other species of the genus Leptodactylus. Both peptides were active against Gram-positive and Gram-negative bacterias; moreover, fallaxin showed a weak hemolytic activity. As some PAMs of broad spectrum of action are also toxic to cancer cells, the two peptides isolated were tested against the cancer cell lines HeLa, MCF-7 and B16F10, being effective against all of them. We noticed that both PACs aren’t specific, since they have been more toxic to normal fibroblast cells (FHN) than to tumor cells. Therefore, it is mandatory that the therapeutic use of these PACs be accompanied by strategies that enhance their selectiveness. The studies of action mechanism with pentadactylin were not conclusive, suggesting that MCF-7 cells die by apoptosis; however it may be followed by necrosis. The peptide PGL-Ll, rich in glycine and leucine, and the fragment Flx-16 from fallaxin were tested, though no biological activity was found. The research of enzyme activity of the secretion revealed the presence of proteolytic enzymes of the clans metallo- and serine-peptidases, and that they act optimally at neutral to slightly basic pH, and of phospholipases A2. The study and characterization of the skin secretion of amphibians is of extreme relevance, helping to elucidate taxonomic issues, identifying putative therapeutic drugs, besides helping to understand the biology of amphibians.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-13T14:54:38Z No. of bitstreams: 1 2016_CésarAugustoPríasMárquez.pdf: 13896752 bytes, checksum: 0f77b4787c74c9521a4b65abcfbac820 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-13T16:37:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CésarAugustoPríasMárquez.pdf: 13896752 bytes, checksum: 0f77b4787c74c9521a4b65abcfbac820 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T16:37:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CésarAugustoPríasMárquez.pdf: 13896752 bytes, checksum: 0f77b4787c74c9521a4b65abcfbac820 (MD5) / No presente trabalho foi avaliado pela primera vez o potencial anticâncer da secreção cutânea do anuro sul-americano Hypsiboas crepitans (Wied-Neuwied, 1824). O fracionamento por RP-HPLC de secreções de indivíduos coletados na Colômbia e no Brasil permitiu a caracterização dos perfis cromatográficos das duas populações, obtendo-se registros das massas moleculares monoisotópicas de vários peptídeos presentes nessas secreções. Testes de atividade antimicrobiana realizados com a secreção de indivíduos da Colômbia levaram ao isolamento e à caracterização química e biológica de dois novos peptídeos da família das hilinas. Estes peptídeos, denominados de HCC76 e HCC77 apresentam cadeia polipeptídica curta, são altamente hidrofóbicos, possuem baixa cationicidade e são propensos a formarem estruturas em α-hélice anfipática. Versões sintéticas dos dois peptídeos (HCC76 e HCC77(K)) foram usadas para a determinação das suas concentrações inibitórias mínimas (MICs) em bactérias e fungos e da concentração hemolítica 50 % (HC50) em hemácias humanas. Os peptídeos HCC76, HCC77(K) e dois análogos deste último, denominados HCC77(K)1 e HCC77(K)2, tiveram seus efeitos antiproliferativos avaliados sobre células aderentes de mamíferos. Adicionalmente foram utilizados nesses ensaios dois peptídeos sintéticos da família das ocelatinas (ocelatina-F1 e G16OCP1), isolados previamente de secreções de anuros do gênero Leptodactylus. Os resultados mostram que os peptídeos HCC76 e HCC77(K) possuem grandes diferenças quanto à sua atividade biológica em bactérias e células de mamíferos, enquanto os dois análogos do peptídeo HCC77(K) conservaram a atividade em células aderentes de mamífero e tiveram melhora na potência, com relação a este. De forma similar, os peptídeos G16OCP1 e ocelatina-F1 mostraram diferenças quanto à sua atividade em células cancerosas e normais de mamíferos. Ensaios utilizando citometria de fluxo e microscopia de contraste de fase mostram que os peptídeos HCC77(K) e ocelatina-F1 induzem morte celular em uma linhagem de melanoma murino por um processo que envolve apoptose, com evidência de fragmentação de DNA e alteração do potencial de membrana mitocondrial e, no caso do peptídeo HCC77(K), efeitos na membrana plasmática e no ciclo celular. / The present study assessed, for the first time, the anticancer potential of the skin secretion of the South American anuran Hypsiboas crepitans (Wied-Neuwied, 1824). Fractionation of skin secretions of Colombian and Brazilian specimens by RP-HPLC allowed the characterization of chromatographic profiles of those two populations, while obtaining records of the monoisotopic molecular masses of several peptides present in these secretions. Antimicrobial activity assays performed using the secretion obtained from specimens collected in Colombia led to the isolation and chemical and biological characterization two new peptides belonging to hylins family. These peptides, named HCC76 and HCC77, are short-chain, highly hydrophobic, lowly cationic, and exhibit propension to adopt amphipatic α-helix structures. Synthetic forms of these two peptides (HCC76 and HCC77(K)) were used for determination of minimum inibitory concentrations (MICs) on bacteria and fungi, and also for determination of hemolytic concentration 50 % (HC50) on human erythrocytes. The peptides HCC76, HCC77(K) and two analogs of the last one, were used in assays assessing their antiproliferative effects on adherent mammalian cells. Additionally, two synthetic peptides (ocellatin-F1 and G16OCP1) belonging to the ocellatin family, previously isolated from the skin secretions of Leptodactylus spp. were used in the same tests. The results show that HCC76 and HCC77(K) have great differences regarding their biological activity on bacteria and mammalian cells, while the two HCC77(K)-derived analogs maintained activity on mammalian adherent cells and had a better potency compared to HCC77(K). Similarly, the peptides G16OCP1 and ocellatin-F1 showed differences regarding their biological activity on normal and cancerous mammalian cells. Assays using flow cytometry and phase-contrast microscopy show that the peptides HCC77(K) and ocellatin-F1 lead to cell death on a murine melanoma cell line through a process involving apoptosis, with evidence of DNA fragmentation and disruption of mitochondrial membrane potential; and also, in the case of HCC77(K), effects on the plasma membrane and cell cycle. / En este trabajo se evaluó por primera vez el potencial antitumoral de la secreción cutánea del anuro suramericano Hypsiboas crepitans (Wied-Neuwied, 1824). El fraccionamiento por RP-HPLC de secreciones de individuos colectados en Colombia y Brasil permitió la caracterización de los perfiles cromatográficos de las dos poblaciones, obteniéndose registros de las masas moleculares monoisotópicas de varios péptidos presentes en estas secreciones. Ensayos de actividad antimicrobiana, realizados con la secreción de individuos colombianos, condujeron al aislamiento y a la caracterización química y biológica de dos nuevos péptidos de la familia de las hilinas. Estos péptidos, denominados HCC76 y HCC77, presentan cadena polipeptídica corta, son altamente hidrofóbicos, poseen baja cationicidad y son propensos a formar estructuras en α-hélice anfipática. Versiones sintéticas de los dos péptidos (HCC76 y HCC77(K)) fueron usadas para la determinación de sus concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) en bacterias y hongos, así como de sus concentraciones hemolíticas 50 % (HC50) en eritrocitos humanos. Los péptidos HCC76 y HCC77(K), así como dos análogos de este último, denominados HCC77(K)1 y HCC77(K)2, fueron usados para evaluar su efecto antiproliferativo en células adherentes de mamíferos. Adicionalmente fueron utilizados en esos ensayos, dos péptidos sintéticos de la familia de las ocelatinas (ocelatina-F1 y G16OCP1), aislados previamente de secreciones de anuros del género Leptodactylus. Los resultados muestran que los péptidos HCC76 y HCC77(K) poseen grandes diferencias con relación a su actividad biológica en bacterias y células de mamífero, mientras los dos análogos del péptido HCC77(K) conservan su actividad en células adherentes de mamífero, mejorando su potencia respecto a este. Ensayos usando citometría de flujo y microscopía de contraste de fase muestran que los péptidos HCC77(K) y ocelatina-F1 inducen muerte celular en un linaje de melanoma murino através de un proceso que involucra apoptosis, con evidencia de fragmentación de DNA y alteración del potencial de membrana mitocondrial y, en el caso del péptido HCC77(K), efectos sobre la membrana plasmática y el ciclo celular.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-26T16:08:11Z No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-26T21:42:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T21:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LuzElenaTrianaVidal.pdf: 2903643 bytes, checksum: f3ab54636d42cbaaf15629d3af2ceef1 (MD5) / A pele dos anfíbios é um tecido especializado na produção de diversas moléculas como peptídeos antimicrobianos, imunomoduladores, aminas biogênicas e hormônios. Esses compostos bioativos podem ser considerados de interesse biotecnológico e alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi identificar e caracterizar peptídeos e proteínas presentes na secreção cutânea do anfíbio Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), relacionados aos mecanismos de defesa contra patógenos. A primeira abordagem consistiu no fracionamento clássico da secreção cutânea por RP-HPLC. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à capacidade de inibir a proliferação bacteriana e analisadas por MALDI-TOF/TOF. Um único e novo (sem similaridade de sequência com peptídeos anotados) peptídeo antimicrobiano neutro foi assim isolado e denominado Dendropsofina 1 (Dc 1). Posteriormente, foram desenhados dois análogos catiônicos (Dc 1.1 e Dc 1.2) que mantiveram a estrutura anfipática de Dc 1. Dc 1 e seus dois análogos exibiram atividades antibacterianas moderadas e sem efeitos hemolíticos e citotóxicos em células de mamífero. O Análogo Dc 1.2 exibiu uma maior atividade antibacteriana, o que pode estar relacionado ao seu maior teor de α-hélice e estabilidade térmica em condição experimental hidrofóbica, comparando com Dc 1 e Dc 1.1. O peptídeo nativo Dc1 poderia ser usado como um modelo alternativo para desenvolver novos AMPs. Numa segunda abordagem, mais moderna e de alta acurácia, foi realizado o primeiro estudo proteômico e peptidômico abrangente da secreção cutânea utilizando nanoLC-MS/MS do tipo Orbitrap Elite™. Os dados foram processados através dos softwares PEAKS e Blast2GO. Foram identificadas 1248 proteínas presentes na secreção cutânea de D. columbianus, 127 proteínas foram categorizadas como associadas ao sistema de defesa e 19 relacionadas à resposta contra microrganismos. Mediante zimografia foram detectadas e posteriormente identificadas três hidrolases ativas na secreção total, as quais podem estar relacionadas com o processamento de peptídeos de defesa. Os resultados do peptidoma permitiram determinar um novo grupo de peptídeos endógenos a D. columbianus, com alta similaridade de sequência com Dc 1, que foram nomeados como dendropsofinas. As dendropsofinas Dc2, Dc7, DC13, Dc 17, Dc 18 e Dc 19 não apresentaram atividade contra bactérias nem fungos. No entanto, Dc 2 e Dc 18 foram capazes de ativar neutrófilos humanos. Essa atividade poderia estar associada a uma modulação do sistema imune em D. columbianus. Esta via de defesa altamente conservada em vertebrados, abre perspectivas quanto ao uso dessas novas moléculas na terapia de doenças infecciosas. / Amphibian skin is a tissue specialized in the production of various molecules such as antimicrobial peptides, immunomodulators, biogenic amines and hormones. These bioactives compounds could be considered of biotechnological interest and new therapeutic alternatives. The aim of the present study was to identify and characterize peptides and proteins present in the cutaneous secretion of the amphibian Dendropsophus columbianus (Boettger, 1892), related to pathogen defense mechanisms. The first approach consisted of the classical fractionation of cutaneous secretion by RP-HPLC. All chromatographic fractions obtained were evaluated for their ability to inhibit bacterial proliferation and analyzed by MALDI-TOF / TOF. A single new antimicrobial neutral peptide was thus isolated and named Dendropsophin 1 (Dc 1), with no sequence similarity with annotated peptides. Subsequently, two cationic analogues (Dc 1.1 and Dc 1.2) keeping the amphipathic structure of Dc 1 were designed. Dc 1 and its two analogues exhibited moderate antibacterial activities and no hemolytic and cytotoxic effects in mammalian cells. Dc 1.2 exhibited slightly improved antibacterial properties that could be related to the higher content of α-helix and thermal stability compared to Dc 1 and Dc 1.1 in hydrophobic experimental condition. The native peptide Dc 1 could be used as an alternative model to develop new AMPs. In a second modern high-throughput approach, the first comprehensive proteomic and peptidomic study of cutaneous secretion was performed by nanoLC-MS/MS using Orbitrap Elite™ mass spectrometer. Data were processed using PEAKS and Blast2GO programs. 1248 proteins present in the cutaneous secretion of D. columbianus were identified, 127 proteins were categorized associated with the defense system and 19 related to the response against microorganisms. Three hydrolases from the total secretion were detected by zymography and subsequently identified, which could be related to the processing of peptides of defense. The peptidome results allowed determining a new group of peptides endogenous to D. columbianus, with high sequence similarity with Dc 1, which were named as Dendropsophins. The dendropsophins Dc 2, Dc 7, Dc 13, Dc 17, Dc 18 and Dc 19 showed no activity against bacteria or fungi. However, Dc 2 and Dc 18 are able to activate human neutrophils. This activity could be associated to a modulation of the immune system in D. columbianus. This pathway of defense, highly conserved in vertebrates, opens further perspectives regarding the use of these new molecules in the therapy of infectious diseases.

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biologias, Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-20T15:20:30Z No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-10-21T17:04:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-21T17:04:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AlinedaSilvaChagas.pdf: 1323645 bytes, checksum: 96f661143e6ce644d15ed547e942f4ce (MD5) / A secreção cutânea de anuros é reconhecida como uma rica fonte de compostos biologicamente ativos, incluindo aminas biogênicas, alcaloides, bufadienolídeos, peptídeos e proteínas. Os peptídeos antimicrobianos constituem um sistema de defesa imediato, atuando sobre um grande espectro de mircroorganismos. A busca por novas alternativas terapêuticas no tratamento de infecções e câncer tem impulsionado nos estudos voltados à prospecção de novos peptídeos antimicrobianos. No presente trabalho, as secreções cutâneas de Leptodactylus labyrinthicus e Phyllomedusa azurea foram utilizadas para avaliar seus efeitos antiproliferativos e citotóxicos sobre células tumorais. Também foram submetidas a fracionamento cromatográfico a fim de se isolar peptídeos com atividade inibitória sobre a proliferação do fungo patogênico Candida albicans. As frações bioativas foram analisadas por MALDI-TOF MS e submetidas à recromatografia por RP-HPLC. De acordo com a estratégia experimental empregada foi possível a obtenção de duas frações homogêneas a partir da secreção de P. azurea, denominadas PaF31-7(F12) e PaF36-10(F13) que foram empregadas na determinação dos MICs para C. albicans. Tais frações mostraram-se capazes de inibir parcialmente o crescimento da levedura C. albicans na maior concentração empregada (128 µM). Também foram avaliados os efeitos citotóxicos e antiproliferativos das secreções brutas de P. azurea e L. labyrinthicus sobre as linhagens celulares HeLa, B16F10 e NIH3T3. Observou-se que a secreção bruta de L. labyrinthicus apresenta atividade antiproliferativa acentuada sobre células tumorais empregadas, especialmente células Hela, com um IC50 de 4,216 µg/mL sem apresentar citotoxicidade relevante contra células normais da linhagem NIH3T3. Ensaios adicionais de citometria de fluxo revelaram que a secreção bruta de L. labyrinthicus não interfere de forma significativa nas etapas do ciclo celular, no entanto, observa-se um aumento importante na fragmentação do DNA de células HeLa quando expostas à secreção, sugerindo que a morte celular ocorra por meio de apoptose. Mais estudos precisam ser realizados a fim de se determinar o mecanismo pelo qual a secreção bruta de L. labyrinthicus promove a morte das células tumorais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The anurans skin secretion is recognized as a rich source of active biological compounds, including alkaloids, peptides and proteins. The antimicrobial peptides constitute an immediate defense system, acting on a wide spectrum of microorganisms. The quest for new therapeutics alternatives for infections treatments and cancer have been driven studies focused on prospecting for new antimicrobial peptides. In this present work, the skin secretions by Leptodactylus labyrinthicus and Phillomedusa azurea were utilized for evaluating their antiproliferative and cytotoxic effects on tumor cells. Were also subjected the skin secretion to fractionation in order to isolate peptides with inhibitory activity on the proliferation of the pathogenic fungus Candida albicans. The bioactive fractions were analyzed by MALDI-TOF MS, and subjected to rechromatography by RP-HPLC. According to the experimental strategy used was possible to achieve two homogeneous fractions secretion from P. azurea, called PaF31 7 (F12) and PaF36 10 (F13). These fractions were capable of partially inhibiting the growth of the yeast C. albicans in greater concentration employed (128 μM). We also evaluated the cytotoxic and antiproliferative crude secretions of P. azurea and L. labyrinthicus on cell lines HeLa, NIH3T3 and B16F10 effects. It was found that the crude secretion of L. labyrinthicus shows marked antiproliferative activity on tumor cells employed, especially Hela cells with an IC50 of 4.216 μ g / ml without showing significant cytotoxicity against normal NIH3T3 cells lineage. Additional tests of flow cytometry showed that the crude secretion of L. labyrinthicus not significantly interfere with the stages of the cell cycle, however, there was a significant increase in DNA fragmentation in HeLa cells exposed to secretion, suggesting that cell death occurs by apoptosis. More studies need to be conducted to determine the mechanism by which the crude secretion of L. labyrinthicus promotes tumor cell death.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:40:23Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-03-08T13:53:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-08T13:53:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) Previous issue date: 2009 / As secreções cutâneas dos anfíbios são reconhecidas como uma rica fonte de peptídeos biologicamente ativos há bastante tempo. Devido as suas propriedades antimicrobianas e ao seu mecanismo de ação que independe da interação com um receptor específico, cada vez mais, os peptídeos isolados dessas secreções vêm sendo considerados como uma opção alternativa aos antibióticos disponíveis comercialmente. Muitas linhagens bacterianas têm apresentado resistência a tais drogas e o fato dos peptídeos antimicrobianos de anuros estarem disponíveis em quantidades satisfatórias na natureza tem facilitado a pesquisa nessa área. O presente estudo teve como objetivo geral proceder à análise peptidômica da secreção cutânea do anuro Eupemphix nattereri com ênfase na prospecção de peptídeos antimicrobianos para aplicações terapêuticas. Como resultados do presente estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos antimicrobianos, denominados nattererinas. As nattererinas identificadas foram sintetizadas quimicamente e apresentaram atividade citolítica contra bactérias Gram positivas e Gram-negativas e baixa atividade hemolítica. Dentre suas propriedades estruturais, podemos ressaltar tratar-se de peptídeos catiônicos (com 30 resíduos de aminoácidos) que adquirem conformação em α-hélice na presença de TFE 50% (v/v). A pesquisa nessa área é de extrema importância, visto que a caracterização dos componentes presentes na secreção cutânea de anuros pode ajudar em identificações taxonômicas, bem como, fomentar a indústria farmacêutica com modelos para o desenho de novas drogas terapêuticas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Amphibian skin secretions have been knowledge as a rich source of antimicrobial peptides for a long time. The outcome of antibiotic resistant bacterial species is an increasing problem, which encourages the search of new compounds in nature, for example, over anurans’ skin secretion. Due to its antimicrobial properties and mechanism of action, which is independent of specific receptors, these peptides have been considered as an alternative to the available antibiotics. The present study describes peptidômica analysis of the cutaneous secretion from the frog Eupemphix nattereri, focusing on antimicrobial peptides. As results of the present work, three antimicrobial peptides, named nattererins, were isolated and characterized. The identified nattererins were synthesized and tested against Gram-positive and Gram-negatives bacteria showing antimicrobial activity and low hemolytic activity. Nattererins are cationic peptides (30 amino acid residues long) and adopt an α-helical conformation in the presence of TFE 50% (v/v). Regarding the obtained results, naturally occurring bioactive peptides from amphibian skin can be a source of pharmaceutically interesting compounds, which endorses a higher investment in this kind of study. In addition, these peptides also can help in the taxonomy of anurans species.

O aparecimento de cepas microbianas com resistência aos antibióticos comumente usados em âmbito mundial constitui um sério problema de saúde pública, estimulando a busca por novos compostos antimicrobianos para os quais a resistência ainda não foi adquirida. A secreção cutânea de várias espécies de anuros (rãs, sapos e pererecas) é uma rica fonte de peptídeos com amplo espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com grande potencial para o desenvolvimento de fármacos. O presente trabalho visou à investigação da presença de agentes antimicrobianos na secreção cutânea das espécies brasileiras Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. Utilizando a estimulação mecânica do tegumento para extração e posteriormente a liofilização dessas secreções. Os testes antimicrobianos foram realizados através da técnica de disco difusão, onde as secreções testadas foram solubilizadas em diferentes solventes e em placas contendo bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As secreções com maior potencial antibacteriano foram fracionadas por Cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa em uma coluna C8 e C18 5μm. Tendo suas frações também testadas em disco-difusão. As frações que formaram halos de inibição foram submetidas à espectrometria de massa para a identificação de suas moléculas. Desta forma foi comprovado a ação antimicrobiana das secreções de Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri e Trachycephalus resinifictrix e de suas receptivas frações. / The appearance of microbial strains that are resistant to common antibiotics used in a global scope represents a serious public health issue, stimulating the search for new antimicrobial compounds that resistance was not acquired yet. The cutaneous secretion of several anurans species (frogs, toads and tree frogs) is a rich source of peptides with a broad spectrum of antimicrobial and antifungal activity, with a big potential to drug development. The present work aimed the investigation of the presence of antimicrobial agents in the cutaneous secretion of the Brazilian species Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. For the extraction of these secretions it was utilized the integument mechanical stimulation and later on these secretions were lyophilized. For the antimicrobial tests it was used the disk diffusion technique, where the test secretions were solubilized in different solvents and in plates containing Gram-negative and Gram-positive bacteria. The secretions with the highest antimicrobial potential were fractionated by a high-performance liquid chromatography reverse phase in the columns C8 and C18 5μm. These fractions were also tested in disk diffusion. The fractions that formed inhibition zones were submitted to mass spectrometry for the identification of their molecules. This way it was evidenced antimicrobial activity of secretions from Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri and Trachycephalus resinifictrix and from their respective fractions.

O aparecimento de cepas microbianas com resistência aos antibióticos comumente usados em âmbito mundial constitui um sério problema de saúde pública, estimulando a busca por novos compostos antimicrobianos para os quais a resistência ainda não foi adquirida. A secreção cutânea de várias espécies de anuros (rãs, sapos e pererecas) é uma rica fonte de peptídeos com amplo espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com grande potencial para o desenvolvimento de fármacos. O presente trabalho visou à investigação da presença de agentes antimicrobianos na secreção cutânea das espécies brasileiras Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. Utilizando a estimulação mecânica do tegumento para extração e posteriormente a liofilização dessas secreções. Os testes antimicrobianos foram realizados através da técnica de disco difusão, onde as secreções testadas foram solubilizadas em diferentes solventes e em placas contendo bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As secreções com maior potencial antibacteriano foram fracionadas por Cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa em uma coluna C8 e C18 5μm. Tendo suas frações também testadas em disco-difusão. As frações que formaram halos de inibição foram submetidas à espectrometria de massa para a identificação de suas moléculas. Desta forma foi comprovado a ação antimicrobiana das secreções de Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri e Trachycephalus resinifictrix e de suas receptivas frações. / The appearance of microbial strains that are resistant to common antibiotics used in a global scope represents a serious public health issue, stimulating the search for new antimicrobial compounds that resistance was not acquired yet. The cutaneous secretion of several anurans species (frogs, toads and tree frogs) is a rich source of peptides with a broad spectrum of antimicrobial and antifungal activity, with a big potential to drug development. The present work aimed the investigation of the presence of antimicrobial agents in the cutaneous secretion of the Brazilian species Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. For the extraction of these secretions it was utilized the integument mechanical stimulation and later on these secretions were lyophilized. For the antimicrobial tests it was used the disk diffusion technique, where the test secretions were solubilized in different solvents and in plates containing Gram-negative and Gram-positive bacteria. The secretions with the highest antimicrobial potential were fractionated by a high-performance liquid chromatography reverse phase in the columns C8 and C18 5μm. These fractions were also tested in disk diffusion. The fractions that formed inhibition zones were submitted to mass spectrometry for the identification of their molecules. This way it was evidenced antimicrobial activity of secretions from Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri and Trachycephalus resinifictrix and from their respective fractions.

A pele dos anfíbios atua como primeira barreira de proteção contra microorganismos invasores. Além dos componentes mecânicos, essa proteção deve incluir mecanismos bioquímicos e biológicos derivados tanto da comunidade microbiana ali residente quanto da secreção de moléculas bioativas a partir de glândulas dérmicas. Os objetivos gerais deste estudo foram: caracterizar a comunidade microbiana hospedada pela espécie Proceratophrys boiei e analisar a sua relação com comunidades microbianas ambientais; avaliar se nessa espécie a microbiota e a secreção cutâneas podem ser entendidas como um componente de proteção; avaliar a estabilidade de tais componentes a partir de diferentes populações em fragmentos florestais. Especificamente, as seguintes hipóteses foram testadas: 1. A composição da microbiota ambiental varia entre os fragmentos e micro-hábitats de Floresta Atlântica amostrados e tem relação com alguns parâmetros ambientais analisados; 2. A diversidade da microbiota cutânea de P. boiei é relacionada à diversidade da microbiota nos ambientes que ocupa. Ademais, em termos de composição, a microbiota cutânea é um subconjunto da microbiota ambiental que ocorre nos seus micro-hábitats; 3. A riqueza e abundância de bactérias da microbiota cutânea de P. boiei varia entre os diferentes remanescentes de Floresta Atlântica; 4. A riqueza e a abundância de bactérias presente na pele de P. boiei com atividade antimicrobiana varia entre populações ou locais de amostragem; 5. Existe efeito antimicrobiano das secreções sobre alguns patógenos e os perfis das secreções cutâneas diferem entre populações de P. boiei. Os resultados mostraram que a microbiota cutânea de P. boiei apresenta variações entre indivíduos e populações. Além disso, a qualidade do hábitat pode ser importante para a composição de bactérias hospedadas. Existe um compartilhamento de bactérias entre a microbiota cutânea de P. boiei e os micro-hábitats solo e água, ocupados por essa espécie, porém as comunidades dérmicas compõem-se principalmente por bactérias não detectadas nas amostras ambientais analisadas. Foi observada certa estabilidade na estrutura da microbiota cutânea de P. boiei quando analisadas populações distintas, mas variações na distribuição de morfotipos bacterianos em uma mesma localidade ocorre. Microbiota cutânea e secreções dérmicas de P. boiei podem prevenir infecções na pele, dada a atividade antimicrobiana demonstrada nesta pesquisa. Contudo, variações nos espectros de ação foram observadas em ambos os componentes, assim como, diferenças populacionais nas abundâncias e percentuais de bactérias produtoras de antimicrobianos. O estudo também demonstrou que certas características independem do contexto ambiental ocupado pelas populações, uma evidência de que o microambiente da pele dessa espécie oferece condições e certa estabilidade para a colonização de comunidades bacterianas específicas. A sustentabilidade de populações dessa espécie pode estar relacionada às interações entre hospedeiro, microrganismos e ambiente. / The skin of amphibians acts as first barrier of protection against invading microorganisms. Besides the mechanical components, this protection probably include biochemical and biological mechanisms derived from both the resident microbial community and the secretion of bioactive molecules from dermal glands. The aims of this study were to characterize the microbial community hosted by Proceratophrys boiei and analyse its relationship with environmental microbial communities; evaluate whether microbiota and skin secretion of this species can be understood as a protection component; evaluate the stability of these components through different populations in forest fragments. Specifically, the following hypotheses have guided this research: 1. The composition of environmental microbiota varies among microhabitats and fragments of Atlantic Forest and relates to some environmental parameters; 2. The diversity of skin microbiota of P. boiei relates to the diversity of microbes in the environment it occupies. Furthermore, in terms of composition, the skin microbiota is a subset of environmental microbes that occurs in its microhabitat; 3. The richness and abundance of bacteria from the skin microbiota of P. boiei varies between different remnants of Atlantic Forest; 4. The richness and abundance of bacteria present on the skin P. boiei with antimicrobial activity varies between populations or sampling sites; 5. There is antimicrobial activity of the skin secretions against some pathogens and its profiles differ between populations of P. boiei. The results showed variations on the microbial skin of P. boiei between individuals and populations and the quality of habitats could be important for the composition of hosted community. There is a sharing of bacteria between the skin microbiota of P. boiei and the microbial communities of microhabitats soil and water. However, mainly bacteria not detected in environmental samples composes the dermal communities. We observed some stability in the structure of the skin microbiota when analysed different populations, but variations in the distribution of bacterial morphotypes occurs in all sites. Skin microbiota and dermal secretions of P. boiei can prevent infection through the skin, according to the antimicrobial activity demonstrated in this study. There were variations in the action spectrum for both components, but population differences were mainly in abundance and percentage of bacteria producing antibiotics. This research showed the importance of the microbiota and skin secretion of P. boiei as components of protection and the importance of the environment for the composition of these associated communities. At the same time, we have shown that certain characteristics are independent of the environmental context occupied by the population, evidence that the microenvironment of the skin provides a certain stability for the colonization of specific bacterial communities. The sustainability of populations of this species may relates to interactions between host organisms and the environment.