Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O Complexo HLA (Human Leukocyte Antigen Complex) é a região mais variável do genoma humano. O gene HLA-A é o segundo mais polimórfico do grupo e responsável por codificar moléculas envolvidas no processo de apresentação antigênica e modulação das células NK (Natural Killer). Diversos estudos avaliaram a variabilidade do gene HLA-A em populações mundiais. No entanto, estes estudos focaram-se principalmente na variabilidade dos éxons, ignorando a variabilidade de íntrons e regiões regulatórias. A variabilidade do gene HLA-A é particularmente elevada no segmento que codifica a fenda de ligação a peptídeos (éxons 2 e 3), relacionado com a função de apresentação antigênica e alvo de seleção balanceadora. No presente estudo avaliamos a diversidade genética do gene HLA-A considerando um segmento contínuo que compreende o promotor estendido (1.5 Kb upstream do primeiro ATG traduzido), todos os éxons (incluindo a região 3’ não-traduzida) e íntrons por meio de sequenciamento paralelo massivo. As estratégias computacionais empregadas no estudo utilizam-se de programas de livre acesso ou desenvolvidos localmente, viabilizando um mapeamento adequado das sequências produzidas e a genotipagem/haplotipagem para genes HLA. A variabilidade detectada para o gene HLA-A em uma amostra brasileira demonstrou que os segmentos regulatórios apresentam poucas sequências diferentes, porém as sequências existentes são bastante divergentes entre si. As variantes regulatórias apresentam alto desequilíbrio ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: HLA-A is the second most polymorphic loci at the Human Leucocyte Antigen (HLA) complex and encodes a key molecule for antigen presentation and NK cell modulation. Many studies have evaluated HLA-A variability in worldwide populations focusing mainly on exons, and the regulatory segments are poorly characterized. HLA-A variability is particularly high at the segment encoding the peptide-binding groove (exons 2 and 3), which is probably related to their antigen presentation function and balancing selection acting at these segments. Here we evaluate the variability and haplotypes of the HLA-A gene considering a continuous segment encompassing the extended promoter (1.5 Kb upstream the first translated ATG), all exons and introns, and the entire 3’ untranslated region, by using massively parallel sequencing. To achieve this goal, we used a freely available bioinformatics workflow that optimizes read mapping for HLA genes and defined haplotypes using either the phase among variable sites observed directly in sequencing data or probabilistic models. The HLA-A variability detected in a highly admixed population sample from Brazil demonstrates that the HLA-A regulatory segments present few, but divergent haplotypes. The regulatory segments are in close association with the coding alleles. Introns segments are also quite variable. In addition, patterns of molecular diversity suggest that the promoter, in addition to the coding region, might be under the same selective regime, but a di... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Seleção balanceadora é um processo evolutivo que engloba diversos mecanismos: vantagem do heterozigoto, seleção dependente de frequência, pressões seletivas que variam ao longo do tempo ou do espaço, e alguns casos de pleiotropia. O estudo desses mecanismos em si foi e ainda é um tópico de grande interesse para os biólogos evolutivos, e moldou o estudo da evolução ao longo do último século. Antes de a teoria neutra ter sido proposta, acreditava-se que a seleção balanceadora fosse comum. A descoberta de que muita da diversidade genética observada podia ser explicada por evolução neutra motivou, portanto, uma melhor compreensão da seleção balanceadora como um regime seletivo capaz de manter variantes vantajosas nas populações. O estudo da seleção balanceadora, em seus primórdios, foi restrito a organismos que podiam ser manipulados em laboratório. Com o advento de métodos que permitiam quantificar a variabilidade genética - tais como a eletroforese de proteínas, sequenciamento em pequena escala e re-sequenciamento genômico de milhares de indivíduos -, a variabilidade genética humana passou a ser ativamente estudada e interpretada. Diversos estudos buscaram por assinaturas de seleção natural - i.e., padrões de variação genômica deixadas por tais regimes seletivos - e avaliaram seu significado comparando-as com o que seria esperado sob um cenário estritamente neutro. A maior parte desses esforços foram concentrados no estudo da seleção positiva, tida como o principal mecanismo responsável pela evolução adaptativa. Poucos estudos buscaram assinaturas de seleção balanceadora no genoma humano. Isso se deve em parte à escassez de métodos com alto poder para detectar tais assinaturas. Adicionalmente, estudos prévios não analisaram dados em escala genômica, ou se concentraram principalmente nas regiões codificadoras de proteínas. Aqui, nós descrevemos um método simples e com alto poder para detectar assinaturas de seleção balanceadora. Em humanos, esse método supera outros comumente usados para a detecção de tais assinaturas e, em teoria, poderia ser usado para detectá-las em outras espécies, desde que seu poder seja avaliado caso-a-caso através de simulações neutras. Nosso método (\"Non-Central Deviation\", NCD) é apresentado em duas versões: NCD2, que requer informação acerca dos polimorfismos da espécie analisada e das substituições entre essa espécie e um grupo externo, e NCD1, que requer apenas informação acerca dos polimorfismos da espécie analisada. Embora em humanos NCD2 supere NCD1, este último pode ser utilizado para espécies para as quais não haja informação de um grupo externo. Quando aplicamos NCD2 a dados humanos, usando chimpanzé como grupo ex- terno, encontramos mais de 200 genes codificadores de proteínas com forte assinatura de seleção balanceadora, dos quais apenas 1/3 tinha evidência prévia de seleção balanceadora. Encontramos também um enriquecimento para diversas categorias de ontologia gênica, das quais cerca da metade é relacionada à imunidade. Verificamos que dentre os genes com evidências de seleção balanceadora há um excesso de casos de expressão preferencial em tecidos tais como \"adrenal\" e \"pulmão\", e também um excesso de genes com expressão mono-alélica. No geral, vimos que as regiões selecionadas no genoma humano incluem tanto sítios codificadores quanto regulatórios. Não encontramos um excesso de assinaturas de seleção balanceadora em regiões regulatórias, ao contrário do que reportaram outros estudos. Finalmente, encontramos um excesso de polimorfismos não-sinônimos em relação aos sinônimos nos genes selecionados. Tendo documentado a ocorrência de seleção balanceadora no genoma humano e identificado genes que foram potencialmente alvos deste regime seletivo, nós investi- gamos as consequências evolutivas desse processo. Nós partimos da hipótese que a seleção balanceadora sobre um sítio reduz a eficiência com a qual a seleção purificadora elimina variantes deletérias em sítios vizinhos. Esse processo é uma consequência do quanto a seleção sobre um loco afeta, através de ligação genética, as frequências de sítios não-neutros adjacentes. Testamos essa hipótese examinando se os genes sob seleção balanceadora apresentam um excesso de variantes deletérias em relação a expectativas derivadas a partir do restante do genoma. Usando três diferentes métricas para determinadas se e/ou o quão deletéria é uma dada variante, identificamos um excesso de variantes deletérias dentro dos genes sob seleção balanceadora, e mostramos que tal padrão não pode ser atribuído a efeitos confundidores. Esse achado mostra que, juntamente com os benefícios associados à variação adaptativa, a seleção balanceadora aumenta o fardo de mutações deletérias no genoma humano. De forma geral, nossos achados sugerem que a seleção balanceadora provavelmente mantém variantes genéticas envolvidas em uma miríade de processos biológicos além da imunidade e que ela foi mais comum no genoma humano do que se acreditava anteriormente, afetando entre 1-8% dos genes codificadores de proteínas, bem como diversas regiões não-codificadoras. Adicionalmente, a seleção balanceadora parece ser importante para a evolução humana não apenas por seu efeito sobre a aptidão, mas também por ter sido uma importante força capaz de moldar a diversidade genética observada atualmente em humanos e a susceptibilidade a doenças / Balancing selection is an evolutionary process that encompasses several mechanisms: heterozygote advantage, negative frequency dependent selection, selective pressure that fluctuates in time or in space, and some cases of pleiotropy. The study of these mechanisms .per se has been and still is a topic of great interest for evolutionary biologists, and has shaped the study of evolution throughout the last century. Before the proposition of the neutral theory of molecular evolution, it was believed that balancing selection was pervasive. The realization that much of the observed genetic diversity could be explained by neutral evolution thus motivated a better understanding of balancing selection as a selective regime capable of maintaining adaptive variants in populations. The study of balancing selection, in its early stages, was restricted to organisms that could be manipulated in the laboratory. With the advent of methods that allowed quantification of genetic variation - such as protein electrophoresis, small scale sequencing and genome-wide re-sequencing of thousands of individuals - human variation started to be actively studied and interpreted. Several studies have looked for signatures of natural selection - i.e., patterns of genomic variation that selective regimes leave in the genome - and evaluated their significance by comparing them to what would be expected under a strictly neutral scenario. Most of these efforts focused on the study of positive selection, thought of as the prime mechanism responsible for adaptive evolution. Only a few studies looked for signatures of balancing selection in the human genome. This is partially due to the paucity of powerful methods to detect its signatures. Moreover, previous studies either did not analyze data on genomic scale or focused primarily on protein-coding regions. Here, we describe a powerful and simple method to detect signatures of balancing selection. In humans, it outperforms other methods commonly used to detect such signatures and could in theory be used for other species, provided that its power is evaluated for each species through neutral simulations. Our method (\"Non-Central Deviation\", NCD) has two versions: NCD2, which requires polymorphism information on the ingroup species, as well as divergence information between the ingroup and an outgroup species, and NCD1, which only requires the ingroup information. Although NCD2 is more powerful for humans, NCD1 can be used for species that lack information from an outgroup. When applying NCD2 to human data, using chimpanzee as the outgroup, we found more than 200 protein-coding regions with strong signatures of balancing selection, only 1/3 of which had prior evidence for balancing selection. There was also an enrichment for several gene ontology categories, approximately half of which are related to immunity. We also found that among genes with evidence for balancing selection there was an excess of cases of preferential expression in specific tissues, such as \"adrenal\" and \"lung\", and an excess of genes with mono-allelic expression. Overall, we found that selected regions of the genome include both coding and regulatory sites. We failed to find a marked excess of balancing selection in regulatory regions, as reported in previous studies. Finally, we found an excess of nonsynonymous versus synonymous polymorphisms within the selected genes. Having documented the occurrence of balancing selection in the human genome and identified genes which were potential targets of this selective regime, we next investigated evolutionary consequences of this process. We hypothesized that balancing selection acting on a site reduces the efficiency with which purifying selection purges deleterious variants at nearby sites. This process is a consequence of how the dynamics of selection at one locus, mediated by linkage, can interfere with the frequencies of adjacent non-neutral sites. We tested this hypothesis by examining if the genes under balancing selection show an excess of deleterious variants with respect to expectations derived from the remainder of the genome. Using three different metrics to determine deleteriousness, we identified a significant excess of deleterious variants within balanced genes, and we show that this pattern cannot be attributed to confounding factors. This finding shows that together with the benefits associated with adaptive variation, balancing selection is increasing the burden of deleterious mutations in the human genome. Overall, our findings suggest that balancing selection likely maintains variation in a myriad of biological processes other than immunity and that it has been more common in the human genome than previously thought, affecting between 1-8% of human protein-coding genes, as well as a number of non-protein coding regions. Moreover, balancing selection appears to be important to human evolution not only because of its influence on fitness, but also because it has been an important force shaping current human genetic diversity and susceptibility to disease