Células tronco mesenquimais de tecido adiposo, são uma promissora ferramenta para aplicações clínicas em terapias celular e regenerativa, em vista da facilidade de sua extração e da maior quantidade de células por unidade de massa de tecido quando comparado a outras fontes clássicas de células mesenquimais como medula óssea. O protocolo clássico de extração e purificação dessas células, depende de sua adesão em plástico e xeno-materiais demandando muito tempo para ser utilizado por médicos para auxiliar pacientes em procedimentos de emergência. Estas células são capazes se diferenciar em diversos tipos celulares, o que as torna boas candidatas para terapia celular, embora sua capacidade de transdiferenciação para fenótipos neuronais seja ainda discutida. Neste trabalho demonstramos um novo processo para isolar essas células na base de epitopos específicos expressos (assinatura molecular de superfície) utilizando aptâmeros como ligantes de alta afinidade para estes sitios. Aptâmeros, moléculas de DNA simples fita identificadas a partir de uma biblioteca combinatória de sequencias de DNA simples-fita foram identificados por ciclos reiterativos de seleção in vitro (SELEX) utilizando células tronco do lipoaspirado como alvo. Dois aptâmeros isolados, denominados APT9 e APT11, foram capazes de identificar subpopulações (15,8 e 23,7% respectivamente) dentre as células tronco mesenquimais (classicamente CD29+/CD90+/CD45-) e separá-las usando nano-partículas magnéticas acopladas aos aptâmeros. Além disso, seguindo uma indução para diferenciação neuronal, as células tronco mesenquimais passam a apresentar morfologia neuronal e apresentam expressão e atividade de diversos receptores de neurotransmissores, avaliados por PCR real-time e imageamento de variações da concentração de cálcio intracelular ápos stimulação com vários agonistas de receptores metatrópicos e ionotrópicos. Ao longo da diferenciação, os níveis transcricionais de mRNA de receptores de cininas (B1 e B2), nicotínicos (alfa 7), muscarínicos (M1, M3 e M4), glutamatérgicos (AMPA2 e mGluR2), purinérgicos (P2Y1 e P2Y4) e GABAergicos (GABA-A, subunidade 3) e da óxido nítrico sintase neural aumentaram quando comparados aos níveis das células não diferenciadas, enquanto que os níveis de expressão de outros receptores incluindo purinérgicos P2X1, P3X4, P2X7 e P2Y6 e muscarínico M5 diminuíram. Os níveis de atividade das classes dos receptores estudados, por imageamento de variações da concentração de cálcio intrac, aumentaram para a maioria dos agonistas analisados durante a diferenciação neuronal com exceção para respostas induzidas por glutamato e NMDA. Células diferenciadas expressavam altos níveis de antígenos específicos de neurônios como β3-tubulina, NF-H, NeuN e MAP-2 indicando uma diferenciação em fenótipo neuronal bem sucedida. Desta maneira, esta tese, ao identificar aptâmeros, prove uma inovadora solução para médicos usarem as células tronco mesenquimais dentro de uma sala de cirurgia, através de um método que é capaz de purificar essas células em um tempo clínico viável, com pureza e sem contato com contaminantes. Além disso, nós mostramos aqui que com um protocolo como o proposto para diferenciação neuronal, nós poderíamos induzir essas células para se diferenciar em neurônios, através da ativação de fatores de transcrição específicos, levando às células tronco mesenquimais a serem possivelmente utilizadas em terapias celulares de reparo neuronal. / Adipose mesenchymal stem cells are promising tools for clinical applications in cellular and regeneration therapies, in view of easiness of extraction and higher amount of isolated stem cells per mass of tissue when compared to other classical mesenchymal stem cell sources including bone marrow. The classical protocol to extract and purify these cells, depending on plastic adherence and xeno-materials, is too time consuming to be used by physicians to help patients at emergency procedures. These cells are able to differentiate into various cell types, making them good candidates for cell therapy, however their capability for transdifferentiation into neural phenotypes is yet discussed. Here we show a novel process to isolate these cells using their surface molecular signature and aptamers, ssDNA molecules identified through the SELEX technique, denominated APT9 and APT11 that are able to identify subpopulations (15,8 and 23,7% respectively) within the mesenchymal stem cells (classically CD29+/CD90+/CD45-) and separate them using magnetic nano-particles attached to the aptamers. Moreover, following induction to neural differentiation, mesenchymal cells presents neuronal morphology and present expression and activity of several neurotransmitter receptors, as evaluated by real-time PCR and calcium imaging. During this process, mRNA transcription levels of bradykinin (B1 and B2), cholinergic (alpha 7), muscarinic (M1, M3 and M4), glutamatergic (AMPA2 and mGlu2), purinergic (P2Y1 and P2Y4) and GABAergic (GABA-A, subunit 3) receptors and neuronal nitric oxide synthase were augmented when compared to levels of undifferentiated cells, while the expression levels of other receptors including purinergic P2X1, P2X4, P2X7 and P2Y6 and muscarinic M5 receptors were down-regulated. Activity levels of the studied receptor classes, as studied by calcium imaging, increased for most of the agonists analyzed during the neuronal differentiation with the exception for glutamate- and NMDA-induced receptor responses. Differentiated cells expressed high levels of neuron-specific antigens such as β3-tubulin, NF-H, NeuN and MAP-2, indicating a successful differentiation into neuronal phenotypes. This thesis, by identifying aptamers, provides a novel solution for physicians to use mesenchymal stem cells inside a surgery room, by using a method that are able to purify the cells in a clinical viable time, with purity and no contact with contaminats. Furthermore, we show here that with a protocol as provided for neuronal differentiation, we could induce these cells to differentiate into neurons, by activating specific transcription factors,making mesenchymal stem cells to possibly be used in neuronal repair cell therapies.

Aptamere besitzen als nahezu universelle Binder ein großes Anwendungspotential in Biotechnologie und Medizin; ihre Selektion aus zufälligen Sequenzbibliotheken liefert jedoch nur suboptimale Ergebnisse. Während der Selektion schlagen sich in der Bibliothek Bindungsinformationen nieder, die zur Optimierung des Verfahrens eingesetzt werden können. Die vorliegende Arbeit widmet sich der bioinformatischen Erschließung dieser Informationen. Für die initiale Auswertung der gewonnenen Aptamersequenzdaten erwiesen sich unter Zuhilfenahme von n-Gramm-Deskriptoren und Affinitäten die Regressionsanalyse und auf statistisch-symbolischer Ebene die Mustersuche als wirkungsvolle Verfahren. Für die Aufklärung der Komplexstruktur aus Aptamer und Zielprotein wurde eine Bewertungsfunktion gefunden, die die Identifikation sogenannter nahe-nativer Bindungskonformationen unter den Ergebnissen einer Dockingsimulation erlaubt. Nach dieser methodischen Evaluation erfolgte die Selektion eines Aptamers gegen das Kapsid des humanen Norovirus. Auf Basis der erhobenen Sequenzdaten wurde die Bindegeometrie zwischen Aptamer und Zielprotein durch Anwendung der im Verfahrensprotokoll festgehaltenen Kombination der Analysemethoden aufgeklärt. Das dabei als bindungsrelevant identifizierte Sequenzmotiv kann bei der Erzeugung targetspezifisch optimierter Selektionsbibliotheken als a priori-Information einfließen.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Formelverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Vorwort 1 Thematische Einleitung 1.1 Hypothesen und Fragestellungen 1.2 Aufbau der Arbeit 2 Allgemeine Grundlagen 2.1 Protein-Nukleinsäure-Komplexe 2.1.1 Aufbau von Proteinen 2.1.2 Aufbau von Nukleinsäuren 2.1.3 Interaktionen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren 2.2 Aptamere und deren Gewinnung 2.2.1 Aptamere als universelle Binder 2.2.2 Das Grundverfahren der Aptamerselektion 2.2.3 Methodische Modifikationen des Selektionsverfahrens 3 Auswertung der Primär- und Sekundärstruktur von Nukleinsäuren 3.1 Numerische Beschreibung von Nukleinsäuren 3.1.1 Nukleobasendeskriptoren 3.1.2 Transformationsstrategien 3.1.3 Direkt anwendbare Beschreibungskonzepte 3.2 Konzeption einer Strategie zur Evaluation der Beschreibungskonzepte 3.2.1 Beschreibung und Vorverarbeitung des Datensatzes 3.2.2 Zusammenstellung von Deskriptorensets 3.2.3 Eingesetzte Methoden 3.3 Ergebnisse der Evaluation 3.3.1 Gegenüberstellung der Beschreibungskonzepte 3.3.2 Überprüfung der Plausibilität 3.3.3 Verhältnismäßigkeit 3.3.4 Abschließende Betrachtung 4 Mustersuche in biologischen Sequenzen 4.1 Sequenzmuster 4.1.1 Definition der Sequenzmuster 4.1.2 Bewertung konkreter Musterfunde 4.1.3 Bewertung einzelner Musterinstanzen 4.1.4 Visualisierung 4.2 Algorithmus zur Mustersuche 4.2.1 Suche in Suffixbäumen 4.2.2 Durchsuchen des Musterraumes 4.2.3 Optimierung der Suchstrategie 4.2.4 Ordnung der Ergebnisse 4.2.5 Zusammenfassung 5 Auswertung der Tertiärstruktur von Protein-Nukleinsäure-Komplexen 5.1 Übersicht der Bewertungsmodelle für Protein-Nukleinsäure-Komplexe 5.1.1 Wissensbasierte Paarpotentiale 5.1.2 Molekularmechanische Bewertung 5.1.3 Auswahl der Konzepte für die weitere Betrachtung 5.2 Vorstellung und Herleitung der ausgewählten Bewertungsmodelle 5.2.1 Die SPA-PN-Potentiale 5.2.2 Die modifizierten SPA-PN Potentiale 5.2.3 Die ITScore-PR Potentiale 5.2.4 Molekularmechanische Bewertung 5.3 Konzeption des Vergleichs der Bewertungsmodelle 5.3.1 Auswahl und Vorstellung der Referenzkomplexe 5.3.2 Generierung von Decoy-Strukturen 5.3.3 Quantifizierung der strukturellen Abweichung 5.4 Ergebnisse des Vergleichs 5.4.1 Referenzkomplex 4PDB 5.4.2 Referenzkomplex 5CMX 5.4.3 Gewichtung der HADDOCK-Bewertung 5.4.4 Visualisierung der Bewertung 5.5 Zusammenfassung 6 Selektion und Analyse eines Norovirus-Aptamers 6.1 Der Norovirus als Zielstruktur der Aptamerselektion 6.1.1 Epidemiologische Aspekte 6.1.2 Aufbau des Norovirus 6.1.3 Nachweis des Norovirus 6.1.4 Eingesetzter Norovirusstamm 6.2 Experimentelle Durchführung und Auswertung 6.2.1 Aptamerselektion 6.2.2 Evaluation der Anreicherung von Aptamerkandidaten 6.2.3 Experimentelle Verifikation der Bindung 6.2.4 Entwurf eines bioinformatischen Analyseprotokolls 6.3 Bioinformatische Analysen auf Basis der Primär- und Sekundärstruktur 6.3.1 Vorhersage der Sekundärstrukturen für die Aptamerkandidaten 6.3.2 Untersuchung der Anreicherung über die Clusteranalyse 6.3.3 Untersuchung der n-Gramm-Zusammensetzung 6.3.4 Durchführung einer Mustersuche 6.3.5 Validierung der Musterfunde 6.4 Bioinformatische Analyse auf Basis der Tertiärstruktur 6.4.1 Bestimmung der Struktur des Zielproteins 6.4.2 Bestimmung der Aptamerstruktur 6.4.3 Bildung eines Komplexes aus Aptamer und Zielprotein 6.4.4 Einschätzung der Relevanz für die Epitope der Proteinoberfläche 6.5 Konzepte für die spezifische Anreicherung von Oligonukleotidbibliotheken 6.5.1 Ableitbare Unterräume des Sequenz- und Strukturraumes 6.5.2 Zusammensetzung einer Bibliothek 7 Abschließende Betrachtung 7.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 7.2 Ausblick Literatur Versicherung

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un pathogène infectieux qui est associé à une hépatite fulminante chez l'humain. Ce virus possède un génome circulaire d'ARN simple brin comportant deux régions auto-catalytiques (ribozymes). Ce travail a pour but d'étudier le mécanisme moléculaire ainsi que le sentier de repliement tridimensionnel subit par ce ribozyme au cours de l'événement de coupure. Afin d'atteindre ce but, nous avons identifié toutes les interactions incluant les bases des ribonucléotides composant le coeur catalytique de ce ribozyme. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de sélection in vitro (SELEX). Malgré son utilisation commune pour l'étude du ribozyme VHD, l'approche de SELEX n'a jamais donné de résultats concluants au sujet de la tectonique de ce ribozyme pendant l'événement de coupure. Ceci est dû au fait que dans toutes les analyses précédentes, le site catalytique du ribozyme n'a jamais été totalement dégénéré. Par conséquent, nous avons développé une stratégie de SELEX unique qui nous a permis de dégénérer la presque totalité du site catalytique et de sélectionner tous les ribozymes actifs existant dans la librairie combinatoire. Au contraire des stratégies de sélection basées sur l'utilisation du ribozyme en trans, la stratégie que nous avons développée est basée sur l'utilisation du ribozyme en cis. Cette stratégie nous a permis de dégénérer des nucléotides de la tige P1 connus pour être étroitement impliqués dans des interactions tertiaires avec des nucléotides du site catalytique. La preuve initiale du concept a été réalisée en dégénérant les six nucléotides formant la jonction entre la tige P4 et la tige P2 (J4/2). Les ribozymes sélectionnés après quatre cycles d'enrichissement possédaient une activité de coupure comparable à celle du ribozyme de type sauvage. Ce résultat montre que la stratégie développée est, non seulement fonctionnelle, mais aussi très efficace. La stratégie a ensuite été utilisée pour sélectionner des variants actifs du ribozyme à partir d'une librairie combinatoire contenant plus de 7.5x10[indice supérieur 15] mutants différents. Après 13 cycles de sélection, la population de ribozymes actifs commençait à être détectable. L'analyse des mutants sélectionnés a révélé une très faible variabilité entre les séquences. Ceci constituait une entrave pour l'étape suivante qui consiste à analyser la covariation des nucléotides dégénérés afin de définir le réseau des interactions tertiaires qui réunit ces nucléotides et qui est à l'origine de sa structure tridimensionnelle. La faible variabilit des séquences sélectionnées est due à la dominance des variants les plus actifs camouflant ainsi ceux qui étaient moins actifs. Face à cette situation, nous avons fait un réajustement de notre stratégie de sélection afin d'éviter cette dominance et de donner à tous les ribozymes actifs la même chance d'être amplifié. Nous avons recommencé la sélection en utilisant les nouveaux réajustements et le séquençage de plus de 500 clones a été réalisé, nous conduisant à 150 ribozymes de séquences différentes. Nous avons développé par la suite un programme informatique qui nous a permis d'analyser la covariation des nucléotides aux positions dégénérées. Les résultats de cette analyse de covariation sont en parfaite concordance avec la structure secondaire du ribozyme VHD antigénomique. En effet, toutes les paires de bases de type Watson-Crick, Wobble et homopurine ont été confirmées à l'exception de la paire de base C19-G81 au bas de la P2. L'analyse bioinformatique suggérait une faible covariation entre ces deux nucléotides et montre une forte interaction entre le C19 et le G80. Cette interaction a été prouvée par cartographie enzymatique et chimique. Bien que cette nouvelle interaction engendre un changement minime dans la structure secondaire du ribozyme VHD antigénomique, ce changement est très significatif. En effet, suite à cette interaction, la nouvelle structure secondaire du ribozyme antigénomique se rapprochait étonnamment de celle du ribozyme de version génomique, suggérant ainsi un lien phylogénique entre ces deux ribozymes. Le ribozyme VHD est naturellement actif dans les cellules humaines (les hépatocytes), mais son utilisation comme outil de thérapie génique fait toujours face à un problème majeur de spécificité. Afin de résoudre ce problème et de mieux contrôler ce ribozyme au niveau cellulaire, nous avons tenté de remodeler ce ribozyme pour le transformer en un ribozyme allostérique, toujours en utilisant la stratégie de sélection in vitro. Nous avons choisi comme cofacteur la protéine tat du VIH. Dans ce système où le cofacteur est une molécule de la cible, le ribozyme allostérique va avoir non seulement un gain de spécificité mais deviendra auto-inductible par sa cible, exactement à la manière d'un anticorps. En résumé, ce travail a permis de jeter un nouveau regard sur le site catalytique du ribozyme VHD tout en poussant la méthode de SELEX à un nouvel extrême.

La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative qui amène à une perte progressive de la mémoire et cause des changements comportementaux. Selon plusieurs théories, le développement de cette maladie est associé à l’accumulation du peptide amyloïde beta et de la protéine tau dans des zones précises du cerveau humain. A l’heure actuelle, les approches thérapeutiques testées sont fondées sur l’hypothèse de la cascade amyloïde, mais les résultats n’ont pas été jugés suffisamment efficaces. Pour augmenter les chances de succès des traitements thérapeutiques existants, de meilleures techniques pour un dépistage précoce de l’Alzheimer semblent nécessaires. De ce fait, dans cette thèse, des stratégies innovantes pour l’analyse d’un des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer sont proposées. En particulier le projet porte sur l’analyse de la protéine tau avec des biocapteurs basés sur la Résonance de Plasmons de Surface (SPR). L’augmentation du niveau de ce biomarqueur dans le Liquide Céphalo-Rachidien (LCR) est déjà indicateur d’un processus de neurodégénérescence. De plus, si la mesure de la protéine tau est combinée à celle d’autres biomarqueurs de la pathologie (i.e. : amyloïde beta), les possibilités de dépistage sont fortement augmentées. Les travaux ont portés sur deux aspects : initialement l’interaction antigène-anticorps a été exploitée pour développer un immunocapteur pour la protéine tau. En utilisant cette technologie, nous avons pu caractériser les paramètres analytiques de l’essai direct (avec un seul anticorps) et ceux de l’essai sandwich (avec deux anticorps complémentaires). Dès ces premières approches, nous avons remarqué le besoin d’augmenter la sensibilité de la méthode SPR développée. En effet la limite de détection pour l’essai sandwich était de l’ordre du nM, alors que les niveaux de tau dans le LCR sont de l’ordre du pM. L’utilisation de nanotechnologies, en particulier des nanotubes de carbone, a permis d’atteindre des niveaux proches du pM, avec de bonnes performances en terme de répétabilité de l’essai.Une approche alternative a été conçue dans la deuxième partie du projet. Elle était consacrée à la sélection d’un aptamère pour la protéine tau, afin d’exploiter les avantages de cette classe de récepteurs par rapport aux anticorps. Pour accomplir cet objectif, deux stratégies de sélection ont été mises en place. Premièrement la sélection traditionnelle (SELEX, Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a été appliquée en utilisant l’Electrophorèse Capillaire (EC) comme moyen de séparation. Bien que de nombreuses conditions aient été modifiées, avec le SELEX traditionnel nous n’avons pas observé une évolution significative de l’affinité entre les séquences d’ADN et la protéine tau. Dans la deuxième approche nous avons utilisé la même méthode de séparation pour mener la sélection à travers l’EC-Non-SELEX. En utilisant cette méthode, où les étapes de PCR étaient réduites, une évolution positive a été observée après seulement trois rounds. En effet cinq séquences parmi celles issues du dernier round ont montré une affinité supérieure pour la cible par rapport à la banque. Néanmoins le nombre de séquences analysées à la fois par SPR et par anisotropie de fluorescence reste extrêmement limité par rapport au pool initial. Même si ceci semble être une limite, ce travail est le premier où les aptamères sont appliqués à l’analyse de la protéine tau. Le potentiel de cette classe de récepteurs reste en grande partie inexploré, ce qui laisse entrevoir des améliorations possibles de l’affinité grâce à de meilleurs processus de sélection et au développement de nouveaux outils bioinformatiques.En conclusion la SPR grâce à ses caractéristiques jouera un rôle fondamental dans les prochaines années pour l’analyse des biomarqueurs et pour le screening de nouvelles molécules, qui seront l’objet de futurs essais cliniques pour limiter l’agrégation de la protéine tau. / Alzheimer’s disease (AD) is a widespread pathogenic condition causing memory and behavior impairment mostly in elderlies because of the accumulation of amyloid beta peptide and tau protein in human brain. Current therapeutic approaches, based on the amyloid hypothesis, are unable to arrest the progression of the disease, hence early diagnosis is crucial for an effective intervention. Based on the updated criteria for AD probable diagnosis, and considering the limits associated with the actual analytical techniques, my work in this thesis was dedicated to develop novel strategies for AD diagnosis. The whole project focused on the analysis of tau protein by Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensing. Such protein is well known for being relevant as neurodegenerative marker. In particular if the measurement of tau is associated with that of the amyloid beta peptide and that of the phosphorylated tau, the clinical specificity of this protein become significant to detect Alzheimer. Two aspects were studied; first of all an immunosensor was developed taking advantage of the well-established antigen-antibody interaction. After characterization of the analytical parameters of the direct assay (with primary antibody), a sandwich assay (using two monoclonal antibodies mapping on different analyte i.e. protein tau epitopes) was developed, allowing very low sensitivity to be obtained in artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF). In particular to enhance the analytical signal Carbon Nano Tubes (CNTs) were used. Secondly, the research was focused on the selection of aptamers for tau. To this aim two SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) methods were compared, both based on Capillary Electrophoresis (CE) for partitioning step of the process. Whether with CE-SELEX (first method), no significant affinity improvement was measured, using the CE-Non-SELEX (second method) affinity of the DNA library for tau protein was consistently improved. After isolation of a limited population of aptamer candidates, five sequences were chosen to be analyzed for their affinity for the target. Fluorescence Anisotropy (FA) measurements and SPR highlight similar behavior for the selected sequences, despite the detection principles of these techniques are significantly different. In conclusion the work highlight versatility of SPR technology used both for quantitative analysis and for new selected aptamers characterization in terms of affinity for the analyte tau. The above mentioned versatility is of great interest in a field such AD, which is rapidly expanding. Lowering the total tau levels has been recently identified as a new goal for therapy. Therefore many drug candidates are likely going to be tested in the near future. SPR technology is already widely used in pharmaceutical industry to investigate novel molecules, since it gives access to a large panel of information. In this panorama aptamer technology may improve the overall quality of the analytical data, allowing better comparison among drug candidates. With respect of these receptors, the thesis opened the door to new studies for DNA aptamers to recognize tau, with considerable advantages in term of the receptor stability. Moreover the whole potential of DNA aptamers selected in this work still remain to be explored. New selection methodologies, combined with fast progression of bioinformatics tools might give rise to affinity improvement, which will lead to sensitivity improvement for tau detection in the next few years.

La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l'ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l'ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L'oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l'ADN.

It is well known boronic acids have its unique chemistry and related applications in organic synthesis. The boronic acid functionally group also plays very important roles in medicinal chemistry and chemical biology. For example, boronic acids have been developed as potential therapeutic agents, chemical biology tools. All these applications are directly related to the unique electronic and chemical properties of the boronic acid group. Herein, several application of boronic acids have been studied: 1) several groups of compounds were found as bacterial quorum sensing inhibitors; 2) a boronate compound was developed as a probe for detecting reactive oxygen species (ROS); and 3) boronic acid-modified aptamers can be used for glycoprotein recognition.

Aptamer probes for specific recognition of glioblastoma multiforme were generated using a repetitive and broad cell-SELEX-based procedure without negative selection. The 454 sequencing technology was used to monitor SELEX, and bioinformatics tools were used to identify aptamers from high throughput data. A group of aptamers were generated that can bind to target cells specifically with dissociation constants (K d ) in the nanomolar range. Selected aptamers showed high affinity to different types of glioblastoma cell lines, while showing little or no affinity to other cancer cell lines. The aptamers generated in this study have potential use in different applications, such as probes for diagnosis and devices for targeted drug delivery, as well as tools for molecular marker discovery for glioblastomas.

The Life Marker Chip (LMC) instrument was developed with the aim to detect evidence of life on Mars. The detection was based on an inhibition immunoassay. In this work aptamers were evaluated as potential alternative to antibodies for the LMC. Aptamers were synthetic oligonucleotides able to bind specifically with high affinity to a wide range of target molecules, and have been also integrated as bioreceptors in several detection instruments. The generation of new aptamers against two small molecules using the FluMag-SELEX method was tested and was verified the adaptability of pre-existing aptamers against small targets to the LMC assay type. Based on the fact that the LMC was going to be integrated into the space programme ExoMars, it was also implemented into a small scale experiment the Planetary Protection and Contamination Control requirements found on a life-search mission. In addition to that aptamers compatibility with a sterilisation procedure used in life-search missions was also tested. Furthermore because of the nature of the small molecules studied, multiple analytical chemistry techniques were assessed to verify covalent chemistry surface immobilisation. Within the project timeline it was not possible to achieve a full aptamer generation process but it was possible to understand the methodology behind the procedure and give input for future work. It was found that the direct implementation of existing aptamers against small molecules into the LMC assay was not successful. It was also seen that in the case of aptamer integration onto the LMC some assay changes would probably have to be made. This information was very useful to understand if aptamers could be an alternative to antibodies and be implemented directly into the LMC. It was found that aptamers survived the preliminary sterilisation method applied, which might open the possibility of making aptamers convenient space bioreceptors, reducing time and costs of instrument Planetary Protection implementation. In conclusion aptamers were not straightforward alternatives to antibodies for the LMC because aptamers interacted differently with their targets in comparison to antibodies, particularly with small molecules. Also the biochemical simplicity of the small molecule targets introduced difficulties in aptamers generation that more complex targets would have not. Although aptamers shown incompatibility with the LMC assay format against small targets, they presented resilience to a sterilisation procedure implemented on space missions which could lead to the development of more robust bioreceptors for space missions. This information was helpful in understanding which assay formats were better for detection of small molecules using aptamers and that might contribute for future assay choices applied in detection instruments. It was also possible to make recommendations for the LMC regarding design and validation methods used in life-search missions based on the lessons learn from the developed of a small scale experiment. The developed work was presented at conferences and mentioned in an article journal, and in that way contributed to the knowledge of the space community in general.

Fibrinogen aggregation is the last step in blood coagulation. Inhibition of fibrinogen aggregation could lead to anticoagulation effects. However, there is no good method for the ready evaluation of fibrinogen coagulation. A commonly used path method is slow and requires an expensive instrument. In this project, we have developed a microplate reader and In evaluating inhibitors of fibrinogen coagulations there is no good method. As an important process in hemostasis, fibrinogen coagulation is often detected by micro-plate reader. In our test of fibrinogen coagulation, we improved the observing and analyzing method by using photograph to see concentration-depended effect of thrombin inhibitors on the coagulation. Three known thrombin inhibitors, AEBSF, APMSF and PMSF, were applied to develop the method for detecting the fibrinogen coagulation. The results showed our method is of accuracy in determination of the amount of fibrin when compared with other types of methods.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Medicine, Division of Experimental Medicine. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/09). Includes bibliographical references.