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Modifications post-traductionnelles d'une serpine humaine recombinante exprimée chez les plantesBenchabane, Meriem. 12 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le potentiel des plantes pour la production hétérologue de protéines recombinantes est maintenant bien établi, mais des problèmes de stabilité et de modifications post-traductionnelles inadéquates des protéines persistent et nuisent au développement des plateformes végétales. Bien que les plantes aient la capacité d'effectuer la plupart des modifications post-traductionnelles nécessaires aux propriétés biologiques des protéines produites, il existe des différences subtiles mais significatives entre les modifications post-traductionnelles des protéines chez les mammifères et les plantes. Ces différences peuvent affecter les propriétés biologiques des protéines recombinantes végétales et entraver leur valeur commerciale. Parmi ces modifications, la N-glycosylation et la maturation protéolytique sont celles qui affectent le plus souvent les rendements et la qualité des produits recombinants. Afin d'étudier le potentiel des plantes à produire des glycoproteines complexes, nous avons exprimé en culture cellulaire de tabac Nicotiana tabacum cv BY-2 l'inhibiteur de protéases alpha 1-antichymotrypsine (AACT) humaine, une glycopotéine d'intérêt clinique. La protéine a été adressée vers le compartiment endomembranaire de sécrétion (RE, vacuole et apoplasme) ou exprimée directement dans le cytosol afin d'établir l'impact de la localisation cellulaire sur sa stabilité et sa glycosylation. Nos études ont montré que, bien qu'exprimé dans tous les compartiments cellulaires, le produit obtenu était plus hétérogène au sein du système endomembranaire, probablement en raison d'une maturation de la N-glycosylation et à une maturation protéolytique indue. Inversement, la protéine recombinante exprimée dans le cytosol, sous forme non glycosylée, montrait une plus grande stabilité. Des études d'immunolocalisation ont par ailleurs démontré que cette forme de l'AACT exprimée dans le cytosol montrait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L'AACT possède un site de liaison à l'ADN et une mutation de ce site a permis ici d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire. Ces derniers résultats suggèrent que la liaison à l'ADN est impliquée dans la rétention nucléaire de l'AACT. / Plants represent interesting production platforms for recombinant proteins of therapeutical value. While the proof of concept for protein production in plants is no longer a matter of debate, protein stability and post-translational modifications essential for biological activity pose, on the other hand, serious challenges to the development of plant factories. Plant cells can perform most protein post-translational modifications, but plant and mammalian proteins often present minor but significant differences, with a possible negative impact on their commercial value. To assess the potential of plants for the production of structurallycomplex mammalian proteins, we expressed human alphal-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY-2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular final destination on accumulation, stability and glycosylation of the resulting variants. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms. This post-translational maturation apparently was the result of glycan maturation and proteolytic processing of the polypeptide along the secretory pathway. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution thus suggesting a role of DNA binding in recombinant AACT nuclear retention. Taken together, these results illustrate the complex and unpredictable nature of recombinant protein posttranslational maturation, and stress the need for additional empirical data on the expression of complex glycopropteins in plant cells.
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Rôles de la protéine Iris dans l'accomplissement du repas sanguin de la tique Ixodes ricinusPrévot, Pierre-Paul 18 April 2007 (has links)
Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus – a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique I. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte. En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immunosuppressor ». Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’Iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus.<p>La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), Iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sérine protéases, et en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’Iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte.<p>Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’Iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RCL, et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés par analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD).<p>Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que l’IFN-g par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée. Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’Iris - dépourvu d’activité anti-protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa :105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire.<p>Enfin, nous avons également analysé l’importance d’Iris au cours du repas sanguin de la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques nourries sur des lapins immunisés par la protéine rIris ne survivent pas au repas. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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