Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-29Bitstream added on 2014-06-13T19:06:52Z : No. of bitstreams: 1 alonso_rv_me_araca.pdf: 634055 bytes, checksum: 34e27dc3df85046bfbf38cde5c4733bf (MD5) / O crescente avanço da produção in vitro de embriões bovinos intensificou a utilização de outras biotecnologias da reprodução tais como a micro-manipulação embrionária e o diagnóstico genético pré-implantacional, sendo a identificação do sexo embrionário utilizada na rotina comercial de laboratórios de produção in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar as interações de diferentes fatores sobre a taxa de mortalidade embrionária e a proporção do sexo de embriões bovinos submetidos ao processo de sexagem. Foi realizado levantamento no banco de dados da Transfix – Transplante de Embriões Ltda, Patrocínio Paulista / Brasil, referente a 4.650 embriões produzidos in vitro e sexados entre 2005 e 2007. Os embriões foram submetidos à micro-manipulação pela técnica de micro-aspiração, e as biópsias à reação em cadeia pela polimerase (PCR). Somente as fêmeas foram transferidas para receptoras previamente sincronizadas. O diagnóstico de gestação e a determinação do sexo fetal foram realizados por ultra-sonografia. As variáveis foram classificadas de acordo com o sexo dos embriões (macho, fêmea e indeterminado), cinco laboratórios (A, B, C, D e E), seis raças bovinas (Nelore, Brahman, Girolando, Simental, Holandês e Jersey), estágio embrionário (MO, BI, BL, BX e BE), qualidade embrionária (1, 2 e 3) e qualidade da biópsia (“dentro do padrão” e “fora do padrão”). As análises estatísticas foram realizadas pelos testes 2 de associação, 2 de aderência para proporção 1:1 e pela análise de regressão logística com o método de Hosmer-Lameshow utilizando o procedimento logístico (PROC LOGISTIC) programa computacional SAS. A PCR apresentou eficiência de 93,3%, acurácia de 93,2% e taxa de machos e fêmeas de 52,9% e 47,1%, respectivamente. A taxa de mortalidade dos embriões... / Crescent progress of in vitro bovine embryo production has improved the use of other reproductive biotechnologies, as embryo micromanipulation and preimplantation genetic diagnosis, being embryo sexing used in commercial routine of in vitro embryo production laboratories. The present study aimed to evaluate the interactions among different factors on the mortality rate and sex ratio of in vitro produced bovine embryos. A survey was performed in the Transfix – Transplante de Embriões Ltda, Patrocínio Paulista / Brazil data base, referring to 4.650 in vitro produced bovine embryos sexed during years 2005/2007. Embryos were submited to the biopsy by the microaspiration technique, and biopsies to the polymerase chain reaction (PCR). Only female embryos were transferred to synchronized recipients. Pregnancy diagnosis and fetal sex determination were carried out by ultrasound. The variables were classified according embryo sex (male, female and indeterminate), five laboratories (A, B, C, D and E), six bovine breeds (Nellore, Brahman, Girolando, Simmental, Holstein and Jersey), embryo stage (MO, EB, BL, XB and HB), embryo quality (1, 2, and 3) and biopsy quality (“standard” and “non standard”). The statistical analysis was carried out by association 2 test, 2 for 1:1 ratio and logistic regression analysis with Hosmer- Lameshow method using logistic procedure (PROC LOGISTIC) of SAS package. The PCR showed 93.3% efficiency, 93.2% accuracy and male and female ratio of 52.9% and 47.1%, respectively. Mortality rate of biopsied embryos was 10.3% and pregnancy rate was 31.7%. Although no significant differences were observed between male and female ratio, indeterminate embryos possess greater possibility to die after micromanipulation. For quality 2 and 3 embryo mortality rate after biopsy was 3.19 and 11.37 fold higher, respectively, than for quality 1 embryo. For those whose biopsy... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4098.pdf: 4555828 bytes, checksum: eeec91702a4d283144c291e30559f09c (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / In this paper we proposed and analyzed methodologies using the technology of Cell-Free Fetal Nucleic Acid-Free (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) in noninvasive prenatal diagnosis (NIPD). Due to the modern technologies employed and their repercussion among the involved families, we sought to discuss some ethical, social and legal implications. Contrary to the popular belief that the placenta forms an impermeable barrier between mother and child, there is bidirectional traffic between the fetus and mother during pregnancy. Several studies have shown that not only intact cells but also fetal cell-free fetal nucleic acids (cffNA, ie, DNA and RNA) cross the placenta and travels in the mother's bloodstream. Four different applications of analysis technology were identified: cffDNA: a) Prenatal Sex Determination, used in pregnancies under the risk of sexual transmitted diseases and performed through the detection of the Y chromosome b) The diagnosis of certain diseases of a single gene through the detection of paternally inherited mutation c) Fetal Aneuploidy, such as Down syndrome, where chromosomal abnormalities may occur d) identifying the type of fetal blood in pregnancies under the risk of incompatibility, especially RhD. To carry out this work it was used the pre-natal determination of sex in 53 pregnant women at different gestational periods. For that it was proposed and tested methods of DNA extraction, amplification of DNA obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) and a new methodology called LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) and the analysis of final results. Furthermore, the efficiency of LAMP and PCR was compared by amplifying different segments of the Y chromosome: DSY14 and TSPY. In three cases the samples were discarded because there was no fetal sex confirmation after molecular tests due to loss of contact with pregnant women. In two other cases the results pointed to male fetuses whilst the ultrasound confirmed these fetuses as females due to contamination. Finally it was obtained 28 male samples (58.33%) with amplification of the sequences of the Y chromosome and 20 female samples (41.67%) that did not amplify the sequence of the Y chromosome but only for the control. These results showed that the amplification lamp is more efficient than PCR, in the analysis of DSY14, the limit of detection is 10 pg and 0.1 pg for LAMP and PCR respectively. It was concluded that the amplification using the LAMP method is faster (60 min) and has a high sensitivity and specificity and does not require sophisticated equipment for reaction if compared to the PCR method. These characteristics make this methodology feaseable in laboratories with limited resources. / Neste trabalho propusemos e analisamos metodologias empregadas no uso da tecnologia dos Ácidos Nucléicos Livres de Células Fetais (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) no diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN = Non-invasive Prenatal Diagnosis). Dada a modernidade das tecnologias empregadas e a sua repercussão nas famílias envolvidas, procuramos discutir algumas implicações éticas, sociais e legais. Ao contrário da crença popular de que a placenta constitui uma barreira impermeável entre mãe e filho, há tráfego bidirecional entre o feto e a mãe durante a gravidez. Vários estudos têm demonstrado que tanto células fetais intactas e ácidos nucléicos livres de células fetais (cffNA, ou seja, DNA e RNA) atravessam a placenta e circulam na corrente sanguínea materna. Identificamos quatro diferentes aplicações da tecnologia de análise do cffDNA: a) Determinação pré-natal do sexo, utilizada em gestações com risco de uma doença ligada ao sexo e realizada através da detecção do cromossomo masculino Y; b) O diagnóstico de certas doenças de gene único, normalmente através da detecção de mutação herdada paternalmente; c) Aneuploidia fetal, tal como a Síndrome de Down, onde há alterações cromossômicas; d) Detecção do tipo de sangue fetal em gestações com risco de incompatibilidade, sobretudo RhD. Para realizar este trabalho utilizamos a determinação pré-natal do sexo em 53 gestantes em diferentes períodos gestacionais. Para tal, testamos e propusemos metodologias de extração do DNA; amplificação do DNA extraído através da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) e de uma nova metodologia denominada LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification); e a análise final dos resultados. Além disso, comparamos a eficiência da PCR e LAMP amplificando diferentes segmentos do cromossomo Y: DSY14 e TSPY. Em três casos as amostras foram descartadas porque não houve a confirmação do sexo fetal após os testes moleculares devido à perda de contato com as gestantes. Em outros dois casos os resultados apontaram para fetos masculinos, entretanto, no ultra-som eles foram confirmados como femininos, provavelmente devido a uma contaminção. No final obtivemos 28 amostras (58,33%) masculinas, com a amplificação das sequências do cromossomo Y e 20 amostras (41,67%) femininas que não amplificaram a sequência do cromossomo Y e apenas para o controle. Nossos resultados demonstraram que a amplificação por LAMP é mais eficiente que a PCR na análise de DSY14, sendo que o limite de detecção é de 10 pg e 0,1 pg, para a PCR e o LAMP, respectivamente. Concluímos que a amplificação utilizando a metodologia de LAMP é mais rápida (60 minutos) e apresenta uma alta especificidade, sensibilidade e não requer equipamentos sofisticados para reação, comparada com a técnica da PCR. Tais características viabilizam esta metodologia em laboratórios com poucos recursos.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-28T11:38:58Z No. of bitstreams: 1 Adriana Wanderley Taveiros.pdf: 657445 bytes, checksum: 7c3d82e0aa3e31bc2f15930aca51db7c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T11:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana Wanderley Taveiros.pdf: 657445 bytes, checksum: 7c3d82e0aa3e31bc2f15930aca51db7c (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / In the experiment 01 the purpose of this work was to optimize the reproductive potential of embryos donors (n = 5) of the Mangalarga Marchador breed submitted to an annual program of embryo production. In Southeast Region, Três Rios – RJ, the embryo recovery was performed between November/2005 and April/2006 and in Northeast Region from May to December/2006. The donors and recipients mares were monitored every other day by rectal and ultrasonographic examinations until they ovulated. On the eight days after ovulation the uteri of the donors were flushed with lactated Ringer’s solution and the embryos were immediately transferred to the recipients mares, which were examined eight days later to confirm the pregnancy. Eighty flushes provided 69 (86.3%) embryos with 37 (53.6%) pregnancies, result that showed the possibility to produce embryo over the whole year. The donors produced, in the Southeast Region, 7.8±1.4 embryos and 4.0±1.0 pregnancies and in Northeast Region, 6.0±2.0 embryos and 3.4±1.1 pregnancies. With this alternative in the program was possible to obtain additionally 6.0 embryos and 3.4 pregnancies. The results allow recommending the use of embryo donors over the whole year because provide higher number of birth, as well as accelerate the genetic breed horse development. In the experiment 02 The purpose of this study was to compare the effectiveness of techniques such as artificial insemination and embryo transfer, with the indices of embryonic death occurred in the conduct of these techniques, during the years of 2003 to 2006. Mares were used racial mangalarga marchador aged ranging between 05 and15 years. The mares were divided into two groups: Artificial Insemination (Group 01) and transfer of embryos (Group 02). Both groups were monitoring the cycle estral on alternate days with the help of ultra-sonography, being inseminated by ovulation from the detection of the beginning. In animals belonging to the group 01 the diagnosis of pregnancy was performed in the 15-day post - ovulation with monitoring in the days 30, 45 and 60 of gestation. In Group 02 on the eighth day post - ovulation was held the harvesting of embryo by open method, using the solution with lactated Ringer, washed positive for embryo were inoculated in receiving in good conditions that have their reproductive cycle estral controlled until ovulation. Only the embryos were inoculated ranked from 01 to 03. In this group the diagnosis of pregnancy was performed in 05 ° day after inovulação in receiving and monitoring was performed on days 15, 30, 45 and 60 of gestation. Between the years of 2003 and 2006 the group 01 received half year around 11.6%, while in group 02 to annual average was around 12%. The results suggest that allows no interference from the implementation of the techniques in rates of embryonic loss. In the experiment 03 This aim of this study was to diagnostic previously the gender of equine fetuses (n = 157) of Mangalarga Marchador by ultra-sound, identifying the final position of the genital tubercle or viewing the anatomical structures of external genitalia. The exams were realized in alternate days, by via transrectal, between 58º and 69º, as well as between 90º and 150º dayof pregnancy. The mares were artificially inseminated on the ovulation day and this day was considered as pregnancy day (Day 0). The pregnancy diagnosis was performed on the 15º day after ovulation. There was not observed difference (P > 0. 05) on the fetal sexing accuracy between male (95.6%) and female fetuse (91.4%). However, was verified that the accuracy of the exam realized takin into consideration the genital tubercle (90.1%) was lower (P < 0. 05) than exam made takin into consideration the genital structures (93.7%). The results allow to conclude that the ultrasound is a suitable method to early diagnostic the fetal sex by identification of final position of genital tubercle, especially by visualization of anatomical structures of external genitalia. / Neste trabalho objetivou-se aumentar a eficiëncia reprodutiva de fëmeas da raça Mangalarga Marchador. No Experimento 01 o objetivou-se otimizar o potencial reprodutivo de doadoras (n = 5) de embrião da raça Mangalarga Marchador submetidas a um programa anual de produção de embrião. Na Região Sudeste, Três Rios – RJ, as colheitas foram realizadas entre novembro de 2005 e abril de 2006 e na Região Nordeste, Limoeiro – PE, de maio a outubro de 2006. As doadoras e receptoras foram monitoradas, em dias alternados, por palpação retal com auxílio de ultra-som até a ovulação. As doadoras foram inseminadas também em dias alternados até a ovulação. No oitavo dia após a ovulação foi realizada a lavagem uterina com a solução Ringer-Lactato e os embriões foram imediatamente transferidos para as receptoras, as quais foram examinadas sete dias após para confirmação da gestação. De 80 lavados efetuados foram recuperados 69 (86,3%) embriões com 37 gestações (53,6%), resultado que evidenciou ser possível manter a produção de embriões na espécie eqüina durante todo o ano. As doadoras na Região Sudeste produziram 7,8±1,4 embriões com 4,0±1,0 gestações e no Nordeste produziram 6,0±2,0 embriões com 3,4±1,1 gestações. Com esta alternativa no programa foi possível obter adicionalmente 6,0 embriões e 3,4 gestações. Os resultados permitem concluir que é recomendável utilizar doadoras de embrião durante todo o ano porque propicia maior número de nascimentos,bem como acelera o melhoramento genético do rebanho.No experiento 02 o objetivo foi monitorar o período crítico da perda embrionária/fetal em programa de inseminação artificial e de transferência de embriões eqüinos da raça Mangalarga Marchador. O experimento foi realizado entre os anos de 2003 e 2006, na Fazenda Pedra Verde localizada no Estado de Pernambuco. Foram utilizadas 340 éguas da raça Mangalarga Marchador durante os quatro anos de experimento. As éguas foram distribuídas no grupo da inseminação artificial e no da transferência de embriões. Todas as fêmeas foram monitoradas, em dias alternados, por palpação retal com auxílio de ultra-som até a ovulação. As fêmeas da inseminação artificial e as doadoras foram inseminadas em dias alternados até a ovulação. No oitavo dia após a ovulação foi realizada a lavagem uterina com a solução Ringer-Lactato nas doadoras e os embriões foram imediatamente transferidos para as receptoras. Os diagnósticos de gestação foram realizados no 15° dia após a ovulação nas fêmeas artificialmente inseminadas e no 7° dia após a transferência do embrião, sendo todas monitoradas nos dias 20, 25, 30 e 45 de gestação para avaliação de possível perda embrionária. Das éguas artificialmente inseminadas obteve-se 879 gestações, sendo que 94 (10,7%) resultaram em perda embrionária/fetal, enquanto no programa de transferência de embrião, das 338 gestações resultantes, 40 (11,7%) resultaram em perda. No programa de transferência as perdas embrionárias foram mais tardias,provavelmente, devido ao retardo na implantação do embrião. Não foi constatada diferença significativa (P > 0,05) entre as perdas embrionárias ocorridas na inseminação artificial ena transferência de embrião. Os resultados permitem concluir que a perda embrionária precoce não está relacionada com a inseminação artificial ou com a transferência de embriões, desde que sejam adotadas práticas de manejo semelhantes para todas as fêmeas.Quanto ao período de gestação em que ocorreu a perda embrionária foi constatada uma queda significativa (P < 0,05) do 31º ao 40º dia de gestação. No experimento 03 objetivou-se diagnosticar precocemente o sexo de fetos eqüinos (n = 157) da raça Mangalarga Marchador por ultra-som, identificando-se a posição final do tubérculo genital ou visualizando-se as estruturas anatômicas da genitália externa. Os exames foram realizados em dias alternados, por via transretal, entre o 58º e o 69º, bem como entre o 90º e o 150º dia de gestação. As éguas foram artificialmente inseminadas no dia da ovulação, o qual foi considerado como o dia 0 da prenhez. O diagnóstico de gestação foi realizado no 15° dia após a ovulação. Não foi observada diferença (P > 0,05) na acurácia da sexagem entre feto macho (95,6%) e fêmea (91,4%). Todavia, foi verificado que a acurácia do exame realizado apenas com base no tubérculo genital (90,1%) é menor (P < 0,05) do que a do exame efetuado considerando as estruturas da genitália externa (93,7%). Os resultados permitem concluir que o ultra-som é um método apropriado para diagnosticar precocemente o sexo fetal através da identificação da posição final do tubérculo genital, especial pela visualização de estruturas natômicas da genitália externa.