This Thesis had as objectives to study the hydration process of grains with sigmoidal behavior, evaluating ultrasound technology to improve it, the possible effects on germination, cooking and a possible incorporation of nutrients. The work was developed in three parts. The first part consisted of describing the hydration kinetics of many grains to have a data bank of hydration kinetics, allowing further selections. Furthermore, this part compared the differences among grains hydration kinetics, associating them with the intrinsic properties of the grains and questioning some inferences previously published in the literature. The second part was related to study the effect of ultrasound on the hydration kinetics of grains with sigmoidal behavior, being studied Andean lupin, mung beans and white kidney beans. Further, the effect of ultrasound in combination with soaking water at high temperatures was studied to demonstrate if they have additive, synergic or antagonist effect. The effect of ultrasound technology was evaluated in the water uptake, extraction of components, germination and cooking kinetics. The third part consisted of studying and describing the incorporation of a nutrient inside the grains, taking advantage of the hydration process. Further, ultrasound was used to improve this incorporation. The main results of this work corroborate that the hydration process is a complex phenomenon, and many intrinsic properties of the grains causes the kinetics differences. In addition, the fact that only legume grains have sigmoidal behavior of hydration was proved. Further, the ultrasound accelerated the hydration process of grains with sigmoidal behavior without affecting the grain starch, improving the extraction of undesirable components, enhancing or hindering the germination (depending on the grain), but without affecting the cooking process. Another result was that the higher the soaking water temperature is, the lower the ultrasound effect on hydration is. Finally, regarding nutrient incorporation, a hydrophilic nutrient (iron) was incorporated in a grain during hydration process demonstrating that it is possible. The iron incorporation had the same behavior as the water uptake, suggesting similar mechanisms and phenomena of mass flow. In addition, the incorporated iron was attached not only to the bean cotyledon, but also mostly in the seed coat. Furthermore, ultrasound technology enhanced this process. The cooking process of the studied grains was improved, and its germination was hindered by the incorporated iron. In conclusion, ultrasound technology can be used for improving the hydration process of grains with sigmoidal behavior, being also practical for nutrient incorporation into grains. / A presente Tese teve como objetivos estudar o processo de hidratação de grãos com comportamento sigmoidal de hidratação, avaliar a tecnologia de ultrassom para a sua melhora, os possíveis efeitos na germinação, cozimento e possível incorporação de nutrientes. O trabalho foi feito em três etapas. A primeira etapa consistiu em realizar uma prospecção de hidratação de diversos grãos, auxiliando na escolha dos futuros grãos a serem estudados. Ainda, comparou-se as cinéticas de hidratação associando-as com as propriedades intrínsecas dos grãos, avaliando diversas inferências publicadas sobre o processo. Na segunda etapa estudou-se o efeito do ultrassom de alta potência no processo de hidratação de três grãos com comportamento sigmoidal: tremoço andino, feijão moyashi e feijão branco. Também foi avaliado o efeito combinado do ultrassom e a temperatura da água de hidratação. O efeito da tecnologia de ultrassom foi avaliado na cinética de absorção de água, extração de compostos, germinação e cozimento. A terceira etapa consistiu em aproveitar o longo tempo do processo de hidratação para incorporar um nutriente hidrossolúvel dentro do grão. O ultrassom foi também usado para acelerar este processo. Os resultados mais importantes da Tese foram que se corroborou que a hidratação de grãos é um processo complexo e que há muita dificuldade em correlacionar as propriedades intrínsecas dos grãos com as características da hidratação. Ainda, foi demonstrado que o comportamento sigmoidal de hidratação é somente encontrado em grãos da família das leguminosas. Também foi demostrado que o ultrassom acelera a hidratação de grãos com comportamento sigmoidal e que esta tecnologia não afeta o amido dos grãos, melhora ou piora a germinação (dependendo do grão), e não afeta o cozimento. Corroborou-se que quanto maior a temperatura da água, menor é o efeito do ultrassom na cinética de hidratação. Finalmente, demonstrou-se que é possível incorporar nutrientes solúveis dentro dos grãos, aproveitando assim o longo tempo de hidratação. Encontrou-se que a incorporação de nutrientes segue mecanismo similar que a entrada de água, e que pode ser acelerado usando ultrassom. Também, foi demonstrado que o ferro foi incorporado no cotilédone e no tegumento (em maior quantidade), e que este composto melhora o cozimento do feijão, porém prejudica a sua germinação. Em conclusão, o ultrassom pode ser usado para melhorar o processo de hidratação de grãos e para a incorporação de algum nutriente.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-07-18T17:58:49Z No. of bitstreams: 1 JoseRibamarFonseca.pdf: 2069580 bytes, checksum: 26f5e4becf41e81d4359f2bc5df171fa (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T17:58:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseRibamarFonseca.pdf: 2069580 bytes, checksum: 26f5e4becf41e81d4359f2bc5df171fa (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) / The adaptive filtering is currently an important tool in the statistical processing of signals, especially when it is necessary to process signals from environments with unknown statistics varying with time. The adaptive filtering study was driven by the development of the Least Mean Square algorithm (LMS) in 1960. Since then other adaptive algorithms have come up with a better performance than LMS algorithm with respect to misadjustment and convergence rate. Among them, the Sigmoidal algorithm (SA) which showed superior to the LMS, for the convergence rate and the mismatch in their implementations infinite precision. In hardware devices such as DSPs, microcontrollers and FPGAs, adaptive algorithms are implemented in finite precision, in general, fixed point arithmetic. When the adaptive filters are implemented in finite precision some effects can affect their performance. Ultimately lead to divergence due to quantization errors specified in the approximation process of the variables involved in the adaptive processing of their original values. Thus, this article aims to analyze the performance of the adaptive algorithm Sigmoidal (SA) in finite precision when implemented using fixed-point arithmetic. In particular, the analysis of its performance curve and mismatch, comparing them in different word lengths (number of bits). The results presented in this article proposes a series of Taylor Ln gradient of cost function (cosh αe) algorithm SA for implementation in finite precision. We analyze its performance curve for different lengths of words. It shows that the algorithm is stable in its performance compared to convergence to different lengths of words, and that the increase in mismatch level at steady state is sensitive or afected by the quantization of the variables involved in the calculations of this algorithm. / A filtragem adaptativa constitui atualmente uma ferramenta importante no processamento estatístico de sinais, especialmente quando é necessário processar sinais provenientes de ambientes com estatísticas desconhecidas que variam com o tempo. O estudo de filtragem adaptativa foi impulsionado com o desenvolvimento do algoritmo Least Mean Square (LMS) em 1960. Desde então outros algoritmos adaptativos têm surgido com um desempenho superior ao algoritmo LMS em relação ao desajuste e à taxa de convergência. Entre eles, o algoritmo Sigmoidal (SA) que se apresentou superior ao LMS, em relação a taxa de convergência e o desajuste em suas implementações na forma analógica. Nos dispositivos de hardware, tais como DSPs, Microcontroladores e FPGAs, os algoritmos adaptativos são implementados na forma digital, onde a precisão é finita, em geral, com aritmética de ponto fixo. Quando os filtros adaptativos são implementados em precisão finita alguns efeitos podem afetar o seu desempenho. Em última análise, levar à divergência devido aos erros de quantização especificados no processo de aproximação dos valores das variáveis envolvidas no processamento adaptativo de seus valores originais. Assim, este trabalho propõe analisar o desempenho do algoritmo adaptativo Sigmoidal (SA) em precisão nita, quando implementado utilizando aritmética de ponto xo. Em particular, a análise de sua curva de desempenho e o desajuste, comparando-os em diferentes comprimentos de palavras (número de bits). Os resultados apresentados neste trabalho propõe uma aproximação em série de Taylor do gradiente da função de custo Ln(cosh αe) do algoritmo SA para implementação em precisão finita. Analisamos a sua curva de desempenho para diferentes comprimentos de palavras. Mostra-se que o algoritmo apresenta estabilidade em seu desempenho em relação à convergência, para diferentes comprimentos de palavras, e que o aumento no nível do desajuste em estado estacionário é sensível ou influenciado pela quantização dos valores das variáveis envolvidas nos cálculos desse algoritmo.

This Thesis had as objectives to study the hydration process of grains with sigmoidal behavior, evaluating ultrasound technology to improve it, the possible effects on germination, cooking and a possible incorporation of nutrients. The work was developed in three parts. The first part consisted of describing the hydration kinetics of many grains to have a data bank of hydration kinetics, allowing further selections. Furthermore, this part compared the differences among grains hydration kinetics, associating them with the intrinsic properties of the grains and questioning some inferences previously published in the literature. The second part was related to study the effect of ultrasound on the hydration kinetics of grains with sigmoidal behavior, being studied Andean lupin, mung beans and white kidney beans. Further, the effect of ultrasound in combination with soaking water at high temperatures was studied to demonstrate if they have additive, synergic or antagonist effect. The effect of ultrasound technology was evaluated in the water uptake, extraction of components, germination and cooking kinetics. The third part consisted of studying and describing the incorporation of a nutrient inside the grains, taking advantage of the hydration process. Further, ultrasound was used to improve this incorporation. The main results of this work corroborate that the hydration process is a complex phenomenon, and many intrinsic properties of the grains causes the kinetics differences. In addition, the fact that only legume grains have sigmoidal behavior of hydration was proved. Further, the ultrasound accelerated the hydration process of grains with sigmoidal behavior without affecting the grain starch, improving the extraction of undesirable components, enhancing or hindering the germination (depending on the grain), but without affecting the cooking process. Another result was that the higher the soaking water temperature is, the lower the ultrasound effect on hydration is. Finally, regarding nutrient incorporation, a hydrophilic nutrient (iron) was incorporated in a grain during hydration process demonstrating that it is possible. The iron incorporation had the same behavior as the water uptake, suggesting similar mechanisms and phenomena of mass flow. In addition, the incorporated iron was attached not only to the bean cotyledon, but also mostly in the seed coat. Furthermore, ultrasound technology enhanced this process. The cooking process of the studied grains was improved, and its germination was hindered by the incorporated iron. In conclusion, ultrasound technology can be used for improving the hydration process of grains with sigmoidal behavior, being also practical for nutrient incorporation into grains. / A presente Tese teve como objetivos estudar o processo de hidratação de grãos com comportamento sigmoidal de hidratação, avaliar a tecnologia de ultrassom para a sua melhora, os possíveis efeitos na germinação, cozimento e possível incorporação de nutrientes. O trabalho foi feito em três etapas. A primeira etapa consistiu em realizar uma prospecção de hidratação de diversos grãos, auxiliando na escolha dos futuros grãos a serem estudados. Ainda, comparou-se as cinéticas de hidratação associando-as com as propriedades intrínsecas dos grãos, avaliando diversas inferências publicadas sobre o processo. Na segunda etapa estudou-se o efeito do ultrassom de alta potência no processo de hidratação de três grãos com comportamento sigmoidal: tremoço andino, feijão moyashi e feijão branco. Também foi avaliado o efeito combinado do ultrassom e a temperatura da água de hidratação. O efeito da tecnologia de ultrassom foi avaliado na cinética de absorção de água, extração de compostos, germinação e cozimento. A terceira etapa consistiu em aproveitar o longo tempo do processo de hidratação para incorporar um nutriente hidrossolúvel dentro do grão. O ultrassom foi também usado para acelerar este processo. Os resultados mais importantes da Tese foram que se corroborou que a hidratação de grãos é um processo complexo e que há muita dificuldade em correlacionar as propriedades intrínsecas dos grãos com as características da hidratação. Ainda, foi demonstrado que o comportamento sigmoidal de hidratação é somente encontrado em grãos da família das leguminosas. Também foi demostrado que o ultrassom acelera a hidratação de grãos com comportamento sigmoidal e que esta tecnologia não afeta o amido dos grãos, melhora ou piora a germinação (dependendo do grão), e não afeta o cozimento. Corroborou-se que quanto maior a temperatura da água, menor é o efeito do ultrassom na cinética de hidratação. Finalmente, demonstrou-se que é possível incorporar nutrientes solúveis dentro dos grãos, aproveitando assim o longo tempo de hidratação. Encontrou-se que a incorporação de nutrientes segue mecanismo similar que a entrada de água, e que pode ser acelerado usando ultrassom. Também, foi demonstrado que o ferro foi incorporado no cotilédone e no tegumento (em maior quantidade), e que este composto melhora o cozimento do feijão, porém prejudica a sua germinação. Em conclusão, o ultrassom pode ser usado para melhorar o processo de hidratação de grãos e para a incorporação de algum nutriente.

Doctor en Ingeniería Eléctrica / La verificación de locutor (SV) por biometría de voz, se ha integrado en diversas aplicaciones como interfaz de comunicación entre personas y máquinas. Sin embargo, su principal inconveniente es enfrentar variabilidades o mismatch entre condiciones de entrenamiento y prueba. La robustez es la propiedad que le permite mantener su funcionamiento superando perturbaciones. En SV existe necesidad de extraer parámetros espectrales propios del locutor y robustos a ruido y a efectos de distorsión de canal. Varios métodos de extracción se inspiran en la fisiología periférica auditivo y en teorías de codificación neuronal de fibras del nervio auditivo (AN). El término periférico se utiliza para dar a entender aquella parte del sistema auditivo que es externo al sistema nervioso central (CNS). La salida del sistema auditivo periférico es la actividad del AN. A su vez, esta actividad es la entrada al CNS. Esta tesis aborda dos novedosos métodos inspirados en la periferia auditiva que contribuyen a la robustez de sistemas de SV, ante condiciones de mismatch por ruido aditivo y por variabilidad en el canal acústico de transmisión, en una tarea de reconocimiento de patrones acústicos: verificación de locutor de texto-independiente (TI-SV). El primero, es una función sigmoidal óptima, tasa-nivel, que es una componente de muchos modelos del sistema auditivo periférico. La optimización usa criterios definidos exclusivamente sobre la base de atributos físicos del sonido de entrada inspirados en evidencia fisiológica. Estos criterios, discriminan entre una señal de voz degradada, y ruido, para preservar la máxima cantidad de información en la región lineal de la curva sigmoidal y para minimizar la distorsión en regiones de saturación. El desempeño de la función sigmoidal se valida con experimentos de TI-SV, con señales degradadas por ruido aditivo a diferentes SNRs. Los resultados, comparados con el sistema baseline MFCC, muestran que el método propuesto, en combinación con normalización de varianza cepstral (CVN), conduce a reducciones relativas en EER, tan grandes como 40% en ciertos SNRs. A continuación, se presenta un nuevo conjunto de features, llamados Coeficientes Cepstrales Localmente-Normalizados (LNCCs), que se basan en el Detector de Sincronía Generalizada (GSD) de Stephanie Seneff. El método propuesto, motivado perceptualmente, permite normalizar en forma instantánea features de voz. La efectividad de los LNCCs se demuestra en una tarea de TI-SV a lo largo de una variedad de condiciones de tilt espectral en el canal acústico de transmisión. Los resultados, comparados con el sistema baseline MFCC y con MFCC+CMN, muestran que los LNCCs se caracterizan por requerir de baja complejidad computacional y por compensar más ampliamente el tilt espectral que los coeficientes MFCCs. Además, LNCCs no requieren el cálculo y almacenamiento de un promedio móvil de valores de features, proporcionando reducciones relativas en EER tan altas como 32% y 35% cuando se comparan con MFCC y MFCC+CMN, con tilt espectral variable, respectivamente. Es interesante destacar que los features LNCC pueden llegar a ser una alternativa a MFCC y MFCC+CMN, en cualquier situación donde es difícil estimar confiablemente la media cepstral. Ambas estrategias propuestas en esta tesis, comparadas con el sistema baseline MFCC, consiguen robustez del sistema TI-SV mejorando su desempeño frente a diversas condiciones de mismatch.

abstract: Pavement management systems and performance prediction modeling tools are essential for maintaining an efficient and cost effective roadway network. One indicator of pavement performance is the International Roughness Index (IRI), which is a measure of ride quality and also impacts road safety. Many transportation agencies use IRI to allocate annual maintenance and rehabilitation strategies to their road network. The objective of the work in this study was to develop a methodology to evaluate and predict pavement roughness over the pavement service life. Unlike previous studies, a unique aspect of this work was the use of non-linear mathematical function, sigmoidal growth function, to model the IRI data and provide agencies with the information needed for decision making in asset management and funding allocation. The analysis included data from two major databases (case studies): Long Term Pavement Performance (LTPP) and the Minnesota Department of Transportation MnROAD research program. Each case study analyzed periodic IRI measurements, which were used to develop the sigmoidal models. The analysis aimed to demonstrate several concepts; that the LTPP and MnROAD roughness data could be represented using the sigmoidal growth function, that periodic IRI measurements collected for road sections with similar characteristics could be processed to develop an IRI curve representing the pavement deterioration for this group, and that pavement deterioration using historical IRI data can provide insight on traffic loading, material, and climate effects. The results of the two case studies concluded that in general, pavement sections without drainage systems, narrower lanes, higher traffic, or measured in the outermost lane were observed to have more rapid deterioration trends than their counterparts. Overall, this study demonstrated that the sigmoidal growth function is a viable option for roughness deterioration modeling. This research not only to demonstrated how historical roughness can be modeled, but also how the same framework could be applied to other measures of pavement performance which deteriorate in a similar manner, including distress severity, present serviceability rating, and friction loss. These sigmoidal models are regarded to provide better understanding of particular pavement network deterioration, which in turn can provide value in asset management and resource allocation planning. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Civil Engineering 2016

Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foi determinada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 ?mol/mg proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 ?M e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 ?mol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 ?M e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana. / The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 ?mol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 ?M and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 ?mol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 ?M and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foi determinada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 ?mol/mg proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 ?M e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 ?mol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 ?M e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana. / The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 ?mol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 ?M and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 ?mol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 ?M and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RonaldoAA_TESE_parcial.pdf: 75168 bytes, checksum: a480f84f619eb88bf968f0a55bed0676 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / An important unsolved problem in medical science concerns the physical origin of the sigmoidal shape of pressure volume curves of healthy (and some unhealthy) lungs. Such difficulties are expected because the lung, which is the most important structure in the respiratory system, is extremely complex. Its rheological properties are unknown and seem to depend on phenomena occurring from the alveolar scale up to the thoracic scale. Conventional wisdom holds that linear response, i.e., Hooke s law, together with alveolar overdistention, play a dominant role in respiration, but such assumptions cannot explainthe crucial empirical sigmoidal shape of the curves. In this doctorate thesis, we propose an alternative theory to solve this problem, based on the alveolar recruitment together with the nonlinear elasticity of the alveoli. This theory suggests that recruitment may be the predominant factor shaping these curves in the entire range of pressures normally employed in experiments. The proposed model correctly predicts the observed sigmoidal pressure volume curves, allowing us to discuss adequately the importance of this result, as well as its implications for medical practice / Um importante problema n?o resolvido na ci?ncia m?dica diz respeito ? origem f?sica da forma sigmoidal das curvas press?o-volume de pulm?es saud?veis (e de alguns n?o saud?veis). Tais dificuldades s?o esperadas tendo em vista que o pulm?o, a mais importante estrutura do sistema respirat?rio, ? extremamente complexo. Suas propriedades reol?gicas s?o desconhecidas, e parecem depender dos fen?menos que ocorrem a partir da escala alveolar at? a escala tor?cica. O modelo cl?ssico diz que a resposta linear, ou seja, a lei de Hooke, juntamente com a superdistens?o alveolar desempenha um papel predominante na formata??o dessas curvas, mas tais pressupostos n?o podem explicar a crucial forma emp?rica sigmoidal das curvas P-V respirat?rias est?ticas. Nesta tese de doutorado propomos uma teoria alternativa para resolver este problema, baseada no recrutamento alveolar, juntamente com a hip?tese do comportamento el?stico n?o-linear dos alv?olos. Esta teoria sugere o recrutamento alveolar como o fator predominante que modela as curvas press?o-volume em um completo intervalo de press?o normalmente utilizado nas experi?ncias. O modelo proposto prediz corretamente a forma sigmoidal observada nas curvas press?o-volume, nos permitindo discutir adequadamente a import?ncia deste resultado, assim como as suas implica??es para a pr?tica m?dica