The current work entails the development of a novel high content platform for the measurement of kinetic ligand responses across cell signalling networks at the single-cell level in distinct PBMC subtypes ex vivo. Using automated sample preparation, fluorescent cellular barcoding and flow cytometry the platform is capable of detecting 21, 840 parallel cell signalling responses in each PBMC sample. We apply this platform to characterize the effects of neuropsychiatric treatments and CNS ligands on the T cell signalling repertoire. We apply it to define cell signalling network abnormalities in PBMCs from drug-naïve first-onset schizophrenia patients (n=12) relative to healthy controls (n=12) which are subsequently normalized in PBMCs from the same patients (n=10) after a six week course of clinical treatment with the atypical antipsychotic olanzapine. We then validate the abnormal cell signalling responses in PBMCs from an independent cohort of drug-naïve first-onset schizophrenia patients (n=25) relative to controls (n=25) and investigate the specificity of the abnormal PBMC responses in schizophrenia as compared to major depression (n=25), bipolar disorder (n=25) and autism spectrum disorder (n=25). Subsequently we conduct a phenotypic drug screen using the US Food and Drug Administration (FDA) approved compound library, in addition to experimental neuropsychiatric drug candidates and nutraceuticals, to identify compounds which selectively normalize the schizophrenia-associated cell signalling response. Finally these candidate compounds are characterized using structure-activity relationships to reveal specific chemical moieties implicated in the putative therapeutic effect.

Die lebenden Organismen sind für eine wissenschaftliche Analyse zu kompliziert, wenn man sie als Ganzes und in ihrer vollen Komplexität betrachtet. Die vorliegende Arbeit behandelt die topologischen Eigenschaften von zwei wichtigen Teilen der lebenden Organismen: die metabolischen und die regulatorischen Systeme. Topolgische Eigenschaften sind solche, die durch die Netwerkstruktur bedingt werden. Ein Signalsystem ist eine spezielle Art von regulatorischem System. Zwischen den metabolischen und Signalnetzen gibt es wichtige Unterschiede, die ihre Behandlung in unterschiedlicher Weise erfordert. In der metabolischen Pfadanalyse ist das Konzept der elementaren Flussmoden bereits als ein passendes Instrument für die Charakterisierung der einfachsten essentiellen Wege in biochemischen Systemen etabliert. Wir untersuchen die Eigenschaften und Vorteile dieses Konzepts in einigen besonderen Fällen. Zuerst untersuchen wir die vielfach vorkommenden Enzyme mit niedriger Spezifität (z.B. Nukleosiddiphosphokinase, Uridinkinase, Transketolase, Transaldolase). Sie können parallel verschiedene Substrate und Produkte umwandeln. Auch die Enzym-Mechanismen sind vielfältig, wie wir mit dem Reaktionsschema für bifunktionelle Enzyme veranschaulichen. Wir betrachten dabei nur den Fall, dass ein bestimmtes aktives Zentrum mehrere Reaktionen katalysiert. Der Fall, dass das studierte Enzym mehrere solche aktiven Zentren hat, kann in den Fall mehrerer Enzyme transformiert werden, die nur ein aktives Zentrum haben. Wenn eine Krankheit das Ausgangsenzym ändert, werden dann in der Analyse auch alle ersetzenden Enzyme geändert. Es gibt zwei unterschiedliche Betrachtungsweisen, um multifunktionelle Enzyme zu beschreiben. Zum einen kann man die Gesamtreaktionen betrachten und zum anderen die elementaren Reaktionsschritte (Hemireaktionen, Halbreaktionen). Für Enzyme mit zwei oder mehr Funktionen ist es wichtig, nur linear unabhängige Funktionen zu betrachten, weil sonst zyklische elementare Moden auftreten würden, die keine Nettoumwandlung durchführen. Jedoch ist die Wahl der linear unabhängigen Funktionen nicht a priori eindeutig. Wir stellen eine Methode für das Treffen dieser Wahl vor, indem wir die konvexe Basis des Hemireaktions-Systems betrachten. Eine formale Anwendung des Algorithmus für das Berechnen der elementaren Flussmoden (Routen) erbringt das Resultat, dass die Zahl solcher Moden manchmal vom Niveau der Beschreibung abhängt, wenn einige Reaktionen reversibel sind und die Produkte der multifunktionellen Enzyme externe Metabolite sind, oder einige multifunktionelle Enzyme zum Teil die gleichen Stoffwechselprodukte umwandeln. Jedoch kann dieses Problem durch eine geeignete Deutung der Definition der elementaren Moden und die korrekte Wahl der unabhängigen Funktionen der Multifunktionsenzyme gelöst werden. Die Analyse wird durch einige kleinere Beispiele und ein größeres biochemisches Beispiel veranschaulicht, das aus dem Nukleotidmetabolismus stammt und die zwei Arten der Beschreibung für Nukleosiddiphosphokinase und Adenylatekinase vergleicht. Der Nukleotidmetabolismus spielt eine wichtige Rolle in lebenden Organismen und ist gegenüber allen möglichen Störungen in seiner internen Balance sehr empfindlich. Gefährliche Krankheiten können auftreten, wenn einige Enzyme nicht richtig funktionieren. Mit Hilfe des Konzeptes des elementaren Flussmodus erklären wir das Auftreten und den Schweregrad von Krankheiten, die auf Enzymdefizienzen basieren. Wenn ein Enzym vollständig gehemmt wird, werden einige metabolische Wege blockiert. Wenn jedoch einige alternative Wege noch bestehen, ist die Krankheit weniger gefährlich. Unsere Analyse ist darauf gerichtet, alternative Wege, wesentliche Enzyme und solche Enzyme, die immer zusammenarbeiten zu finden. Der letzte Begriff ist auch als "Enzyme subset" bekannt und stellt einen intermediären Schritt im Algorithmus zur Berechnung der elementaren Flussmoden dar. Wir diskutieren bereits bekannte und bisher nur hypothetische Mechanismen einiger Krankheiten (proliferative Krankheiten, Immundefizienzen), die auf Störungen des Nukleotidmetabolismus oder seiner Ausbeutung durch Viren und Parasiten beruhen. Die meisten Strategien, die für das Bekämpfen solcher Krankheiten eingesetzt werden, basieren auf der Unterbrechung des Nukleotidmetabolismus an bestimmten Stellen. Diese Strategien können aber auch zur Akkumulation toxischer Stoffe führen und dadurch Nebenwirkungen hervorrufen. Deswegen hilft ein besseres Verständnis dieses Systems, wirkungsvollere Medikamente zu entwickeln, und eine gute strukturelle Analyse kann viele experimentelle Bemühungen ersparen. Konzepte aus der Theorie der Petri-Netze liefern zusätzliche Werkzeuge für das Modellieren metabolischer Netzwerke. In Kapitel 4 werden die ähnlichkeiten zwischen einigen Konzepten in der traditionellen biochemischen Modellierung und analogen Konzepten aus der Petri-Netztheorie besprochen. Zum Beispiel entspricht die stochiometrische Matrix eines metabolischen Netzwerkes der Inzidenzmatrix des Petri-Netzes. Die Flussmoden und die Erhaltungs-Relationen haben die T-Invarianten beziehungsweise P-Invarianten als Gegenstücke. Wir decken die biologische Bedeutung einiger weiterer Begriffe aus der Theorie der Petri-Netze auf, nämlich "traps", "{siphons", "deadlocks" und "Lebendigkeit". Wir konzentrieren uns auf der topologischen Analyse anstatt auf die Analyse des dynamischen Verhaltens. Die geeignete Behandlung der externen Stoffwechselprodukte wird ebenfalls besprochen. Zur Illustration werden einige einfache theoretische Beispiele vorgestellt. Außerdem werden einige Petri-Netze präsentiert, die konkreten biochemischen Netzen entsprechen, um unsere Resultate zu belegen. Zum Beispiel wird die Rolle der Triosephosphatisomerase (TPI) im Metabolismus von Trypanosoma brucei ausgewertet, indem "traps" und "siphons" ermittelt werden. Alle behandelten Eigenschaften von Petri-Netzen werden anhand eines Systems illustriert, das aus dem Nukleotidmetabolismus stammt. Während viele Bemühungen für das Zerlegen metabolischer Systeme, (elementare Flußmoden, extreme Wege) erfolgt sind, sind bisher unseres Wissens keine Versuche in dieser Richtung für Signalübertragungssysteme unternommen worden. Eine spezielle Eigenschaft von Signalnetzwerken in lebenden Zellen ist, dass Aktivierungen, Hemmungen und biochemische Reaktionen normalerweise gleichzeitig anwesend sind. Selbst wenn sie nicht Reaktionen enthalten, machen Mehrfach-Aktivierungen oder Mehrfach-Hemmungen die Netzwerke in hohem Grade verzweigt. Es ist eine schwierige und sehr zeitraubende Aufgabe, alle Faktoren, die einen Einfluss auf ein gegebenes Ziel haben, ohne eine automatische Methode zu ermitteln. Bereits in Kapitel 1 heben wir die ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den metabolischen und Signal-Netzwerken hervor. In Kapitel 5 errichten wir einen Rahmen und präsentieren einen Algorithmus für die Zerlegung von Signalnetzwerken in kleinere Einheiten, die einfacher zu studieren und zu verstehen sind. Zwei Fälle werden untersucht: ein einfacheres, wenn nur monomolekulare Aktivierungen oder Reaktionen anwesend sind, und ein komplizierterer Fall, wenn die Aktivierungen und die Reaktionen multimolekular sein können. Ihre Beschreibung erfordert unterschiedliche Methoden: klassische Graphen bzw. Petrinetze. Wir besprechen die Probleme, die in unserem Modell wegen des Vorhandenseins von Hemmungen oder von unbekannten Effekten im Netz auftreten. Der vorgeschlagene Algorithmus ermittelt die Faktoren, die zusammenwirken und die Zielsubstanzen, die auf dem gleichen Weg beeinflusst werden. Die Zyklen, die im System auftreten, und mögliche fehlende Reaktionen werden ebenfalls ermittelt . Theoretische Beispiele veranschaulichen unsere Resultate. Anhand der T-Zell-Antigen-Rezeptor-Signalkaskade zeigen wir, wie die Methoden in realen Systemen angewendet werden können. / The living organisms are too complex when considering them as a whole. The present thesis deals with the topological properties of two important parts of living organisms: the metabolic and the regulatory systems. The topological properties are those features that are determined by the network structure. A classification in metabolic and regulatory systems is often used. A signalling system is a special kind of regulatory system. Between metabolic and signalling networks, there are important differences that impose their treatment in different ways. In metabolic pathway analysis, the elementary flux mode concept is already established as a proper tool for identifying the smallest essential routes in biochemical systems. We examine its features and advantages in some particular cases. Firstly, many enzymes operate with low specificity (e.g. nucleoside diphosphokinase, uridine kinase, transketolase, transaldolase), so that various substrates and products can be converted. Also the enzymatic mechanisms are diverse, as we have illustrated with reaction schemes for bifunctional enzymes. Therefore, there are two different approaches to describe multifunctional enzymes (We considered only the case when a certain active site hosts several reactions. The case when the studied enzyme has several such active sites can be transformed into that of several enzymes having only one active site. If a disease alters the initial enzyme, also all substituting enzymes are altered.): in terms of overall reactions and in terms of reactions steps (hemi-reactions, half-reactions). For enzymes with two or more functions, it is important to consider only linearly independent functions, because otherwise cyclic elementary modes would occur which do not perform any net transformation. However, the choice of linearly independent functions is not a priori unique. In Chapter 2, we give a method for making this choice unique by considering the convex basis of the hemi-reactions system. The set of linearly independent functions provided by our algorithm coincides, in the case of transketolase in pentose phosphate pathway, with the set of linearly independent functions mentioned in literature. A formal application of the algorithm for computing elementary flux modes (pathways) yields the result that the number of such modes sometimes depends on the level of description if some reactions are reversible and the products of the multifunctional enzymes are external metabolites or some multifunctional enzymes partly share the same metabolites. However, this problem can be solved by appropriate interpretation of the definition of elementary modes and the correct choice of independent functions of multifunctional enzymes. The analysis is illustrated by a biochemical example taken from nucleotide metabolism, comparing the two ways of description for nucleoside diphosphokinase and adenylate kinase, and by several smaller examples. The nucleotide metabolism plays an important role in living organisms and is very sensitive to any perturbations in its internal balance. Dangerous diseases may occur if some enzymes do not work properly. With the help of elementary flux mode concept, we explain the occurrence and severity of diseases based on enzyme deficiencies. If an enzyme is completely inhibited, some metabolic routes are blocked. If, however, some alternative routes still exist, the disease is less dangerous. In Chapter 3, we focus on finding alternative routes, essential enzymes and enzymes operating together. The latter notion is also known as ,,enzyme subset`` and represents an intermediary step in calculating the elementary flux modes. The known or hypothesised mechanisms of several disorders, occurred due to the malfunctioning of nucleotide metabolism (proliferative diseases, immunodeficiency diseases) or due to its hijacking by viruses and parasites, are given. Most strategies adopted for curing such diseases are based on nucleotide metabolism interruption. Therefore, a better understanding of this system helps developing more effective drugs and a good structural analysis can spare many experimental efforts. Petri net concepts provide additional tools for the modelling of metabolic networks. In Chapter 4, the similarities between the counterparts in traditional biochemical modelling and Petri net theory are discussed. For example, the stoichiometry matrix of a metabolic network corresponds to the incidence matrix of the Petri net. The flux modes and conservation relations have the T-invariants, respectively, P-invariants as counterparts. We reveal the biological meaning of some notions specific to the Petri net framework (traps, siphons, deadlocks, liveness). We focus on the topological analysis rather than on the analysis of the dynamic behaviour. The treatment of external metabolites is discussed. Some simple theoretical examples are presented for illustration. Also the Petri nets corresponding to some biochemical networks are built to support our results. For example, the role of triose phosphate isomerase (TPI) in Trypanosoma brucei metabolism is evaluated by detecting siphons and traps. All Petri net properties treated in above-mentioned chapter (4) are exemplified on a system extracted from nucleotide metabolism. While for decomposing metabolic systems, many efforts have been done (elementary flux modes, convex basis, extreme pathways), for signalling maps, as far as we know, no attempt in this direction has been made. A special characteristic of signalling networks is that activations, inhibitions, and biochemical reactions are normally present in parallel. Even if they do not contain reactions, multi-part activations or inhibitions make them highly branched. To detect all factors that have an influence on a given target, without using an automatic method, is a difficult and very time-consuming effort. Already in Chapter 1 (Backgrounds), we highlight the similarities and differences between metabolic and signalling networks. In Chapter 5, we build a framework and algorithm for decomposing signalling networks in smaller units, which are easier to study and understand. Two cases are investigated: a simpler one, when only monomolecular activations or reactions are present, and a more complex case, when the activations and reactions can be multimolecular. Their description requires different instruments: classical graphs and Petri nets, respectively. We discuss the problems that occur in our model due to the presence of some inhibitions or unknown effects in the network. The algorithm that we propose detects the factors that are acting together and the targets that are affected on the same route. The cycles that occur in the system are also highlighted. We point out possible missing reactions. Theoretical examples illustrate out findings. Using the T cell antigen-receptor signalling cascade, we show how it can be applied to real systems.