abstract: Obtaining local electrochemical (EC) information is extremely important for understanding basic surface reactions, and for many applications. Scanning electrochemical microscopy (SECM) can obtain local EC information by scanning a microelectrode across the surface. Although powerful, SECM is slow, the scanning microelectrode may perturb reaction and the measured signal decreases with the size of microelectrode. This thesis demonstrates a new imaging technique based on a principle that is completely different from the conventional EC detection technologies. The technique, referred to as plasmonic-based electrochemical imaging (PECI), images local EC current (both faradaic and non-faradaic) without using a scanning microelectrode. Because PECI response is an optical signal originated from surface plasmon resonance (SPR), PECI is fast and non-invasive and its signal is proportional to incident light intensity, thus does not decrease with the area of interest. A complete theory is developed in this thesis work to describe the relationship between EC current and PECI signal. EC current imaging at various fixed potentials and local cyclic voltammetry methods are developed and demonstrated with real samples. Fast imaging rate (up to 100,000 frames per second) with 0.2×3µm spatial resolution and 0.3 pA detection limit have been achieved. Several PECI applications have been developed to demonstrate the unique strengths of the new imaging technology. For example, trace particles in fingerprint is detected by PECI, a capability that cannot be achieved with the conventional EC technologies. Another example is PECI imaging of EC reaction and interfacial impedance of graphene of different thicknesses. In addition, local square wave voltammetry capability is demonstrated and applied to study local catalytic current of platinum nanoparticle microarray. This thesis also describes a related but different research project that develops a new method to measure surface charge densities of SPR sensor chips, and micro- and nano-particles. A third project of this thesis is to develop a method to expand the conventional SPR detection and imaging technology by including a waveguide mode. This innovation creates a sensitive detection of bulk index of refraction, which overcomes the limitation that the conventional SPR can probe only changes near the sensor surface within ~200 nm. / Dissertation/Thesis / Video for Figure 3.2 C to H / Video for Figure 3.5 / Video for Figure 5.5 / Video for Figure 6.7 / Video for Figure 6.11 / Ph.D. Electrical Engineering 2011

Les adhérences focales (AF), structures adhésives reliant la cellule à la matrice extra-cellulaire (MEC), constituent de véritables plateformes de signalisation biochimique et mécanique qui contrôlent l'adhérence, la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Les récepteurs transmembranaires intégrines sont au coeur des AF, où elles connectent la MEC au cytosquelette d'actine. Au début des années 2000, la protéine intracellulaire taline, qui se lie aux parties cytoplasmiques bêta des intégrines, était considérée comme le principal activateur des intégrines. Néanmoins, il a depuis été montré que la kindline, autre protéine intracellulaire se liant aux parties bêta cytoplasmiques, jouait également un rôle essentiel dans l'activation des intégrines. Ainsi,plusieurs études ont mis en évidence que la kindline et la taline étaient complémentaires et avaient une action synergique durant l'activation des intégrines. Les bases moléculaires de ces phénomènes restent à déterminer. De plus, la plupart des données sur lerôle de la kindline dans l'adhérence et l'activation des intégrines provient d'expériences menées sur des cellules en suspension et/ou avec l'intégrine plaquettaire αIIbβ3. Ainsi, la régulation de ces processus par la kindline dans les cellules adhérentes est encore peu comprise. Dans cette étude, nous combinons la microscopie PALM et le suivi de protéines individuelles pour révéler le rôle et le comportement de la kindline à l'intérieur et à l'extérieur des AF au cours des événements moléculaires clés se déroulant au niveau de la membrane plasmique, et qui mènent à l'activation des intégrines. Nous avons observé que les intégrines bêta1 etbêta3 portant une mutation ponctuelle inhibant l'interaction avec la kindline montrent un défaut d'immobilisation dans les AF. Nous avons également observé que la kindline-2, qui est enrichie dans les AF, diffusait librement au niveau de la membrane plasmique,à l'intérieur et à l'extérieur des AF. Ceci constitue une distinction majeure par rapport à la taline, qui, au niveau de la membrane plasmique, est essentiellement observée dans les AF où elle est immobile, montrant qu'elle est recrutée dans les AF directement depuis le cytosol sans diffusion latérale membranaire (Rossier et al. 2012). Afin d'identifier les bases moléculaires du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline, nous avons utilisé différents variants mutés de kindline précédemment décrits. Le mutant kindline-2-QW614/615AA (liaison aux intégrines inhibée) montre une diffusion membranaire accrue, ce qui suggère que la kindline peut diffuser au niveau de la membrane plasmique sans être associée aux intégrines. Par ailleurs, la baisse d'immobilisation au niveau des AF observée avec ce mutant montre qu'une partie de l'immobilisation de la kindline est due aux intégrines, suggérant l'existence d'un complexe intégrine-kindline immobile dans les AF. La délétion du domaine PleckstrinHomology (PH) de la kindline diminue considérablement son recrutement et sa diffusion membranaire. Nous avons évalué le rôle fonctionnel du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline en réexprimant ces mutants dans des cellules déplétéesen kindline-1 et -2 (cellules KO kindline-1 -/-, kindline-2 -/-). Ces expériences montrent que le recrutement et la diffusion membranaire de la kindline sont cruciaux pour l'activation des intégrines durant l'étalement cellulaire et favorisent la formation d’adhérences. Cela suggère que la kindline utilise un chemin différent de celui de la taline pour atteindre et activer les intégrines,ce qui pourrait expliquer au niveau moléculaire comment la kindline complémente la taline durant l'activation des intégrines. / Focal adhesions (FAs) are adhesive structures linking the cell to the extracellular matrix (ECM) and constitute molecular platforms for biochemical and mechanical signals controlling cell adhesion, migration, differentiation and survival. Integrin transmembrane receptors are core components of FAs, connecting the ECM to the actin cytoskeleton. During the early 2000s, the intracellular protein talin, which directly binds to the cytoplasmic tail of β-integrins, was considered as the main integrin activator. Nevertheless, it has been shown that kindlin, another intracellular protein that bind to β-integrin, is also a critical integrin activator. In fact, several studies have shown that kindlin and talin play complementary and synergistic roles during integrin activation. The molecular basis of these phenomena remains to determine. Moreover, most studies focusing on the role of kindlin during integrin activation and cell adhesion have been performed with suspended cells and/or with the platelet integrin αIIbβ3. Here we combined PALM microscopy with single protein tracking to decipher the role and behavior of kindlin during key molecular events occurring outside and inside FAs at the plasma membrane and leading to integrin activation, as we have done previously for talin (Rossier et al., 2012). We found that beta1 and beta3-integrins with a point mutation inhibiting binding to kindlin show reduced immobilization inside FAs. We also found that kindlin-2, which is enriched inside FAs, displayed free diffusion at the plasma membrane outside and inside FAs. This constitutes a major difference with talin, which, at the plasma membrane level, is observed almost exclusively in FAs, where it is immobile, which shows that talin is recruited into FAs directly from the cytosol without lateral diffusion along the plasma membrane (Rossier et al. 2012). To determine the molecular basis of kindlin membrane recruitment and diffusion, we used a kindlin variant known to decrease binding to integrins (kindlin-2- QW614/615AA). This mutant displayed increased membrane diffusion, suggesting that kindlin-2 can freely diffuse at the plasma membrane without interacting with integrins. Moreover, the kindlin-2-QW mutant showed decreased immobilization inside FA, showing that part of kindlin immobilization depends on interaction with integrins. This suggests that kindlin can form an immobile complex with integrins inside focal adhesions. Deletion of the kindlin pleckstrin homology (PH) domain strongly reduced the membrane recruitment and diffusion of kindlin. We assessed the functional role of kindlin membrane recruitment and diffusion by re-expressing different kindlin-2 mutants in kindlin-1/kindlin-2 double KO cells. Those experiments demonstrated that kindlin-2 membrane recruitment and diffusion are crucial for integrin activation during cell spreading and favor adhesion formation. This suggests that kindlin uses a different route from talin to reach integrins and trigger their activation, providing a possible molecular basis for their complementarity during integrin activation.

The overall structure of photosynthetic pigment-protein complexes and thylakoid membranes of various photosynthetic organisms was studied using electron microscopy.

Les méthodes de microscopie de super-résolution (SRM) telles que la microscopie PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), BALM (binding-activated localization microscopy) et le DNA-PAINT, représentent un nouvel ensemble de techniques de microscopie optique qui permettent de surpasser la limite de diffraction ( > 200 nm dans le spectre visible). Ces méthodes sont basées sur la localisation de la fluorescence de molécules uniques, et peuvent atteindre des résolutions de l'ordre du nanomètres (~20 nm latéralement et 50 nm axialement). Les techniques SRM ont un large spectre d'applications dans les domaines de la biologie et de la biophysique, rendant possible l'accès à l'information tant dynamique que structurale de structures connues ou non, in vivo et in vitro. Beaucoup d'efforts ont été fournis durant la dernière décennie afin d'élargir le potentiel de ces méthodes en développant des méthodes de localisation à la fois plus précise et plus rapide, d'améliorer la photophysique des fluorophores, de développer des algorithmes pour obtenir une information quantitative et augmenter la précision de localisation, etc. Cependant, très peu de méthodes ont été développées pour examiner l'hétérogénéité des images et extraire les informations statistiquement pertinent à partir de plusieurs milliers d'images individuelles super-résolues. Dans mon travail de thèse, je me suis spécifiquement attaquée à ces limitations en: (1) construisant des objets de dimensions nanométriques et de structures bien définies, avec la possibilité d'être adaptés aux besoins. Ces objets sont basés sur les origamis d'ADN. (2) développant des approches de marquage afin d'acquérir des images homogènes de ces objets. (3) implémentant des outils statistiques dans le but d'améliorer l'analyse et la validation d'images. Ces outils se basent sur des méthodes de reconstruction de molécules uniques communément appliquées aux reconstructions d'images de microscopie électronique. J'ai spécifiquement appliqué ces développements à la reconstruction de formes 3D de deux origamis d'ADN modèles (en une et trois dimensions). Je montre comment ces méthodes permettent la dissection de l'hétérogénéité de l'échantillon, et la combinaison d'images similaires afin d'améliorer le rapport signal sur bruit. La combinaison de différentes classes moyennes ont permis la reconstruction des formes tridimensionnelles des origamis d'ADN. Particulièrement, car cette méthode utilise la projection 2D de différentes vues d'une même structure, elle permet la récupération de résolutions isotropes en trois dimensions. Des fonctions spécifiques ont été adaptées à partir de méthodologies existantes afin de quantifier la fiabilité des reconstructions et de leur résolution. A l'avenir, ces développements seront utiles pour la reconstruction 3D de tous types d'objets biologiques pouvant être observés à haute résolution par des méthodologies dérivées de PALM, STORM ou PAINT. / Super resolution microscopy (SRM) methods such as photoactivated localization microscopy (PALM), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), binding-activated localization microscopy (BALM) and DNA-PAINT represent a new collection of light microscopy techniques that allow to overpass the diffraction limit barrier ( > 200 nm in the visible spectrum). These methods are based on the localization of bursts of fluorescence from single fluorophores, and can reach nanometer resolutions (~20 nm in lateral and 50 nm in axial direction, respectively). SRM techniques have a broad spectrum of applications in the field of biology and biophysics, allowing access to structural and dynamical information of known and unknown biological structures in vivo and in vitro. Many efforts have been made over the last decade to increase the potential of these methods by developing more precise and faster localization techniques, to improve fluorophore photophysics, to develop algorithms to obtain quantitative information and increase localization precision, etc. However, very few methods have been developed to dissect image heterogeneity and to extract statistically relevant information from thousands of individual super-resolved images. In my thesis, I specifically tackled these limitations by: (1) constructing objects with nanometer dimensions and well-defined structures with the possibility of be tailored to any need. These objects are based on DNA origami. (2) developing labeling approaches to homogeneously image these objects. These approaches are based on adaptations of BALM and DNA-PAINT microscopies. (3) implemented statistical tools to improve image analysis and validation. These tools are based on single-particle reconstruction methods commonly applied to image reconstruction in electron microscopy.I specifically applied these developments to reconstruct the 3D shape of two model DNA origami (in one and three dimensions). I show how this method permits the dissection of sample heterogeneity, and the combination of similar images in order to improve the signal-to-noise ratio. The combination of different average classes permitted the reconstruction of the three dimensional shape of DNA origami. Notably, because this method uses the 2D projections of different views of the same structure, it permits the recovery of isotropic resolutions in three dimensions. Specific functions were adapted from previous methodologies to quantify the reliability of the reconstructions and their resolution.In future, these developments will be helpful for the 3D reconstruction of any biological object that can be imaged at super resolution by PALM, STORM or PAINT-derived methodologies.

Cette thèse est dédiée à l'analyse de signaux électriques quantiques dans les canaux de bords de l'effet Hall quantique. En particulier, j'ai utilisé l'analogue électronique de l'interféromètre de Hong, Ou et Mandel pour réaliser des expériences d'interférométrie à deux particules. En entrée de l'interféromètre sont placées des sources d'électrons uniques qui permettent l'injection contrôlée d'excitation ne contenant qu'une seule particule. Les canaux de bords guident ces excitations jusqu'à l'interféromètre. Il s'agit d'un contact ponctuel quantique qui agit comme une lame semi-réfléchissante pour les électrons. On mesure en sortie les fluctuations basse fréquence du courant. Cela nous permet de mesurer le recouvrement entre les fonctions d'onde à un électron émises à chaque entrée. Grâce à cette mesure de recouvrement, j'ai pu caractériser à des échelles de temps sub-nanoseconde, le rôle des interactions Coulombienne sur la propagation de l'électron unique. J'ai pu montrer que ces interactions étaient la source principale de la décohérence du paquet d'onde mono-électronique et qu'elles décomposent l'électron sur des modes collectifs. C'est une manifestation de la fractionalisation de l'électron qui apparaît dans les systèmes uni-dimensionnel en interactions. Grâce à cet interféromètre, j'ai pu aussi implémenter un protocole de tomographie qui permet de reconstruire toute les informations à une particule de n'importe quel signal émis dans le canal de bord. / This thesis is dedicated to processing of quantum electronic signals in the edge channels of the integer quantum Hall effect. In particular, I used the electronic analogue of the Hong, Ou and Mandel interferometer to realize two particle interference measurements. The interferometer consists of a quantum point contact (QPC) that acts as an electronic beam-splitter. The inputs are fed by single electron sources whose single particle excitations are guided toward the QPC by quantum Hall edge channels. We measure low frequency current noise in one of the output to measure overlaps of first order coherence functions. With this interferometer I could characterize on short time scales the role of Coulomb interactions on single electron propagation. I could show that interactions are the main source of decoherence of the single particle wave packet and that the electron decomposes into collective modes. This is due to fractionalisation which is a hallmark of interacting unidimensional systems. Thanks to this interferometer I could also implement a universal tomography protocol to dissect all single particle information of any arbitrary current. This enables the study of non-classical propagating state.

L’effet photothermique permet de détecter efficacement des nanoparticules d’or avec un microscope en champ lointain grâce à leur forte absorption de la lumière. L’absence de problème photophysique fait des nanoparticules d’or une alternative au marquage de biomolécules par des sondes fluorescentes. La méthode PhACS (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) utilise les fluctuations de signal photothermique dues au passage de nanoparticules dans le volume de détection pour étudier leur diffusion. Cette méthode permet également la mesure précise de diamètres hydrodynamiques de nanoparticules fonctionnalisées. La méthode SNaPT (Single Nano-Particle Tracking) réalise le suivi bidimensionnel de nanoparticules individuelles grâce à une localisation effectuée par triangulation. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier la diffusion des intégrines alphaV-beta3 marquées par des nanoparticules d’or de 5 nm dans les adhérences focales, points d’ancrage entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire. Nous observons que ces intégrines ont tendance à former des agrégats qui alternent entre un mouvement diffusif et un mouvement confiné. Ce résultat appelle maintenant à un nouveau modèle où nous aurions une redistribution continue des intégrines au sein des adhérences focales. / Gold nanoparticles may be detected with optical far-field microscopy by use of the photothermal effect due to their strong light absorbance. With no photophysic issues, gold nanoparticles are an alternative to fluorescent probes for use in biological systems. The PhACS method (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) is used to study diffusion by measuring the autocorrelation of photothermal signal fluctuations due to nanoparticles passing through the detection volume. This method is sensitive enough to mesure the precise hydrodynamic diameter of functionalised nanoparticles. The SnaPT method (Single Nano-Particle Tracking) can track 2-dimensional motion of individual nanoparticles by pinpointing the localization with a triangulation method. The SNaPT method was used to study motion of alphaV-beta3 integrins that were bound to a 5 nm gold nanoparticle inside focal adhesion, where the cell cytoskeleton is linked to the extracullular matrix. The integrin was found to organize into clusters oscillating between the bound and diffuse states. These observations require new working models where integrins would be constantly redistributed.

La compréhension fondamentale de fonctions biologiques est accordée par l’imagerie de molécules uniques dans les cellules vivantes. Cet environnement nanoscopique est compliqué et largement mal compris. La microscopie de localisation permet cet environnement d’être sondé avec le suivi de molécules uniques. Depuis longtemps, l’obstacle principal qui empêcher la compréhension de processus physiques à cette échelle était la pénurie d’information accessible; de fortes hypothèses ne peuvent pas être établies à partir de quelques dizaines de trajectoires de molécules uniques. L’introduction des techniques de suivi de molécules à haute densité a recadré les possibilités. Dans cette thèse, les outils d’inférence Bayesienne ont été développé pour élucider le comportement de molécules uniques à partir la cartographie de leurs paramètres physiques de mouvement. Ces cartes décrivent, entre autre, les hétérogénéités aux échelles locales mais aussi à l’échelle de la cellule entière. Notamment elles dévoilent les détails quantitatifs sur les processus cellulaires de base. En utilisant cette approche cartographique, les interactions entre récepteurs et protéines d’échafaudage chez les neurones et les cellules non-neuronales sont étudiés. Une étude sur les interactions imprimées dans la cellule est également effectuée grace à un système prometteur d’impression de protéine. Les différents types d’interactions entre constructions chimériques du récepteur de glycine et de protéines d’échafaudage de géphyrine sont décrits et distingué in situ. Enfin, les perspectives vis-à-vis l’obtention de cartes tridimensionnelles de dynamiques de molécules uniques sont également commentées. / Imaging of single molecules inside living cells confers insight to biological function at its most granular level. Single molecules experience a nanoscopic environment that is complicated, and in general, poorly understood. The modality of choice for probing this environment is live-cell localisation microscopy, where trajectories of single molecules can be captured. For many years, the great stumbling block in comprehension of physical processes at this scale was the lack of information accessible; statistical significance and robust assertions are hardly possible from a few dozen trajectories. It is the onset of high-density single-particle tracking that has dramatically reframed the possibilities of such studies. Importantly, the consequential amounts of data it provides invites the use of powerful statistical tools that assign probabilistic descriptions to experimental observations. In this thesis, Bayesian inference tools have been developed to elucidate the behaviour of single molecules via the mapping of motion parameters. As a readout, maps describe heterogeneities at local and whole-cell scales. Importantly, they grant quantitative details into basic cellular processes. This thesis uses the mapping approach to study receptor-scaffold interactions inside neurons and non-neuronal cells. A promising system in which interactions are patterned is also examined. It is shown that interactions of different types of chimeric glycine receptors to the gephyrin scaffold protein may be described and distinguished in situ. Finally, the prospects of whole-cell mapping in three-dimensions are evaluated based on a discussion of state-of-the-art volumetric microscopy techniques.

La diffusion latérale des lipides et des protéines transmembranaires est essentielle pour les fonctions biologiques. Dans le contexte cellulaire, la fraction surfacique des protéines membranaires est élevée, atteignant environ de 50 à 70% selon le type de membrane. La diffusion se fait donc dans un milieu très encombré. Le but de ce travail est d'étudier in vitro l'effet de l'encombrement des protéines sur la diffusion des protéines et des lipides. Jusqu'à présent, les mesures de diffusion latérale ont généralement été réalisées à faible densité de protéines, et l'effet de l'encombrement des inclusions membranaires ou des protéines membranaires a été peu étudié expérimentalement. Nous avons utilisé une méthode de suivi de particules uniques (SPT) pour suivre les trajectoires de la pompe à protons Bactériorhodopsine (BR) et de lipides marqués avec des quantum dots au bas de vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en fonction de la fraction de surface totale (Ф) de BR reconstituée dans la membrane constituée par ailleurs de 1,2-Dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC). / Lateral diffusion of lipids and transmembrane proteins is essential for biological functions. In the cellular context, the surface fraction of membrane proteins is high, reaching approximately 50 to 70% depending on the membrane type. Therefore, diffusion occurs in a very crowded environment. The aim of this work is to study in vitro the effect of protein crowding on their own diffusion and on those of the surrounding lipids. So far, lateral diffusion measurements generally have been carried out at low protein density, and the effect of proteins crowding has not been much studied experimentally. We used a single particle tracking (SPT) method to track the trajectories of the Bacterorhodopsin (BR) proton pump and of lipids labeled with quantum dots at the bottom of giant unilamellar vesicles (GUVs) as a function of the total surface fraction (Ф) of BR reconstituted in 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) membrane.

Two rich and vibrant fields of investigation - graphene and plasmonics - strongly overlap in this work, giving rise to a novel hybrid photodetection device. The intrinsic photoresponse of graphene is significantly enhanced by placing the gold nanorods exhibiting unique anisotropic localized surface plasmon resonances on the graphene surface. The reported enhanced photoresponse of graphene is caused by the redistribution of localized surface plasmons in the nanoparticles into graphene. The exact underlying energy redistribution mechanism is thoroughly studied by a single particle scattering spectroscopy monitoring the particle plasmon linewidth as a function of the number of underlaying graphene layers. The obtained extraordinary plasmon broadening for nanoparticles placed on graphene suggests the contribution of a novel energy redistribution channel attributed to the injection of hot electrons from gold nanorods into graphene.

This thesis addresses the observed fluorescence intermittency of single semiconductor nanocrystals, so called Quantum Dots (QDs), which is also referred to as blinking. Despite continuous excitation their fluorescence is randomly interrupted by dark periods that can last over several minutes. Especially the extraction of power law dwell time statistics in bright and dark states indicates very complex underlying processes that are not fully understood to date. Here two approaches are followed to reveal the nature of the blinking mechanism. One addresses the common threshold method for extraction of power law dwell times. Its performance is tested with simulations to a broad range of experimentally determined parameters. Strong deviations are found between input and extracted statistics dependent on input parameters themselves. A comparison with experimental data does not support the assignment of power law statistics for the bright state and indicates the existence of distinct blinking mechanisms. The second approach directly aims at the nature of the dark state, which is mostly attributed to charges in the QD or trap states in its vicinity. A method is developed to detect charging processes on single QDs with their fluorescence. Electrochemistry is combined with confocal microscopy also allowing evaluations of excited state lifetimes and emission spectra. Reduction and oxidation of the QD bands are successfully observed as a quenching of QD fluorescence. Single QD observations identify two independent blinking mechanisms, that are assigned to positive and negative charging. Positive charging is not only observed after hole injection but also the extraction of excited electrons. Three additional quenching mechanisms are identified, two of which are assigned to trap relaxation. Differences between two substrate electrodes demonstrate the importance of the substrate material.