Le suivi de molécules uniques est utile pour comprendre le déroulement d'un processus biologique.<br />Il permet de sonder des propriétés dynamiques inaccessibles pas des mesures d'ensemble.<br />Nous présentons les nanocristaux semiconducteurs et montrons qu'ils permettent de combiner<br />les avantages des autres marqueurs fluorescents avec une grande photostabilité et un très bon rapport<br />signal à bruit.<br />Nous exposons une approche de suivi automatique dédiée à ces nano-objets scintillants. Nous<br />discutons les méthodes spécifiquement adaptées à l'analyse des trajectoires ainsi obtenues.<br />Nous appliquons ces techniques d'imagerie ultrasensible à l'étude de la dynamique membranaire<br />du récepteur de la glycine (RGly) dans les milieux vivants. Nous présentons une étude sur<br />l'implication du cytosquelette dans la régulation du nombre de RGly aux synapses. Nous examinons<br />les interactions entre le RGly et la géphyrine (sa protéine d'ancrage) dans des systèmes cellulaires<br />modèles et caractérisons l'équilibre correspondant.

Le travail de cette thèse a été consacré au développement d’un nouvelle technique SELFI (pour self-interferences, auto-interférences en anglais). Cette méthode permet d’obtenir une localisation tridimensionnelle d’émetteurs fluorescents individuels. Nous avons démontré que cela permet l'imagerie super-résolue en 3D et le suivie 3D de molécules uniques en profondeur dans des échantillons biologiques denses et complexes. La technique SELFI se base sur l'utilisation des interférences auto-référencées (également appelées « auto-interférences ») pour remonter à la localisation 3D d’un émetteur en une seule mesure. Ces interférences sont générées via l’utilisation d'un réseau de diffraction placé en sortie du microscope de fluorescence : le signal de fluorescence diffracte sur le réseau et les ordres interfèrent, après une courte propagation, sur le détecteur. Les interférences ainsi formées sont décodées numériquement pour remonter à la localisation 3D d'une molécule fluorescente au sein de l'échantillon. Une molécule unique peut ainsi être localisée avec une précision d'une dizaine de nanomètre, et cela jusqu'à une profondeur d'au moins 50µm au sein d'un échantillon biologique vivant épais (par exemple un tissu biologique).En combinant la méthode SELFI à différentes techniques de super-résolution (PALM, dSTORM et uPAINT), nous montrons que cette méthode de localisation tridimensionnelle permet de retrouver la hiérarchie et l'organisation de protéines dans des objets biologiques. En effectuant du SELFI-PALM, nous avons pu observer différentes protéines des points focaux d’adhésion (talin-C terminale et paxiline) et retrouver les différences de hauteur attendues, et ceux sur des échantillons de cellules vivantes. Ces résultats confirment la résolution accessible avec la technique SELFI (environ 25nm) même pour un faible nombre de photons collectés (environ 500 photons par molécule).Nous mettons en évidence la robustesse de la technique SELFI en reconstruisant des images de super-résolution 3D de structures denses en profondeur dans des échantillons tissulaires complexes. En effectuant du SELFI-dSTORM, nous avons observé le réseau d’actine sur des cellules cultivées en surface de la lamelle dans un premier temps, et à différentes profondeurs (25 et 50 microns) au sein de tissus artificiels dans un second temps.Du suivi 3D de particule unique a aussi été effectué sein de tissus biologiques vivants. Nous avons observé la diffusion libre de quantum dots à différentes profondeurs (jusqu’à 50 microns, limité par l’objectif utilisé) dans des tranches vivantes de cerveau.Nous avons appliqué la technique SELFI à la détection de récepteurs postsynaptiques NMDA. Cela nous a permis d'observer, sur des échantillons de neurones en culture primaire mais aussi au sein de tranches de cerveaux de rats, une différence d'organisation entre les deux sous-unités GluN2A et GluN2B de ce récepteur au glutamate.Enfin, nous avons démontré l'importance de suivre l'évolution de l'environnement des échantillons biologiques vivants lors des acquisitions permettant la détection de molécules individuelles. Grâce à l'utilisation additionnelle et simultanée de l'imagerie de phase quantitative, nous avons pu étudier la dynamique de la membrane cellulaire durant l’activation par un facteur de croissance. L'analyse corrélative entre les images de phase quantitative en lumière blanche et les détections de molécules fluorescentes uniques permet d'obtenir de nouvelles informations pertinentes sur l'échantillon étudié. / The work of this thesis was devoted to the development of a new technique SELFI (for self-interferences). This method unlocks the three-dimensional localization of individual fluorescent emitters. We have demonstrated that this allows 3D super-resolved imaging and 3D tracking of single molecules deep into dense and complex biological samples. The SELFI technique is based on the use of self-referenced interference to go back to the 3D location of a emitter in a single measurement. These interferences are generated using a diffraction grating placed at the exit of the fluorescence microscope: the fluorescence signal diffracts on the grating and, after a short propagation, the orders interfere on the detector. The formed interferences are digitally decoded to extract the 3D location of a fluorescent molecule within the sample. A single molecule can thus be localized with a precision of approximatively ten nanometers up to a depth of at least 50 µm in a thick living biological sample (for example a biological tissue).By combining the SELFI method with different super-resolution techniques (PALM, dSTORM and uPAINT), we show that this three-dimensional localization method grants the access to the hierarchy and organization of proteins in biological objects. By performing SELFI-PALM, we observed different proteins of the adhesion focal points (talin C-terminal and paxilin) and found the expected elevation differences, and those within living cell samples. These results confirm the resolution capability of the SELFI technique (about 25 nm) even for a small number of photons collected (about 500photons per molecule).We highlight the robustness of the SELFI technique by reconstructing 3D super-resolution images of dense structures at depth in complex tissue samples. By performing SELFI-dSTORM, we observed the actin network in cells grown on the surface of the coverslip at first, and at different depths (25 and 50 microns) within artificial tissues in a second time.3D single particle tracking has also been performed in living biological tissues. We observed the free diffusion of quantum dots at different depths (up to 50 microns) in living brain slices.We applied the SELFI technique to the detection of NMDA postsynaptic receptors. We observed, in primary culture of neurons but also within slices of rat brains, a difference in organization between the two subunits GluN2A and GluN2B of this glutamate receptor.Finally, we show the importance of following the evolution of the living biological sample environment during the acquisition of images leading to detections of single molecules. Thanks to the additional and simultaneous use of quantitative phase imaging, we were able to study cell membrane dynamics during the activation by a growth factor. The correlative analysis between white light quantitative phase images and single fluorescent molecule detections provides new relevant information on the sample under study.

La compréhension fondamentale de fonctions biologiques est accordée par l’imagerie de molécules uniques dans les cellules vivantes. Cet environnement nanoscopique est compliqué et largement mal compris. La microscopie de localisation permet cet environnement d’être sondé avec le suivi de molécules uniques. Depuis longtemps, l’obstacle principal qui empêcher la compréhension de processus physiques à cette échelle était la pénurie d’information accessible; de fortes hypothèses ne peuvent pas être établies à partir de quelques dizaines de trajectoires de molécules uniques. L’introduction des techniques de suivi de molécules à haute densité a recadré les possibilités. Dans cette thèse, les outils d’inférence Bayesienne ont été développé pour élucider le comportement de molécules uniques à partir la cartographie de leurs paramètres physiques de mouvement. Ces cartes décrivent, entre autre, les hétérogénéités aux échelles locales mais aussi à l’échelle de la cellule entière. Notamment elles dévoilent les détails quantitatifs sur les processus cellulaires de base. En utilisant cette approche cartographique, les interactions entre récepteurs et protéines d’échafaudage chez les neurones et les cellules non-neuronales sont étudiés. Une étude sur les interactions imprimées dans la cellule est également effectuée grace à un système prometteur d’impression de protéine. Les différents types d’interactions entre constructions chimériques du récepteur de glycine et de protéines d’échafaudage de géphyrine sont décrits et distingué in situ. Enfin, les perspectives vis-à-vis l’obtention de cartes tridimensionnelles de dynamiques de molécules uniques sont également commentées. / Imaging of single molecules inside living cells confers insight to biological function at its most granular level. Single molecules experience a nanoscopic environment that is complicated, and in general, poorly understood. The modality of choice for probing this environment is live-cell localisation microscopy, where trajectories of single molecules can be captured. For many years, the great stumbling block in comprehension of physical processes at this scale was the lack of information accessible; statistical significance and robust assertions are hardly possible from a few dozen trajectories. It is the onset of high-density single-particle tracking that has dramatically reframed the possibilities of such studies. Importantly, the consequential amounts of data it provides invites the use of powerful statistical tools that assign probabilistic descriptions to experimental observations. In this thesis, Bayesian inference tools have been developed to elucidate the behaviour of single molecules via the mapping of motion parameters. As a readout, maps describe heterogeneities at local and whole-cell scales. Importantly, they grant quantitative details into basic cellular processes. This thesis uses the mapping approach to study receptor-scaffold interactions inside neurons and non-neuronal cells. A promising system in which interactions are patterned is also examined. It is shown that interactions of different types of chimeric glycine receptors to the gephyrin scaffold protein may be described and distinguished in situ. Finally, the prospects of whole-cell mapping in three-dimensions are evaluated based on a discussion of state-of-the-art volumetric microscopy techniques.

La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.

La nano-organisation de la membrane cellulaire est essentielle à la régulation de certaines fonctions cellulaires. Dans cette thèse, les récepteurs EGF, CPεT et de la transferrine ont été marqués avec des nanoparticules luminescentes et ont été suivis à la fois dans leur environnement local dans la membrane cellulaire vivantes pour de longues durées et sous un flux hydrodynamique. Nous avons alors appliqué des techniques d'inférence bayésienne, d’arbre de décision et de clustering de données extraire des informations quantitatives sur les paramètres caractéristiques du mouvement des récepteurs, notamment la forme de leur confinement dans des microdomaines. L’application d’une force hydrodynamique sur les nanoparticules nous a alors permis de sonder les interactions auxquelles ces récepteurs sont soumis. Nous avons appliqué cette approche in vitro pour favoriser et mesurer la dissociation in vitro de paires récepteur / ligand à haute affinité entre des récepteurs membranaires et leurs ligands pharmaceutiques, telles que HB-EGF et DTR et l’avons ensuite appliqué à l’étude d’interactions à la membrane cellulaire. Nous avons ainsi mis en évidence trois modes différents d'organisation de la membrane et de confinement des récepteurs: le confinement de CPεTR est déterminé par l'interaction entre les récepteurs et les constituants lipidiques / protéiques des microdomaines, le potentiel de confinement de l'EGFR résulte de l'interaction avec les lipides et les protéines de l’environnement du radeau et de l’interaction avec la F-actine; les récepteurs de la transferrine diffusent librement dans la membrane, uniquement limités stériquement par des barrières d’actine, selon le modèle ‘picket-and-fence’. Nous avons de plus montré que les nanodomaines de type radeau sont rattachés au cytoskelette d’actine. Ce travail présente donc à la fois un aperçu quantitatif du récepteur membranaire, des mécanismes d’organisation à l’échelle nanométrique, et établit un cadre méthodologique avec lequel différents types de propriétés membranaires peuvent être étudiés. / In this thesis, EGF, CPεT and transferrin receptors were labeled with luminescent nanoparticles, , and were tracked both in their local environment in the cell membrane and under a hydrodynamic flow. Bayesian inference, Bayesian decision tree, and data clustering techniques can then be applied to obtain quantitative information on the receptor motion parameters. Furthermore, we introduced hydrodynamic force application in vitro to study biomolecule dissociation between membrane receptors and their pharmaceutical ligands in high affinity receptor- ligand pairs, such as HB-EGF and DTR. Finally, three different modes of membrane organization and receptor confinement were revealed: the confinement of CPεTR is determined by the interaction between the receptors and the lipid/protein constituents of the raft; the confining potential of EGFR results from the interaction with lipids and proteins of the raft environment and from the interaction with F-actin; transferrin receptors diffuse freely in the membrane, only sterically limited by actin barriers, according to the “picket-and-fence” model. We moreover showed that all raft nanodomains are attached to the actin cytoskeleton.