Viruses are the most abundant biological entity in the biosphere and are known to infect hosts from all domains of life. The aim of my work is to identify conserved and non-conserved features among the capsid structures of related and divergent icosahedral viruses via cryogenic electron microscopy, sequence analysis, molecular modeling, and other techniques. Bird polyomaviruses often cause severe disease in their hosts whereas mammalian polyomaviruses generally do not. Avian polyomavirus is a type of bird polyomavirus with an unusually broad host range compared to the restricted tropism of other polyomaviruses. Although most polyomaviruses have a conserved, rigid capsid protein structure, avian polyomavirus has a flexible capsid shell and a non-conserved C-terminus in its major capsid protein. A β-hairpin motif appears to stabilize other polyomaviruses but is missing in avian polyomavirus. The lack of this structure in avian polyomavirus may account for its capsid flexibility and broad host range. A minor capsid protein unique to bird polyomaviruses may be located on the inner capsid surface. This protein may have a role in the acute disease caused by bird polyomaviruses. The solution-state capsid structure of satellite tobacco mosaic virus was unexpectedly different than the previously solved crystalline structure. The conformational differences were accounted for by a shift of the capsid protein about the icosahedral fivefold axis. Conversely, the RNA core was consistent between solution and crystalline structures. The stable RNA core supports previous observations that the viral genome stabilizes the flexible capsid. Halophage CW02 infects Salinivibrio bacteria in the Great Salt Lake. The three-dimensional structure of CW02 revealed a conserved HK97-like fold that is found in all tailed, double-stranded DNA viruses. The capsid sequence of CW02 shares less than 20% identity with HK97-like viruses, demonstrating that structure is more conserved than sequence. A conserved module of genes places CW02 in the viral T7 supergroup, members of which are found in diverse aquatic environments. No tail structure was observed in reconstructions of CW02, but turret-like densities were found on each icosahedral vertex, which may represent unique adaptations similar to those seen in other extremophilic viruses.

Proteins often carry an intrinsic electric dipole moment, which can interact with external electric fields and cause protein motion. Previous research has found that the orientation of small proteins in gas phase can be controlled in a static electric field. This effect is hoped to benefit applications such as single-particle imaging, and possibly other techniques involving proteins in electric fields. With the purpose of improving our understanding and modeling of protein orientation, this project investigated the scarcely explored quantum mechanical aspects of the process, namely the polarizability. Ground-state electronic structure simulations of three small model proteins, ubiquitin, Trp-cage and lysozyme, under the influence of electric fields were performed in vacuum. The electric dipole moments of the proteins were extracted from simulations with an applied electric field of strength 1 V/nm for varying angles, with respect to a body fixed reference frame. A Python program was written to analyze and visualize the results. The results point to a connection between the polarizability and the structure of the proteins, as well as size. Next a 3D rigid rotor model was developed using Mathematica in order to study the orientation dynamics classically in a simplified and time efficient way, with the possibility of including the previous quantum results. A comparison between a simulation of ubiquitin with and without polarizability concluded that the polarizability seems to have a damping effect on the orientation dynamics, at least for the initial conditions tested in this study. Further research is necessary to validate the model and perform statistical analysis of many simulations with varying initial conditions. / Proteiner bär ofta på ett inneboende elektriskt dipolmoment, som vid interaktion med externa elektriska fält och orsakar rörelse hos proteinerna. Tidigare studier har funnit att orienteringen av små proteiner i gasfas kan kontrolleras i ett statiskt elektriskt fält. Den effekten kan förhoppningsvis vara en fördel i tillämpningar såsom single-particle imaging, och eventuellt andra tekniker som innefattar proteiner i elektriska fält. I syftet att förbättra vår förståelse och modellering av protein-orientering, har detta projekt undersökt de föga utforskade kvantmekaniska aspekterna av processen, nämligen polariserbarheten. Kvant-baserade simuleringar av grundtillståndet av tre små proteiner, ubiquitin, Trp-cage och lysozym, under påverkan av elektriska fält utfördes i vakuum. Proteinernas elektriska dipolmoment extraherades från simuleringar med ett elektriskt fält med styrkan 1 V/nm för olika vinklar, med avseende på ett kroppsfixerat koordinatsystem. Ett Python-program skrevs för att analysera och visualisera resultaten. Resultaten tyder på att polariserbarheten beror på strukturen och storleken av proteinerna. Därefter utformades en stel-rotor-modell med hjälp av Mathematica för att studera prienteringen klassiskt på ett förenklat och tidseffektivt sätt, med möjligheten att inkludera de tidigare kvantmekaniska resultaten. En jämförelse mellan en simulering av ubiquitin med och utan polariserbarhet konstaterade att polariserbarheten verkar ha en dämpande effekt på orienteringen, åtminstone för begynnelsevillkoren som testades i denna studie. Vidare forskning krävs för att styrka modellen och utföra statistisk analys av många simuleringar med varierande begynnelsevillkor.

Strukturbestämning av proteiner är viktigt för att kunna förstå deras funktion och en snabbt utvecklande metod inom fältet är kryoelektronmikroskopi. Storleksbegränsningar förhindrar en bredare applikation av metoden eftersom små proteiner har för låg signal i förhållande till bakgrund för att kunna visualiseras som enstaka partiklar i elektronmiksoskopibilder. Hypotesen för projektet är att det är möjligt att avbilda väldigt små proteiner och kringgå den konventionella storleksbegränsningen genom att använda ett bärarprotein ((Putrescine Aminotransferase; YgjG) som kopplas till en affibody (Zwt) genom “helical fusion” och sedan binda ett litet målprotein till denna större struktur. Komplexet ska ge en tillräcklig storlek, symmetri och rigiditet för en lyckad elektronmikroskopi av bärare tillsammans med det lilla icke kovalent bundna målproteinet. För att karaktärisera den föreslagna bäraren, genomförs stabilitetstester genom CD, verifiering av inbindning av målproteinet i SPR, renhetsundersökning med SEC och slutligen kryoelektronmikroskopi för att testa konceptet. Det lilla målproteinet som kommer att avbildas i konceptstudien är en annan affibody (Z963), som i så fall skulle vara det minsta proteinet som någonsin har lösts med kryogenelektronmikroskopi. Resultaten visar att den undersökta tetramera-bäraren är väldigt stabil (Tm~ 85 oC) och kan tolerera en affibody-fusion med bibehållen bindning av multipla säten. Proteinet kan uttryckas rekombinant och renas till högt utbyte och bildar tetramerer även med fuserad affibody. De slutgiltiga resultaten från den kryoelektronmikroskopiska analysen inväntas fortfarande, men lovande griddar har skapats och en partikelselektion har gett klara 2-D klasser som också framhäver att det lilla målproteinet har bundit. Sammanfattningsvis har biofysikalisk karaktärisering indikerat att YgjG är en lovande bas för ett “imaging scaffold” och att preliminära enstaka-partikel kryoelektronmikroskopi analyser visar att den föreslagna strategin att undersöka små målproteiner är möjlig. / Determining structures of proteins is important to understand protein functions, and a rapidly evolving technique in this field is cryogen electron microscopy. However, size limitations are preventing wider applications of the technique because small proteins have poor signal to noise ratios and are not possible to distinguish in single-particle images. The hypothesis of this project is that it is possible to image very small proteins, bypassing the conventional size limitations of single-particle cryo-EM, by utilizing a carrier protein-scaffold (Putrescine Aminotransferase; YgjG) connected through helical fusion to an affibody (Zwt) that can bind to a small protein of interest. The complex provides a sufficient size, symmetry, and rigidity for successful electron microscopy also of the non-covalently bound small protein of interest. To characterise the proposed scaffold, thermal stability through CD, binding of target protein in SPR, purity through SEC and experiments towards proof-of-concept in cryo-EM will be performed. The small protein of interest to be imaged in the proof-of-concept setup is another affibody, called Z963, that would be the smallest protein ever solved with cryo-EM. The results show that the investigated tetrameric protein scaffold is a highly stable protein (Tm~85oC) that can tolerate affibody fusion with retained binding function of multiple sites. The protein can be recombinantly expressed and purified in high yield and forms tetramers also when fused to affibody. The cryo-EM results are still pending, but promising grids have been created and in an initial particle selection clear 2-D classes that also reveal the small bound protein of interest have been generated. To conclude, biophysical characterization indicates that YgjG is a promising base structure for an imaging scaffold and preliminary single-particle cryo-EM analyses show that the proposed strategy to investigate structures of small proteins of interest is feasible.

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Endgültig fehlgefaltete oder anderweitig beschädigte Proteine des Endoplasmatischen Retikulums (ER) werden durch das Proteasom in einem Prozess abgebaut, der als Endoplasmatischer Retikulum Assoziierter Abbau (ERAD) bezeichnet wird. Der Hrd1-Komplex ist ein aus mehreren Komponenten bestehender Transmembran-Proteinkomplex, der die Ubiquitinierung und den Export von Proteinen aus dem ER vermittelt, welche dann im Zytosol abgebaut werden. Trotz erheblicher Anstrengungen in den letzten zwei Jahrzehnten führte die biochemische Charakterisierung seiner Architektur und seines Mechanismus zu inkonsistenten und sogar widersprüchlichen Ergebnissen, sodass kein Konsens darüber besteht, wie Hrd1 den Proteintransport realisiert. In diesem Projekt habe ich Fluoreszenz-Mehrfarben-Einzelmolekül-Mikroskopie verwendet, um eine neue Perspektive auf die Architektur, Bildung und Dynamik des Hrd1-Komplexes zu eröffnen. Im Projektverlauf habe ich zellbiologische, experimentelle und analytische Werkzeuge entwickelt, um die Hrd1-Oligomerisierung in vivo robust zu quantifizieren und zu charakterisieren. Durch die Kombination von Mehrfarben-Einzelmolekül-Mikroskopie mit chemischer Inhibierung, der Herunterregulierung anderer Komplexkomponenten und einem neuartigen, auf Bindungswettbewerb basierenden Assay konnte ich nachweisen, dass Hrd1 ein stabiles Homo-Tetramer bildet, das über seine zytosolische Domäne Hrd1480-529 geformt wird. Durch Strukturmodellierung über AlphaFold konnte ich nachweisen, dass sich diese Domäne unabhängig von anderen Komplexkomponenten oder der Aktivität von Hrd1 zu einer kanonischen „coiled-coil“ Domäne zusammensetzt. Während diese Arbeit neue spezifische biologische Einblicke in die Hrd1-Komplexbildung liefert, dient sie auch als allgemeine Blaupause dafür, wie Einzelpartikel-Tracking verwendet werden kann, um Fragen zu beantworten, die mit klassischer Biochemie in der Regel nur begrenzt untersucht werden können. / Terminally misfolded or otherwise damaged proteins of the Endoplasmic Reticulum (ER) are degraded by the proteasome in a process termed Endoplasmic Reticulum Associated Degradation (ERAD). The Hrd1 complex is a multicomponent transmembrane protein complex that mediates ubiquitination and export of proteins from the ER to be degraded in the cytosol. Despite substantial effort in the past two decades, the biochemical characterization of its architecture and mechanism produced inconsistent and even contradictory results, yielding no consensus on how it mediates protein transport. Its elusive nature is representative of the limitations of classical biochemical approaches, whose often harsh experimental conditions directly interfere with the objects they study. In this project I used fluorescence multi-color single molecule microscopy to offer a new perspective on the architecture, formation and dynamics of the Hrd1 complex. In this process I developed cell biological, experimental and analytical tools to robustly quantify and characterize Hrd1 oligomerization in vivo. Combining live-cell dual-color single-particle tracking with chemical inhibition, downregulation of complex components and a novel, binding-competition based tracking assay, I demonstrated that Hrd1 forms a stable homo-tetramer via its cytosolic domain Hrd1480-529. By structural modeling via AlphaFold, results of which were validated with both single-particle tracking and recombinant protein expression, I showed that this domain assembles into a canonical coiled-coil domain independently of other complex components or Hrd1's activity. While yielding specific novel biological insight into Hrd1 complex formation, it also serves as a general blueprint on how dual-color single particle tracking can be used to address questions that bring classical biochemistry to its limits.

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Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative qui présente une grande résistance aux antibiotiques, lui permettant de sévir dans le milieu hospitalier en infectant plus particulièrement les patients immunodéprimés. Cette résistance est principalement due au système d’efflux membranaire MexAB-OprM, capable d’exporter les antibiotiques en dehors de la cellule. Cette pompe à efflux est composée de trois protéines, MexA, MexB et OprM, incorporées dans les membranes internes et externes de la paroi bactérienne. Les structures de MexA, OprM et AcrB -une protéine présente chez E. coli, homologue de MexB- ont été déterminées individuellement par cristallographie des rayons X. Cependant, la structure du complexe entier, regroupant les trois protéines en interaction, ainsi que le mécanisme de cette pompe font toujours défaut. Le renforcement de nos connaissances structurales et fonctionnelles est donc capital pour lutter plus efficacement contre ces bactéries, par de nouvelles stratégies médicamenteuses. Ce travail porte sur l’étude de la structure et de la stœchiométrie de l’assemblage des protéines OprM et MexA au sein d’une membrane lipidique. La caractérisation du complexe OprM/MexA a été réalisée à l’aide de nouvelles techniques de caractérisation physico-chimique des surfaces, telle que la Microbalance à Cristal de Quartz avec Mesure de Dissipation (QCM-D), et par des méthodes d’imagerie, telles que la Cryo-Microscopie Electronique en Transmission (CryoMET) et la Cryo-Tomographie Electronique (CryoTE). En QCM-D, les mesures d’interaction entre OprM et MexA ont été réalisées sur support solide en contrôlant l’orientation d’OprM placée dans un environnement lipidique. Après ajout de la protéine MexA, la formation de complexes OprM/MexA a été mise évidence. Pour comprendre l’organisation de ce complexe, nous avons procédé à une étude comparative de l’organisation des protéines OprM, MexA et du complexe OprM/MexA incorporés dans une membrane lipidique, par CryoMET. Trois types d’organisation, respectivement spécifiques d’OprM, de MexA et du complexe OprM/MexA, ont été mis en évidence. Une analyse structurale de ces trois différents assemblages, pris en sandwich entre deux membranes lipidiques, a été menée par CryoTE. La reconstitution de la protéine OprM conduit à la formation de protéoliposomes, dû à des interactions intervenant entre les protéines OprM au niveau de leurs hélices périplasmiques. La protéine MexA s’organise sous forme d’une structure annulaire de 13 nm de hauteur au sein des membranes lipidiques, et d’une structure plus complexe de 26 nm de hauteur, résultant de l’empilement tête-bêche de deux structures annulaires de 13 nm. Ce travail révèle les dimensions exactes de l’assemblage formé par MexA, et permet de localiser à proximité des membranes les domaines non résolus dans la structure cristallographique. La reconstitution du complexe OprM/MexA révèle une disposition régulière des deux protéines dans les membranes lipidiques. Au sein des complexes, les protéines OprM sont présentes sous forme de trimères. Dans la membrane opposée, à l’aplomb d’une molécule d’OprM, MexA ne forme pas une structure annulaire similaire à celle décrite précédemment, indiquant un état d’oligomérisation différent de celui observé dans les assemblages MexA. Les densités de MexA sont compatibles avec la présence de quelques molécules de MexA. Cependant des structures annulaires de MexA, positionnées à l’aplomb de trois trimères d’OprM sont visibles. Notre étude montre que MexA adopte des structures oligomériques spécifiques en fonction de ses interactions avec les membranes lipidiques ou avec son partenaire OprM. / The structure determination of membrane protein in lipid environment can be carried out using cryo electron microscopy combined with the recent development of data collection and image processing. We describe a protocol to study assemblies or stacks of membrane protein reconstitued into a lipid membrane using both cryo electron tomography and single particle analysis which is an alternative approach to electron crystallography for solving 3D structure. We show the organization of the successive layers of OprM molecules revealing the protein-protein interactions between OprM molecules of two successive lipid bilayers.

Les récepteurs du glutamate de type AMPA (rAMPA) sont les acteurs principaux de la transmission synaptique excitatrice rapide. Leur abondance au niveau de la densité postsynaptique est essentielle pour l'établissement et le maintien de la fonction synaptique, et est le résultat d'un trafic hautement dynamique. De nombreuses études ont permis de caractériser les mécanismes de diffusion membranaire impliqués dans l’adressage des rAMPA jusqu’à la synapse. Le rôle majeur des protéines auxiliaires des rAMPA dans la modulation de cette étape de trafic a été démontré. Par ailleurs, il est suggéré que la localisation synaptique des rAMPA est aussi régulée lors des phases plus précoces du trafic intracellulaire, c’est-à-dire de l'appareil de Golgi vers la membrane plasmique via les vésicules post-Golgiennes. Cependant le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA n'a jamais été visualisé et reste donc encore très mal compris. En collaboration avec l'équipe de Guus Smit (Amsterdam), j’ai participé à la caractérisation d’une nouvelle protéine auxiliaire des rAMPA, appelée Shisa6. Dans le cadre de ce projet, j’ai pu étudier le rôle de cette protéine sur la diffusion membranaire des rAMPA en utilisant une technique de suivi de particule unique (Quantum dot) développée au laboratoire. Mon projet de thèse principal a consisté à étudier le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA par le développement d’une nouvelle méthode d’étude. En effet, l'échec dans la visualisation dynamique du trafic vésiculaire des récepteurs pourrait être expliqué par un faible rapport signal/bruit, conséquence d'une faible concentration vésiculaire en rAMPA combinée à un bruit de fond important dû aux marquages provenant du réticulum endoplasmique (RE) et de la membrane plasmique. Dans le but de surpasser cette difficulté, nous avons mis au point un outil ingénieux (système ARIAD) afin de bloquer les rAMPA dans le RE et contrôler, par l'ajout d'un ligand, leur sécrétion du RE jusqu'à la membrane plasmique. Grâce à cet outil, nous avons non seulement augmenté considérablement la concentration des rAMPA dans les vésicules post-Golgiennes, mais aussi éliminé le bruit de fond membranaire. Par la technique de FRAP nous avons pu éliminer le bruit de fond provenant du RE. Une telle approche, combinée à des techniques d'imagerie sur neurones vivants, nous a permis de visualiser pour la première fois le trafic vésiculaire post-Golgien des rAMPA et de l’étudier. / AMPA-type glutamate receptors (AMPAR) are the main actors of the fast excitatory synaptic transmission. Their abundance at the postsynaptic density is essential for the establishment and maintenance of synaptic function, and is the result of a highly dynamic trafficking. Many studies have characterized the membrane diffusion mechanisms involved in the AMPAR synaptic localization, and revealed the critical role of the AMPAR auxiliary proteins in the modulation of this trafficking. Furthermore, it is suggested that AMPAR synaptic localization is also regulated during the early steps of the intracellular trafficking, from the Golgi apparatus to the plasma membrane via the post-Golgi vesicles. However, the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR has never been visualized and therefore remains poorly understood. In collaboration with the Guus Smit team (Amsterdam), I participated in the caracterization of a novel AMPAR auxiliary protein called Shisa6. As part of this project, I studied the role of this protein on the AMPAR membrane diffusion, using a method of single particle tracking (Quantum dot) developed in the laboratory. My main thesis project was to study the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR through the development of a new experimental protocol. Indeed, the failure in the dynamic visualization of the receptor vesicular trafficking could be explained by a low signal/noise ratio resulting of a poor AMPAR vesicular concentration, combined with a high background noise due to receptors localized both in the endoplasmic reticulum (ER) and at the plasma membrane. In order to overcome this difficulty, we have used an ingenious tool (ARIAD system) so as to block AMPAR into the ER and, by adding a ligand, control their trafficking from the ER to the plasma membrane. Thanks to this tool we have not only significantly increased the AMPAR concentration in the post-Golgi vesicles, but also eliminated the plasma membrane background noise. The FRAP imaging technique was used in order to remove the ER background noise. Such methodological approach combined with imaging techniques in living neurons, allowed us to clearly visualize for the first time the post-Golgi vesicular trafficking of AMPAR, and to study the mechanisms involved in this trafficking.

La microscopie optique est un outil indispensable pour la recherche de la neurobiologie et médecine qui permet l’étude des cellules dans leur environnement natif. Les processus sous-cellulaires restent néanmoins cachés derrière les limites de la résolution optique, ce qui rend la résolution des structures plus petites que ~300nm impossible. Récemment, les techniques de la localisation des molécules individuelles (SML) ont permis le suivi des protéines de l’échelle nanométrique grâce à l’ajustement des molécules uniques à la réponse impulsionnelle du système optique. Ce processus dépend de la quantité de lumière recueilli et rend ces techniques très sensibles aux imperfections de la voie d’imagerie, nommé des aberrations, qui limitent l’application de SML aux cultures cellulaires sur les lamelles de verre. Un système commercial d’optiques adaptatives est implémenté pour compenser les aberrations du microscope, et un flux de travail est défini pour corriger les aberrations dépendant de la profondeur qui rend la 3D SML possible dans les milieux biologiques complexes. Une nouvelle méthode de SML est présentée qui utilise deux objectifs pour détecter le spectre d’émission des molécules individuelles pour des applications du suivi des particules uniques dans 5 dimensions (x,y,z,t,λ) sans compromis ni de la résolution spatiotemporelle ni du champ de vue. Pour faciliter les analyses de manière quantitative des Go de données générés, le développement des outils biochimiques, numériques et optiques est présenté. Ensemble, ces approches ont le but d’amener l’imagerie quantitative des molécules uniques dans les échantillons biologiques complexes / Optical microscopy is an indispensable tool for research in neurobiology and medicine, enabling studies of cells in their native environment. However, subcellular processes remain hidden behind the resolution limits of diffraction-limited optics which makes structures smaller than ~300nm impossible to resolve. Recently, single molecule localization (SML) and tracking has revolutionized the field, giving nanometer-scale insight into protein organization and dynamics by fitting individual fluorescent molecules to the known point spread function of the optical imaging system. This fitting process depends critically on the amount of collected light and renders SML techniques extremely sensitive to imperfections in the imaging path, called aberrations, that have limited SML to cell cultures on glass coverslips. A commercially available adaptive optics system is implemented to compensate for aberrations inherent to the microscope, and a workflow is defined for depth-dependent aberration correction that enables 3D SML in complex biological environments. A new SML technique is presented that employs a dual-objective approach to detect the emission spectrum of single molecules, enabling 5-dimensional single particle imaging and tracking (x,y,z,t,λ) without compromising spatiotemporal resolution or field of view. These acquisitions generate ~GBs of data, containing a wealth of information about the localization and environment of individual proteins. To facilitate quantitative acquisition and data analysis, the development of biochemical, software and hardware tools are presented. Together, these approaches aim to enable quantitative SML in complex biological samples.

Les récepteurs AMPA (rAMPA) sont les récepteurs ionotropiques du glutamate responsables de la majeure partie des courants excitateurs rapides dans la transmission synaptique rapide. Lors de la libération de glutamate, le rAMPA passe par 3 états conformationnels majoritaires : pore fermé/agoniste non lié, pore ouvert/agoniste lié et pore fermé/agoniste lié. Le contrôle du nombre et de l’organisation dans la synapse des rAMPA, via une combinaison de diffusion latérale et d’endo/exocytose, est essentiel à la régulation de l’intensité de la transmission synaptique. Les interactions existant entre les protéines de la densité post-synaptique et les protéines partenaires des récepteurs régulent la diffusion des récepteurs, contrôlant leur nombre et leur organisation à la post-synapse. Mon travail de thèse a consisté à étudier l’impact de l’activation des rAMPA sur leur mobilité et leur organisation à la post-synapse. En effet, la fixation de glutamate sur les récepteurs ainsi que leur désensibilisation entraînent des modifications structurales majeures affectant leurs interactions avec les protéines d’échafaudage et les protéines accessoires. L’impact de telles modifications sur les propriétés de diffusion et sur l’organisation sub-synaptique de ces rAMPA était jusqu’à présent inconnu. Mes travaux démontrent une mobilisation des rAMPA synaptiques consécutivement à leur activation par le glutamate. A l’échelle moléculaire, je propose que le passage de l’état activé à l’état désensibilisé des rAMPA entraîne un changement d’affinité de ces derniers pour une de leur protéine partenaire : la Stargazin. Cette régulation glutamate dépendante de la diffusion des rAMPA participe au maintien de la fidélité de la transmission synaptique rapide. / AMPA receptors (AMPAR) are ionotropic glutamate receptors which are responsible for the vast majority of fast excitatory synaptic currents in fast transmission. Upon release of glutamate, AMPAR undergo three main conformational states: pore closed/agonist unbound, pore open/agonist bound and pore closed/agonist bound. Controlling the number of AMPAR and their organization in the synapse, through a combination of lateral diffusion and endo/exocytosis, is essential to regulate the intensity of synaptic transmission. The interactions between proteins of the post-synaptic density and accessory receptor proteins regulate the distribution of receptors, controlling their number and organization in the post-synapse. During my PhD, I studied the impact of AMPAR activation on their mobility and organization in the post-synapse. Indeed, the binding of glutamate to AMPAR and their following desensitization lead to major structural changes on the receptor which impacts on their interactions with scaffolding proteins and accessory proteins. The impact of such modifications on the lateral diffusion and sub-synaptic organization of AMPAR was not known yet. My findings show a mobilization of synaptic AMPAR following their activation by glutamate. At the molecular level, I suggest that the transition from the activated state to the desensitized state of AMPAR leads to a change in affinity of the receptor for their partner protein: Stargazin. This glutamate dependent regulation of AMPAR diffusion participates in maintaining the fidelity of fast synaptic transmission.