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Objective: Previous studies have used acetylcholinesterase (AChE) histochemistry to identify cholinergic nerves in the heart, but this enzyme is not a selective marker for cholinergic neurons. This study maps cholinergic innervation of guinea pig heart using a new antibody to the human high-affinity choline transporter (CHT), which is present only in cholinergic nerves. Methods: Immunohistochemistry was used to localize CHTs in frozen and paraffin sections of heart and whole mount preparations of atrial ganglionated nerve plexus. AChE-positive nerve fibers were identified in sections from separate hearts for comparison. Results: Control experiments established that the antibody to human CHT selectively labeled cholinergic neurons in the guinea pig. CHT-immunoreactive nerve fibers and AChE-positive nerves were very abundant in the sinus and AV nodes, bundle of His, and bundle branches. Both markers also delineated a distinct nerve tract in the posterior wall of the right atrium. AChE-positive nerve fibers were more abundant than CHT-immunoreactive nerves in working atrial and ventricular myocardium. CHT-immunoreactive nerves were rarely observed in left ventricular free wall. Both markers were associated with numerous parasympathetic ganglia that were distributed along the posterior atrial walls and within the interatrial septum, including the region of the AV node. Conclusions: Comparison of labeling patterns for CHT and AChE suggests that AChE histochemistry overestimates the density of cholinergic innervation in the heart. The distribution of CHT-immunoreactive nerve fibers and parasympathetic ganglia in the guinea pig heart suggests that heart rate, conduction velocity, and automaticity are precisely regulated by cholinergic innervation. In contrast, the paucity of CHT-immunoreactive nerve fibers in left ventricular myocardium implies that vagal efferent input has little or no direct influence on ventricular contractile function in the guinea pig.

Le noeud sinusal (NS) est le centre de l‟automatisme cardiaque. Grâce à son activité électrique spontanée, il dicte la fréquence cardiaque (FC) en réponse aux demandes physiologiques. A ce jour, le NS demeure un sujet de recherche important puisque les mécanismes moléculaires responsables de sa régulation sont encore méconnus. Par exemple, les processus menant à la bradycardie sinusale et à la maladie du sinus (MS) chez les personnes âgées sont mécompris et présentement l‟implantation d‟un stimulateur cardiaque demeure le seul traitement disponible. Ainsi, l‟objectif de cette thèse était de déterminer les changements moléculaires et cellulaires se produisant au niveau du NS en réponse à divers stimuli physiologiques et pathologiques afin d'établir leurs rôles potentiels dans la régulation de la FC et le développement de la MS. Dans les deux premiers chapitres, la grossesse est présentée comme modèle physiologique. En effet, la réponse adaptative aux demandes croissantes de la mère et du foetus engendre des changements physiologiques considérables au niveau du myocarde, dont une augmentation de la FC essentielle pour la perfusion adéquate des organes. Toutefois, cette augmentation peut aussi favoriser le développement d‟arythmies. Dans le troisième chapitre, l‟inflammation, un facteur présent lors du vieillissement et dans plusieurs pathologies où la MS se manifeste, a fait l‟objet d‟une étude dans le but de déterminer son rôle dans le développement de la MS. Les résultats obtenus dans cette thèse démontrent que la grossesse induit une hausse de la FC chez la souris gestante similaire à celle retrouvée chez la femme enceinte. Cette accélération était due à un remodelage électrique du NS. Plus spécifiquement, la fréquence des potentiels d‟action ainsi que la densité et l‟expression des courants pacemaker (If) et calcique de type L (ICaL) étaient augmentées. De plus, une accélération des transitoires calciques spontanés et de la vitesse de relâche calcique du réticulum sarcoplasmique a été observée. La régulation de l‟automaticité par un stimulus pathologique, l‟interleukine-1β, est abordée par la suite. L‟interleukine-1β, une cytokine ayant un rôle majeur comme médiateur inflammatoire, se retrouve en concentrations élevées dans plusieurs maladies associées avec la ii MS. Nos résultats démontrent que l‟interleukine-1β engendre une diminution de l‟automaticité associée à une réduction de If et ICaL dans les cardiomyocytes humains de type nodal dérivés de cellules souches induites pluripotentes (hiPSC-CM). En parallèle, le phénotype électrophysiologique et moléculaire des hiPSC-CM a été caractérisé démontrant leur homologie avec les cellules du NS humain adulte, les validant comme modèle in vitro de cellules nodales humaines. En conclusion, les études présentées dans cette thèse démontrent que le NS est plus qu‟un simple tissu régulé par l‟innervation autonome. En effet, son automaticité est dynamique et peut être influencée par des facteurs physiologiques ou pathologiques. Nos résultats contribuent ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l‟automaticité. Ces avancées sont importantes non seulement pour la santé des femmes, mais aussi pour les individus souffrant de la MS. À terme, nous espérons que ces résultats contribueront au développement de stratégies thérapeutiques pour traiter des complications liées aux troubles d‟automaticité cardiaque. / The sinoatrial node (SAN) is the dominant cardiac pacemaker. With its spontaneous automaticity, it dictates rhythm and controls heart rate in response to varying physiological demands. Despite its modest size, the SAN is a very heterogeneous and complex structure that remains the topic of research efforts due, in part, to uncertainties in the mechanisms that regulate pacemaking in various conditions. For instance, the processes that lead to severe sinus bradycardia and SAN dysfunction (SND) in the elderly are unknown and to date, the implantation of electronic pacemaker remains the only SND treatment. Accordingly, the overall objective of this thesis was to explore and highlight the molecular and cellular changes that occur within the SAN in both physiological and pathological states, while determining how they contribute to regulation of heart rate and potentially SND. In the first two chapters, we present pregnancy as a physiological model considering it is a period during which substantial adaptive changes to the myocardium and increases in heart rate occur. Paradoxically, the rapid rate, which is essential for adequate organ perfusion of both mother and foetus, may also increase vulnerability to certain arrhythmias. In the third chapter, inflammation, a central process in pathology and common factor to several diseases and even ageing, was evaluated as potential underlying circumstance contributing to the development of sinus bradycardia and SND. Combinations of in vivo, ex vivo, biochemical, molecular and cellular approaches were used in order to generate an integrated understanding of the models we examined. Our data shows that in pregnant mice, an increase in heart rate similar to that of pregnant women occurs and was due to an electrical remodelling of the SAN. Specifically, an increase in action potential frequency of isolated individual SAN cells was observed. This was attributed to increased expression and density of pacemaker (If) and L-type Ca2+ currents (ICaL) along with a rapid spontaneous Ca2+ transient rate and faster intracellular sarcoplasmic reticulum Ca2+ release. We then demonstrate that the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β which is a major inflammatory mediator that is upregulated in several diseases associated with SND, iv dramatically slows automaticity by reducing If and ICaL density in nodal-like cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM). Importantly, in that study, hiPSC-CMs were also physiologically and molecularly characterized revealing their high resemblance to adult human SAN and a potential use as a novel in vitro model to study pacemaking in humans. In conclusion, the results of this thesis demonstrate that the SAN is not a simple, neurally controlled tissue, but a rather dynamic pacemaker that undergoes extensive intrinsic remodelling during states of health and disease. The results contribute to understanding physiological mechanisms of pacemaking and how they are altered by disease and may be relevant for both women‟s health and the individuals affected by SND. Ultimately, we hope these findings will be helpful in the development of therapeutic strategies to treat pacemaking-related complications.

Les contractions rythmiques résultent de l’activité stimulatrice du nœud sinusal dans le cœur et des cellules interstitielles de Cajal (CICs) dans les intestins. Nous avons découvert un nouveau syndrome résultant d’une combinaison de la maladie du nœud sinusal (MNS) et de la pseudo-obstruction intestinale chronique (POIC). Ce syndrome, que nous avons nommé Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), résulte d’une mutation récessive du gène SGO1 (K23E). Cependant, les rôles connus de SGO1 n'expliquent pas l'apparition postnatale du syndrome ni la pathologie spécifique, suggérant que des rôles non canoniques de SGO1 conduisent aux manifestations cliniques observées. Cette hypothèse est supportée par la comparaison de CAID avec les autres cohésinopathies qui présentent principalement des phénotypes développementaux sans ou avec des défauts légers du cycle cellulaire. Ce projet visait à une découverte non biaisée des mécanismes non canoniques expliquant le syndrome CAID en utilisant le dogme de la biologie moléculaire (ADN→ARNm→protéine) comme ligne directrice. Pour ce faire, nous avons effectué des criblages multi-omiques sur des fibroblastes de peau de patients CAID et de contrôles sains. Les résultats des criblages ont été validés par électrophysiologie, étude des voies de signalisation pertinentes, immunohistochimie, pyroséquençage des rétrotransposons LINE-1 et quantification des marques d’histones. Nos études multi-omiques ont confirmé des changements dans la régulation du cycle cellulaire, mais aussi dans la conduction cardiaque et la fonction des muscles lisses. Plus spécifiquement, plusieurs canaux potassiques étaient sous-régulés. L’électrophysiologie a confirmé une diminution du courant potassique rectifiant entrant (IK1). L'immunohistochimie des coupes intestinales de patients CAID a confirmé l’augmentation de l’expression de SGO1 et BUB1, un régulateur de la voie de signalisation TGF-β. De plus, la voie canonique de TGF-β est augmentée et est découplée de la voie non canonique. Au niveau épigénétique, une signature unique d’hyperméthylation et de fermeture de la chromatine a été observée. Ce qui est soutenu par l’augmentation de la méthylation de H3K9me3 et de H3K27me3. En conclusion, le syndrome CAID est associé à plusieurs changements ayant possiblement un effet cumulatif plutôt que d’une seule voie de signalisation dérégulée. Nos résultats désignent la perturbation du courant IK1, la dérégulation de la signalisation TGF-β, l’hyperméthylation de l’ADN et la compaction de la chromatine comme éléments conducteurs potentiels des manifestations cliniques observées. La voie TGF-β et les changements épigénétiques peuvent être ciblées par des médicaments existants, constituant ainsi des cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement du syndrome CAID. / Rhythmic contractions are driven by the pacemaker activity of the cardiac sinus node and the intestinal interstitial cells of Cajal (ICC). We have discovered a new syndrome resulting from a combination of sick sinus syndrome (SSS) and chronic intestinal pseudo-obstruction (CIPO). This syndrome, which we have named Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), results from a recessive mutation in the SGO1 gene (K23E). However, the known roles of SGO1 do not explain the postnatal onset of the syndrome nor the specific pathology, suggesting that non-canonical roles of SGO1 lead to the clinical manifestations observed. This hypothesis is supported by the comparison of CAID with other cohesinopathies which mainly exhibit developmental phenotypes without or with mild cell cycle defects. This project aimed towards an unbiased discovery of noncanonical mechanisms explaining CAID using the molecular biology dogma (DNA→mRNA→protein) as a guideline. We performed multi-omic screens on skin fibroblasts from CAID patients and healthy controls. Screening results were validated by electrophysiology, study of relevant signaling pathways, immunohistochemistry, LINE-1 retrotransposon pyrosequencing, and histone marks quantification. Our multiomics analyses confirmed changes in cell cycle regulation, but also in cardiac conduction and smooth muscle function. More specifically, several potassium channels were downregulated. Electrophysiology studies confirmed a decrease in the inward rectifier potassium current (IK1). Immunohistochemistry in CAID patient’s intestinal sections confirmed overexpression of SGO1 and BUB1, a regulator of TGF-β signaling pathway. Additionally, the canonical TGF-β signaling was increased and decoupled from noncanonical signaling. At the epigenetic level, CAID patient fibroblasts have a unique signature of hypermethylation and chromatin closure. This is supported by the increased methylation of H3K9me3 and H3K27me3. In conclusion, CAID syndrome is associated with several changes that, may have a cumulative effect rather than a single deregulated signaling pathway. Our results reveal the disturbance of the IK1 current, the deregulation of TGF-β signaling, DNA hypermethylation and chromatin accessibility changes as potential conductors of intestinal and cardiac manifestations of CAID syndrome. In particular, the TGF-β pathway and epigenetic changes, may be targeted by existing drugs, thus constituting promising therapeutic targets for the treatment of CAID syndrome.