Submitted by Cristhian Reynaldo Gomez Bautista (cristhian_rey88@hotmail.com) on 2018-06-06T19:32:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Final.pdf: 1036748 bytes, checksum: 062ca5e9451ec3a79709fe89e619d109 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvana Alvarez null (silvana@ict.unesp.br) on 2018-06-06T19:44:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bautista_crg_me_sjc.pdf: 1036748 bytes, checksum: 062ca5e9451ec3a79709fe89e619d109 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T19:44:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bautista_crg_me_sjc.pdf: 1036748 bytes, checksum: 062ca5e9451ec3a79709fe89e619d109 (MD5) Previous issue date: 2018-05-30 / A diabetes mellitus, doença caracterizada pelo aumento da glicemia no sangue, é um dos mais importantes problemas de saúde pública do mundo, com incidência crescente, sobretudo em países em desenvolvimento. Novas terapias medicamentosas para controlar os níveis de glicose no sangue têm sido desenvolvidas, entre elas, os inibidores da enzima dipeptidil peptidase-4 (DPP-4) como a sitagliptina. Pesquisas atuais mostram que este medicamento, além do controle da glicemia, contribui na estimulação da formação e inibição da reabsorção óssea e possui ação anti-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da sitagliptina no tecido ósseo em ratos diabéticos e não diabéticos. Foram utilizados 38 ratos machos, divididos em 4 grupos: Grupo diabético tratado com sitagliptina (GDS- 10 mg/Kg/dia); Grupo diabético (GD); Grupo normoglicêmico tratado sitagliptina (GNS-10 mg/Kg/dia); Grupo normoglicêmico (GN). Para indução da diabetes os animais receberam solução 10% de frutose na água de beber por 14 dias, após o quê receberam 40 mg/Kg de estreptozotocina via intraperitoneal. Quatro semanas depois, avaliou-se a glicemia e iniciou-se o tratamento com sitagliptina nos grupos GDS e GNS, que continuou por mais 4 semanas, quando ocorreu a eutanásia. A glicemia e a resistência à insulina (HOMA-IR) foram avaliadas também no dia da eutanásia. As tíbias foram removidas e avaliadas a porcentagem de volume ósseo (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número de trabéculas (Tb.N) e a separação de trabéculas (Tb Sp) da metáfise tibiana por microtomografia computadorizada. Os dados foram submetidos à análise estatística, ao nível de 0,05. Os animais dos grupos GD e GDS apresentaram maior glicemia que os animais dos demais grupos, mas não houve diferença entre os grupos com relação aos dados de HOMA-IR, evidenciando a indução de diabetes do tipo I. Os animais diabéticos apresentaram menor BV/TV e Tb.N, e maior Tb.Sp. Não houve diferença com relação à Tb.Th. O modelo experimental foi eficaz para a indução da diabetes, mas o tratamento com sitagliptina não foi suficiente para reverter os efeitos da diabetes no tecido ósseo. / Diabetes mellitus, a disease characterized by increased blood glucose levels, is one of the most important public health problems in the world, with a growing incidence, especially in developing countries. New drug therapies to control blood glucose levels have been developed, including dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitors such as sitagliptin. Current research shows that this drug, in addition to glycemic control, contributes to stimulate the formation and inhibition of bone resorption and has an anti-inflammatory action. The aim of this study was to evaluate the effects of sitagliptin on bone tissue in diabetic and non-diabetic rats. Thirty-eight male rats were divided into four groups: Diabetic group treated with sitagliptin (GDS-10 mg / kg / day); Diabetic group (GD); normoglycemic group treated with sitagliptin (GNS-10 mg / kg / day); normoglycemic group (GN). For induction of diabetes the animals received 10% solution of fructose in the drinking water for 14 days, after which they received 40 mg / kg streptozotocin intraperitoneally. Four weeks later, glycemia was evaluated and sitagliptin treatment was started in the GDS and GNS groups, which continued for another 4 weeks, when euthanasia occurred. Blood glucose and insulin resistance (HOMA-IR) were also evaluated on the day of sacrifice. Bone volume (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), number of trabeculae (Tb.N) and trabeculae separation (Tb.Sp) of the tibial metaphysis were evaluated by computerized microtomography. Data were submitted to statistical analysis at the 0.05 level. The animals of groups GD and GDS presented higher glycemia, but there was no difference regarding HOMA-IR, evidencing diabetes type I induction. The animals in which diabetes was induced presented lower BV/TV and Tb.N, and higher Tb.Sp. There was no difference among groups in TB.Th. The experimental model was sufficient for the induction of diabetes, but treatment with sitagliptin was not enough to reverse the effects of diabetes on bone tissue.

A avaliação no perfil das impurezas de fármacos está sendo alvo de atenção das agências regulatórias nacionais e internacionais visto que podem gerar implicações na saúde da população. Frente a isso, as indústrias farmacêuticas devem adequarse às novas regulamentações para garantir a qualidade, segurança e eficácia dos medicamentos. O fostato de sitagliptina (STG) e vildagliptina (VLG), liberados para uso clínico no Brasil em 2006 e 2007, respectivamente, são utilizados para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2. Na literatura pesquisada não foram encontrados relatos referentes à determinação quantitativa de impurezas de síntese da vildagliptina e sitagliptina. Desta forma, este trabalho teve por objetivo desenvolver e validar métodos analíticos para a determinação de impurezas dos fármacos sitagliptina e vildagliptina, além de avaliar a toxicidade dos mesmos. Foi desenvolvido e validado método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação do fosfato de sitagliptina na presença de duas impurezas de síntese de acordo com os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limites de detecção e quantificação. Para tanto, foi utilizada coluna cromatográfica XBridgeTM Pheny (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), vazão 1,0 mL/min e detecção em 207 nm. A fase móvel foi composta por acetonitrila: solução aquosa em 0,05% de ácido fórmico (40:60, v/v). A determinação quantitativa da vildagliptina e duas impurezas de síntese foi desenvolvida e validada utilizando a técnica por cromatografia líquida de ultra-eficiência. A coluna cromatográfica utilizada corresponde ACQUITI UPLC® BEH C8 (50 x 2,1 mm; 1,7 μm), vazão 0,3 mL/min, volume de injeção de 1 μL e temperatura de 35°C. A fase móvel foi composta por metanol em ácido fórmico 0,1%: solução aquosa em ácido fórmico 0,1%. A partir dos resultados obtidos, verificou-se que estes estão de acordo com os requisitos preconizados pelos códigos oficiais. Esta pesquisa também apresenta resultados referentes aos estudos de citotoxicidade e genotoxicidade tanto dos fármacos quanto das respectivas impurezas realizados a partir dos ensaios de MTT, vermelho neutro, óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, potencial de membrana mitocondrial e teste cometa. / Impurities profiling have attention of national and international regulatory agencies as they may generate implications for the health of the population. Against this, pharmaceutical industry must be suitable for new regulations to ensure quality, safety and efficacy of medicines. The phosphate sitagliptin and vildagliptin, released for clinical use in Brazil in 2006 and 2007, respectively, and used for the treatment of diabetes mellitus type 2. In the literature, we not found any reports regarding the quantitative determination of impurities synthesis of vildagliptin and sitagliptin. Thus, this study aimed to develop and validate analytical methods for the determination of impurities of sitagliptin and vildagliptin in addition to performing toxicological tests. It was developed and validated an analytical method by high-performance liquid chromatography for determination of sitagliptin in presence of two impurities synthesis according to the specific parameters, linearity, precision, accuracy, robustness, limits of detection and quantification. The XBridgeTM Phenyl column (250 mm x 4.6 mm d.i., 5 μm), flow rate 1.0 mL/min and detection at 207 nm. The mobile phase was composed of acetonitrile: aqueous solution in 0.05% formic acid (40:60, v/v). The results obtained are in accordance with the requirements recommended by official guides. Quantitative determination of vildagliptin and its synthetic impurities was developed using liquid chromatography ultra efficiency. The chromatographic column ACQUITY UPLC® BEH C8 (50 x 2.1 mm, 1.7 μm) was used, flow rate 0.3 mL/min, injection volume 1 μL and temperature 35 °C. The mobile phase is composed of methanol in formic acid 0.1%: aqueous solution in formic acid 0.1%. This research presents results for the cytotoxicity and genotoxicity studies of both drugs and the impurities.

A avaliação no perfil das impurezas de fármacos está sendo alvo de atenção das agências regulatórias nacionais e internacionais visto que podem gerar implicações na saúde da população. Frente a isso, as indústrias farmacêuticas devem adequarse às novas regulamentações para garantir a qualidade, segurança e eficácia dos medicamentos. O fostato de sitagliptina (STG) e vildagliptina (VLG), liberados para uso clínico no Brasil em 2006 e 2007, respectivamente, são utilizados para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2. Na literatura pesquisada não foram encontrados relatos referentes à determinação quantitativa de impurezas de síntese da vildagliptina e sitagliptina. Desta forma, este trabalho teve por objetivo desenvolver e validar métodos analíticos para a determinação de impurezas dos fármacos sitagliptina e vildagliptina, além de avaliar a toxicidade dos mesmos. Foi desenvolvido e validado método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação do fosfato de sitagliptina na presença de duas impurezas de síntese de acordo com os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limites de detecção e quantificação. Para tanto, foi utilizada coluna cromatográfica XBridgeTM Pheny (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), vazão 1,0 mL/min e detecção em 207 nm. A fase móvel foi composta por acetonitrila: solução aquosa em 0,05% de ácido fórmico (40:60, v/v). A determinação quantitativa da vildagliptina e duas impurezas de síntese foi desenvolvida e validada utilizando a técnica por cromatografia líquida de ultra-eficiência. A coluna cromatográfica utilizada corresponde ACQUITI UPLC® BEH C8 (50 x 2,1 mm; 1,7 μm), vazão 0,3 mL/min, volume de injeção de 1 μL e temperatura de 35°C. A fase móvel foi composta por metanol em ácido fórmico 0,1%: solução aquosa em ácido fórmico 0,1%. A partir dos resultados obtidos, verificou-se que estes estão de acordo com os requisitos preconizados pelos códigos oficiais. Esta pesquisa também apresenta resultados referentes aos estudos de citotoxicidade e genotoxicidade tanto dos fármacos quanto das respectivas impurezas realizados a partir dos ensaios de MTT, vermelho neutro, óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, potencial de membrana mitocondrial e teste cometa. / Impurities profiling have attention of national and international regulatory agencies as they may generate implications for the health of the population. Against this, pharmaceutical industry must be suitable for new regulations to ensure quality, safety and efficacy of medicines. The phosphate sitagliptin and vildagliptin, released for clinical use in Brazil in 2006 and 2007, respectively, and used for the treatment of diabetes mellitus type 2. In the literature, we not found any reports regarding the quantitative determination of impurities synthesis of vildagliptin and sitagliptin. Thus, this study aimed to develop and validate analytical methods for the determination of impurities of sitagliptin and vildagliptin in addition to performing toxicological tests. It was developed and validated an analytical method by high-performance liquid chromatography for determination of sitagliptin in presence of two impurities synthesis according to the specific parameters, linearity, precision, accuracy, robustness, limits of detection and quantification. The XBridgeTM Phenyl column (250 mm x 4.6 mm d.i., 5 μm), flow rate 1.0 mL/min and detection at 207 nm. The mobile phase was composed of acetonitrile: aqueous solution in 0.05% formic acid (40:60, v/v). The results obtained are in accordance with the requirements recommended by official guides. Quantitative determination of vildagliptin and its synthetic impurities was developed using liquid chromatography ultra efficiency. The chromatographic column ACQUITY UPLC® BEH C8 (50 x 2.1 mm, 1.7 μm) was used, flow rate 0.3 mL/min, injection volume 1 μL and temperature 35 °C. The mobile phase is composed of methanol in formic acid 0.1%: aqueous solution in formic acid 0.1%. This research presents results for the cytotoxicity and genotoxicity studies of both drugs and the impurities.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

A avaliação no perfil das impurezas de fármacos está sendo alvo de atenção das agências regulatórias nacionais e internacionais visto que podem gerar implicações na saúde da população. Frente a isso, as indústrias farmacêuticas devem adequarse às novas regulamentações para garantir a qualidade, segurança e eficácia dos medicamentos. O fostato de sitagliptina (STG) e vildagliptina (VLG), liberados para uso clínico no Brasil em 2006 e 2007, respectivamente, são utilizados para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2. Na literatura pesquisada não foram encontrados relatos referentes à determinação quantitativa de impurezas de síntese da vildagliptina e sitagliptina. Desta forma, este trabalho teve por objetivo desenvolver e validar métodos analíticos para a determinação de impurezas dos fármacos sitagliptina e vildagliptina, além de avaliar a toxicidade dos mesmos. Foi desenvolvido e validado método analítico por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação do fosfato de sitagliptina na presença de duas impurezas de síntese de acordo com os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limites de detecção e quantificação. Para tanto, foi utilizada coluna cromatográfica XBridgeTM Pheny (250 mm x 4,6 mm, 5 μm), vazão 1,0 mL/min e detecção em 207 nm. A fase móvel foi composta por acetonitrila: solução aquosa em 0,05% de ácido fórmico (40:60, v/v). A determinação quantitativa da vildagliptina e duas impurezas de síntese foi desenvolvida e validada utilizando a técnica por cromatografia líquida de ultra-eficiência. A coluna cromatográfica utilizada corresponde ACQUITI UPLC® BEH C8 (50 x 2,1 mm; 1,7 μm), vazão 0,3 mL/min, volume de injeção de 1 μL e temperatura de 35°C. A fase móvel foi composta por metanol em ácido fórmico 0,1%: solução aquosa em ácido fórmico 0,1%. A partir dos resultados obtidos, verificou-se que estes estão de acordo com os requisitos preconizados pelos códigos oficiais. Esta pesquisa também apresenta resultados referentes aos estudos de citotoxicidade e genotoxicidade tanto dos fármacos quanto das respectivas impurezas realizados a partir dos ensaios de MTT, vermelho neutro, óxido nítrico, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, potencial de membrana mitocondrial e teste cometa. / Impurities profiling have attention of national and international regulatory agencies as they may generate implications for the health of the population. Against this, pharmaceutical industry must be suitable for new regulations to ensure quality, safety and efficacy of medicines. The phosphate sitagliptin and vildagliptin, released for clinical use in Brazil in 2006 and 2007, respectively, and used for the treatment of diabetes mellitus type 2. In the literature, we not found any reports regarding the quantitative determination of impurities synthesis of vildagliptin and sitagliptin. Thus, this study aimed to develop and validate analytical methods for the determination of impurities of sitagliptin and vildagliptin in addition to performing toxicological tests. It was developed and validated an analytical method by high-performance liquid chromatography for determination of sitagliptin in presence of two impurities synthesis according to the specific parameters, linearity, precision, accuracy, robustness, limits of detection and quantification. The XBridgeTM Phenyl column (250 mm x 4.6 mm d.i., 5 μm), flow rate 1.0 mL/min and detection at 207 nm. The mobile phase was composed of acetonitrile: aqueous solution in 0.05% formic acid (40:60, v/v). The results obtained are in accordance with the requirements recommended by official guides. Quantitative determination of vildagliptin and its synthetic impurities was developed using liquid chromatography ultra efficiency. The chromatographic column ACQUITY UPLC® BEH C8 (50 x 2.1 mm, 1.7 μm) was used, flow rate 0.3 mL/min, injection volume 1 μL and temperature 35 °C. The mobile phase is composed of methanol in formic acid 0.1%: aqueous solution in formic acid 0.1%. This research presents results for the cytotoxicity and genotoxicity studies of both drugs and the impurities.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

O câncer cervical é uma das neoplasias mais prevalentes, sendo a segunda mais frequente em mulheres no Brasil. A exoprotease dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), também conhecida como CD26, é uma enzima encontrada em uma diversidade de células, e sua atividade enzimática e interação com outras proteínas parecem ser fundamentais para o controle da transformação maligna e progressão tumoral. Esta enzima é encontrada ancorada na membrana celular e também como uma isoforma solúvel (DPPIV/sCD26), ativa em fluidos biológicos. Pesquisas demonstram que alterações em sua expressão e atividade têm sido observadas em diversos tumores. Tendo em vista a relação entre a DPPIV/CD26 e o câncer, neste estudo investigamos a atividade e expressão da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical (SiHa, HeLa and C33A) e de queratinócitos imortalizados (HaCaT). A atividade enzimática também foi monitorada na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26, o fosfato de sitagliptina. Avaliamos também a relação desta enzima com os mecanismos de migração e adesão celular. Nossos resultados demonstram que todas as linhagens estudadas apresentam atividade enzimática DPPIV/CD26 ligada à membrana e solúvel, sendo superior nas linhagens SiHa e HaCaT. Confirmamos que esta atividade é atribuída à DPPIV/CD26 pela inibição da sua atividade enzimática na presença de fosfato de sitagliptina. Uma maior expressão do gene da DPPIV/CD26 foi observada nas linhagens HaCaT e SiHa, uma baixa expressão na C33A, sendo praticamente indetectável na HeLa. Estes dados corroboram os resultados obtidos para a atividade enzimática. Foi observada uma maior capacidade migratória na linhagem HeLa, quando comparada a SiHa, porém na presença de fosfato de sitagliptina, a linhagem SiHa apresentou um aumento na migração. Além disso, na presença do inibidor, tanto a linhagem HeLa quanto a SiHa exibiram uma redução na adesão celular. Este estudo demonstra a presença da enzima DPPIV/CD26 em células de câncer cervical, revelando diferentes níveis de expressão, e sua relação com a migração e adesão celular. / Cervical cancer is one of the most prevalent neoplasias, being the second most frequent in women in Brazil. The exoprotease dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is an enzyme found in a variety of cells, and its enzymatic activity and interaction with other proteins appear to be essential for the control of malignant transformation and tumor progression. This enzyme is found anchored to the cell membrane and also as a soluble isoform (DPPIV/sCD26), active in biological fluids. Studies have shown changes in their expression and activity in several tumor types. Given the relationship between DPPIV/CD26 and cancer, in the present study, we investigated DPPIV/CD26 activity and expression in cervical cancer cell lines (SiHa, HeLa and C33A) and immortalized keratinocytes (HaCaT). Enzymatic activity was also monitored in the presence of the specific DPPIV/CD26 inhibitor, sitagliptin phosphate. We also evaluated the relationship of this enzyme with cell migration and adhesion. Our results show that all cell lines studied exhibit DPPIV/CD26 enzymatic activity both membrane-bound and in soluble form, being higher in SiHa and HaCaT. We confirm that this activity is attributed to DPPIV/CD26 by its inhibition in the presence of sitagliptin phosphate. We observed a higher expression of DPPIV/CD26 in HaCaT and SiHa cell lines, a low expression in C33A and in HeLa cells this expression was almost undetectable. These data corroborate the results obtained for enzymatic activity. We observed a higher migratory capacity of HeLa, when compared to SiHa, but in the presence of sitagliptin phosphate, SiHa showed an increase in migration. Furthermore, in the presence of the inhibitor, SiHa and HeLa cells exhibited a reduction in cell adhesion. This study demonstrates the presence of DPPIV/CD26 in cervical cancer cells, revealing a differential expression and its relationship with cell migration and adhesion.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sitagliptin Phosphate is an oral anti-hyperglycemic belonging to a new class of medicine used in type 2 diabetes treatment, the dipeptidyl dipetidase -4 (DPP-4) enzyme inhibitors. This drug besides being safe and tolerated, stimulates the insulin secretion, lowers the glucagon release, delays the gastric emptiness and increases beta cells life. It is commercially available as covered pills. So far, there is not any monograph to analyze sitagliptin phosphate in its pharmaceutical form. In this work some methods were developed and validated to evaluate and quantify the drug. The methods used to quantify it were high pressure efficiency liquid chromatography (HPLC) and spectrophotometry. The system through HPLC was carried out in room temperature and in an isocratic way with Phenomenex C 18 (15 cm x 4.6mm) reverse phase column and the mobile phase composed by 0.025M pH 6.8 phosphate buffer: acetronytril (60:40, v/v) with 0.8 mL /min. flow. The detection was accomplished in PDA in 267nm. With the spectrophotometric method the solvent used was HCI 0.01N and its detection was accomplished in 267nm wave length. The methods show a good linearity, precision and accuracy and having no significant difference between them. Later, some dissolution tests were carried out with different bacthes of drug and with similar results. / O Fosfato de sitagliptina é um anti-hiperglicemico oral pertencente a uma nova classe de medicamentos utilizados para o tratamento da diabete tipo 2, os inibidores da enzima dipeptidil dipetidase-4 (DPP-4). Este medicamento além de ser seguro e bem tolerado estimula a secreção de insulina, diminuí a liberação de glucagon, retarda o esvaziamento gástrico e prolonga a vida das células beta. Encontra-se comercialmente disponível na forma de comprimidos revestidos. Não existem monografias até o presente momento para a análise do fosfato de sitagliptina em sua forma farmacêutica. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados métodos para a avaliação e quantificação do fármaco. Os métodos utilizados para a quantificação do fármaco foram à cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e a espectrofotometria. O sistema por CLAE foi realizado em temperatura ambiente e de maneira isocrática com coluna de fase reversa Phenomenex C18 (15cm x 4.6mm) e fase móvel composta por tampão fosfato 0.025M pH 6.8 : acetonitrila (60:40, v/v) com vazão de 0.8mL/min. A detecção foi realizada no PDA em 267nm. No método espectrofotométrico o solvente utilizado foi o HCl 0.01N e sua detecção foi realizada no comprimento de onda de 267nm. Os métodos mostram boa linearidade, precisão e exatidão e não demonstraram diferença significativa entre eles. Posteriormente foram realizados testes de dissolução com resultados semelhantes com medicamentos de diferentes lotes.

Introdução: A sitagliptina, inibidor da dipeptidil-peptidase IV, impede a degradação do GLP-1 (peptídeo-1 semelhante ao glucagon), um dos principais hormônios incretínicos. A dieta interfere na secreção de GLP-1, no entanto, a interação das drogas que aumentam o GLP-1 e os macronutrientes da dieta é pouco estudada. Objetivo e Métodos: Determinar o efeito da sitagliptina, na secreção de GLP-1, glucagon, insulina, peptídeo-C, ácidos graxos livres e na glicemia após três dietas, isocalóricas, de diferentes composições nutricionais em pacientes diabéticos tipo 2, recém-diagnosticados, virgens de tratamento, quando comparado a uso de placebo. Dezesseis indivíduos nessas condições foram submetidos a dietas hiperglicídica, hiperprotêica e hiperlipídica, isocalóricas entre si. Dosaram-se nos tempos 0, 30, 60, 120 e 180 minutos os parâmetros: glicose, insulina, peptídeo C, GLP-1, glucagon e AGL. Foi calculada média de área sob a curva e cálculo da área incremental, além de análise de variância para medidas repetidas. Resultados: Durante o teste de dieta hiperglicídica a glicemia foi maior em todos os tempos quando comparado aos testes com PTN e LPD independentemente do uso de sitagliptina (p<0,05). Sitagliptina diminuiu a glicemia em todos os tempos, quando comparado ao uso de placebo (p<0,05). Durante a dieta CHO, a secreção de glucagon foi menor que nas dietas LPD e PTN (p<0,05). Já a concentração de insulina foi maior com a dieta CHO em relação à dieta LPD (p<0,05). A concentração de insulina e peptídeo C foi maior em todos os tempos na dieta CHO (p<0,05). A concentração de GLP-1 foi significativamente maior durante o teste hiperlipídico em relação à dieta CHO. Durante a dieta LPD, a medida de GLP-1 foi maior em todos os tempos. A dieta CHO apresentou medida de GLP-1 menor em todos os tempos do que as outras dietas (p<0,05). A medida de GLP-1 no tempo foi maior (até 120\') com o uso de sitagliptina do que com o uso do placebo, apesar de não estatisticamente significativa. Os níveis de AGL no tempo foram maiores com o uso do placebo do que com o uso da sitagliptina, apesar de não estatisticamente significativo. Conclusão: Houve diminuição da glicemia em todos os tempos com sitagliptina, independentemente da dieta testada. Houve diminuição do efeito da sitagliptina durante o uso da dieta hiperglicídica / Background: Sitagliptin, a dipeptidil-peptidase IV inhibitor, prevents the degradation of GLP-1 (glucagon-like peptide 1), one of the incretin hormones. It is well-known that diet interferes in the GLP-1 secretion; however, the interaction between drugs that stimulates the release of GLP-1 and the macronutrients from diet is hardly studied. Objective and Methods: To demonstrate the effect of sitagliptin on glycemia, and on the secretion of GLP-1, glucagon, insulin, C-peptide, and free fatty acids after three isocaloric diets with different nutritional compositions, in drug-naïve patients, newly diagnosed with type 2 diabetes, when compared to the use of placebo. Sixteen individuals were subjected to a high-carbohydrate diet, a high-protein diet, and a high-fat diet, all of which with similar caloric values. At 0, 30, 60, 120 and180 minutes after the diet, glucose, insulin, C-peptide, GLP-1, glucagon, and AGL were measured. The mean area under the curve, the incremental area, and the variance for repeated measures were calculated. Results: During high-carbohydrate diet, glycemia was higher for all time points, when compared to the PTN and LPD diets, independently of sitagliptin (p<0,05). Sitagliptin reduced glycemia during three diets when compared to placebo (p<0,05). During CHO diet, secretion of glucagon was smaller than it was during the LDP and PTN diets (p<0,05). On the other hand, insulin concentration was higher than during the LPD diet (p<0,05). Concentrations of insulin and C-peptide were higher for all the time points during the CHO diet (p<0,05). GLP-1 concentration was significantly higher during the high-fat diet than during the high-carbohydrate diet. During the LPD diet, the quantity of the GLP-1 was larger for all time points. The CHO diet presented lower GLP-1 level, for all the time points, than the other diets (p<0,05). The GLP-1 level (up to 120min) with the use of sitagliptin was higher with LPD and PTN diet than it was with the CHO diet. The AGL levels for all time points were higher with placebo than with sitagliptin, although not statistically significant. Conclusion: There was a reduction in glycemia with sitagliptin, independently of the diet tested, for all time points. There was a reduction in sitagliptin effect during the use of the high-carbohydrate diet

A disfunção cardíaca é um dos principais desfechos da doença renal crônica, sendo que o eixo sistema renina angiotensina (SRA) é um mediador chave nessa condição. Estudos têm demonstrado que os inibidores da dipeptidil peptidase IV (IDPPIV), uma classe de drogas utilizadas no tratamento do diabetes tipo II, são capazes de exercer efeitos renoprotetores e cardioprotetores, entretanto, os efeitos dos IDDPIV sobre o tecido cardíaco frente a uma injúria renal ainda não foram descritos. Assim, esse estudo teve como objetivo investigar se a inibição da DPPIV atenua a disfunção e o remodelamento cardíaco em ratos com DRC e se esses efeitos se associam a alterações no SRA. Para este fim, ratos Wistar (N=37) com idade entre 2-3 meses, foram submetidos à nefrectomia 5/6 para indução da DRC. Após a cirurgia, os ratos foram randomizados em 2 grupos: Nx (tratados com veículo) e Nx + IDPPIV (tratados com sitagliptina - 200 mg/Kg/dia). Ratos submetidos à cirurgia fictícia foram utilizados como controles (sham). Como esperado, após oito semanas de seguimento, o grupo Nx apresentou acentuada disfunção renal. Por outro lado, nos ratos tratados com sitagliptina, a queda do ritmo de filtração glomerular (RFG) foi significativamente atenuada, bem como a creatinina sérica, albuminúria e pressão arterial caudal em relação ao grupo Nx. Curiosamente, tanto a atividade quanto a expressão proteica e gênica da DPPIV cardíaca estavam aumentadas em ratos Nx comparado aos ratos controles. As análises histológicas mostraram que os cardiomiócitos de ratos Nx apresentaram maior volume nuclear e fibrose intersticial cardíaca em relação ao sham. Por outro lado, nos ratos tratados com sitagliptina o volume nuclear dos cardiomiócitos e fibrose estavam reduzidos em relação aos ratos Nx. A função sistólica não se mostrou distinta entre os três grupos de ratos. Todavia, o tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) foi maior em Nx do que em sham, como sugestivo de disfunção diastólica associada à DRC e o tratamento com sitagliptina foi capaz de atenuar o TRIV. A concentração de angiotensina II cardíaca estava aumentada nos ratos Nx em relação aos ratos sham e o tratamento com sitagliptina foi capaz de impedir sua elevação. Em conjunto, os nossos dados sugerem que a inibição da DPPIV em ratos com DRC atenua o remodelamento e a disfunção cardíaca, e que esses efeitos estão envolvidos ao menos em parte, com a redução nos níveis de angiotensina II. Esse é o primeiro trabalho a demonstrar a interação da DPPIV com o SRA intracardíaco em modelo de DRC, e abre portas para estudos envolvendo os mecanismos que levam a essa associação nas síndromes cardiorrenais / Cardiac dysfunction is one of the main outcomes of chronic kidney disease, with the axis system renin angiotensin (RAS) being a key mediator in this condition. Studies have shown that dipeptidyl peptidase IV (IDPPIV) inhibitors, a class of drugs used in the treatment of type II diabetes, are capable of exerting renoprotective and cardioprotective effects, however, the effects of IDDPIV on cardiac tissue against renal injury were not described. Thus, this study aimed to investigate whether inhibition of DPPIV attenuates cardiac dysfunction and remodeling in rats with CKD and whether these effects are associated with changes in RAS. For this purpose, Wistar rats (N = 37) aged 2-3 months were subjected to 5/6 nephrectomy for induction of CKD. After surgery, the rats were randomized into 2 groups: Nx (treated with vehicle) and Nx + IDPPIV (treated with sitagliptin - 200 mg/kg/day). Sham operated rats were used as controls. After eight weeks of treatment, we identified that the Nx group had marked renal dysfunction. On the other hand, in rats treated with sitagliptin, the decrease in RFG was significantly attenuated, as well as serum creatinine, albuminuria and caudal blood pressure in relation to the Nx group. Interestingly, both the activity and the protein and gene expression of the cardiac DPPIV were increased in Nx rats compared to the control rats. Additionally, histological analysis showed that the cardiomyocytes of Nx rats presented greater nuclear volume and cardiac interstitial fibrosis compared to sham. Conversely, in animals treated with sitagliptin the nuclear volume of cardiomyocytes and fibrosis were reduced in relation to Nx rats. Systolic function was not different among the three groups of rats. However, the isovolumic relaxation time (IVR) was higher in Nx than in sham, as suggestive of CKD-associated diastolic dysfunction and treatment with sitagliptin was able to attenuate IVRT. Cardiac angiotensin II levels were elevated in Nx rats relative to sham rats. Treatment with sitagliptin prevented their elevation. Taken together, data suggest that inhibition of DPPIV in rats with CKD attenuates remodeling and cardiac dysfunction, and that these effects are at least partially involved with the reduction in angiotensin II levels. This study is the first to demonstrate an interaction of DPPIV with the intracardiac RAS in a CKD model, and will help further studies focusing the mechanisms that lead this association in cardiorrenal syndromes