La spermatogenèse est un processus complexe permettant la génération de gamètes mâles ultra spécialisés, les spermatozoïdes. Plusieurs réorganisations successives de l'ADN sont essentielles pour la génération de gamètes mâles haploïdes, dont l'enjambement durant la méiose. La dernière étape de la spermatogenèse, la spermiogenèse, comporte une importante réorganisation nucléaire accompagnée de nombreuses cassures bicaténaires d'ADN, ce qui pourrait mener à une instabilité génétique, surtout dans ce contexte haploïde vulnérable. Le premier objectif de mes recherches était de mieux caractériser cette étape de remodelage chromatinien. Par une approche d'immunofluorescence, nous avons démontré la présence de l'enzyme topoisomérase IIß (TOP2B) lors du remodelage de la chromatine, ainsi qu'une réponse aux dommages à l'ADN coïncidant avec le remodelage chromatinien par l'apparition de la phosphorylation du variant d'histone H2AFX, une biomarqueur de cassures bicaténaires. II est donc fort probable que les spermatides utilisent un système de réparation propice à l'erreur, tel que la jonction terminale non-homologue (NHEJ) pour réparer les nombreuses cassures observées à ces étapes, menant possiblement à une instabilité génomique importante. Afin de mieux comprendre l'impact d'une réparation inadéquate ou d'une absence de réparation de ces cassures, nous avons voulu déterminer leur distribution sur le génome murin. Or, il n'existait aucune approche méthodologique permettant de cartographier ces cassures à l'échelle génomique. Utilisant plusieurs modèles in vitro et in vivo, nous avons mis au point une approche unique, appelée damaged DNA immunoprecipitation ou dDIP, pouvant enrichir les régions endommagée sans compromettre la résolution nucléotidique. Par la suite, nous avons mis au point une méthodologie de dDIP pour les cellules d'eucaryotes supérieurs en immobilisant les cellules dans une matrice d'agarose pour limiter l'introduction de dommages non-spécifiques. Le remodelage de la chromatine des spermatides représente une étape d'instabilité génomique encore peu explorée et pourrait s'avérer une source insoupçonnée de diversité génétique. Grâce à la création de la nouvelle méthodologie dDIP, il sera maintenant possible d'explorer l'importance des cassures transitoires observées durant ce drastique changement nucléaire pour les générations futures. De plus, cet outil peut être appliqué à différents types de dommages, tels que les dommages causés par le rayonnement ultraviolet et les dommages oxydatifs, et donc être utilisé dans l'étude de l'instabilité génomique et de la réparation de l'ADN dans de nombreux domaines scientifiques comme le cancer, la sénescence et la toxicologie.

This thesis presents the results of an investigation conducted to determine the maturation stages and chromosomal composition of the Homophron americanum (Sand Beetle) found in North Texas.

Au cours de la spermiogenèse, les spermatides entreprennent une importante étape de remodelage de chromatine au cours de laquelle nous avons précédemment observé chez la souris, la présence de cassures transitoires d’ADN dans toutes les spermatides, un résultat qui fût également observé par notre groupe chez l’humain. De plus, il a été démontré qu’une fraction importante de ces cassures étaient bicaténaires. Compte tenu du caractère haploïde des spermatides, la recombinaison homologue ne peut avoir lieu, ne laissant recours qu’à des mécanismes de jonction d’extrémités connus pour les insertions, les délétions ainsi que les translocations chromosomiques qu’elles occasionnent. Nous avons donc proposé que ces cassures, intrinsèques au processus de maturation de cette cellule, puissent représenter une nouvelle source de variabilité génétique. Certains cas pathologiques dans lesquels la réparation d’ADN se ferait de façon dysfonctionnelle pourraient même mener à l’infertilité ou encore à la perte d’embryon. Étant donné la nouveauté de ces observations, les objectifs principaux furent d’effectuer un premier survol pour l’identification du ou des système(s) de réparation impliqué(s) durant le remodelage de chromatine et de tenter de préciser la voie de signalisation qui en est responsable. D’après la présence des protéines clés des voies de réparation possiblement impliquées dans les spermatides allongeantes murines, le D-NHEJ serait le système de réparation principalement utilisé dans la réparation de ces dernières, des expériences qui ne furent pas aussi concluantes chez l’humain. En parallèle, deux versions de MRE11 recombinantes ont été produites dans le but d’effectuer sous peu des tests fonctionnels de purification de complexes protéiques. La forme endogène de cette protéine est recrutée de façon précoce à tous les sites de cassures bicaténaires d’ADN, en faisant ainsi une excellente candidate pour confirmer les résultats obtenus chez la souris. Des analyses de colocalisation effectuées entre certaines protéines clés et yH2AFX, un marqueur normalement associé aux cassures bicaténaires d’ADN dans les cellules somatiques, n’ont pas été convaincantes. Ce résultat suggère que ce dernier ait une fonction autre dans les spermatides allongeantes. Comme notre groupe a préalablement obtenu des évidences suggérant que la TOPOIip soit à l’origine des cassures dans les spermatides allongeantes, cette hypothèse fut vérifiée en tentant de diminuer leur création en incubant les spermatides en présence de merbarone, un inhibiteur de TOPOII présélectionné in vitro.Encore quelques travaux restent à faire étant donné que l’entrée de la merbarone dans les noyaux des spermatides n’a pas pu être confirmée mais la persistance de yH2AFX dans les spermatides allongeantes malgré l’inhibition des TOPOII tend à soutenir l’hypothèse proposée. Ces travaux constituent les premiers pas vers une meilleure compréhension de l’implication des systèmes de réparation d’ADN ainsi que du variant d'histone H2AFX durant le remodelage de chromatine de la spermiogenèse. Une meilleure caractérisation du système de réparation impliqué permettra de mieux comprendre les conséquences de ce processus endogène sur l’intégrité génétique du gamète mâle et sur sa contribution à l’ajout de polymorphisme dans la population.[ symboles non conformes]

Résumé : La phase haploïde de la spermatogenèse (spermiogenèse) est caractérisée par une modification importante de la structure de la chromatine et un changement de la topologie de l’ADN du spermatide. Les mécanismes par lesquels ce changement se produit ainsi que les protéines impliquées ne sont pas encore complètement élucidés. Mes travaux ont permis d’établir la présence de cassures bicaténaires transitoires pendant ce remodelage par l’essai des comètes et l’électrophorèse en champ pulsé. En procédant à des immunofluorescences sur coupes de tissus et en utilisant un extrait nucléaire hautement actif, la présence de topoisomérases ainsi que de marqueurs de systèmes de réparation a été confirmée. Les protéines de réparation identifiées font partie de systèmes sujets à l’erreur, donc cette refonte structurale de la chromatine pourrait être génétiquement instable et expliquer le biais paternel observé pour les mutations de novo dans de récentes études impliquant des criblages à haut débit. Une technique permettant l’immunocapture spécifique des cassures bicaténaires a été développée et appliquée sur des spermatides murins représentant différentes étapes de différenciation. Les résultats de séquençage à haut débit ont montré que les cassures bicaténaires (hotspots) de la spermiogenèse se produisent en majorité dans l’ADN intergénique, notamment dans les séquences LINE1, l’ADN satellite et les répétions simples. Les hotspots contiennent aussi des motifs de liaisons des protéines des familles FOX et PRDM, dont les fonctions sont entre autres de lier et remodeler localement la chromatine condensée. Aussi, le motif de liaison de la protéine BRCA1 se trouve enrichi dans les hotspots de cassures bicaténaires. Celle-ci agit entre autres dans la réparation de l’ADN par jonction terminale non-homologue (NHEJ) et dans la réparation des adduits ADN-topoisomérase. De façon remarquable, le motif de reconnaissance de la protéine SPO11, impliquée dans la formation des cassures méiotiques, a été enrichi dans les hotspots, ce qui suggère que la machinerie méiotique serait aussi utilisée pendant la spermiogenèse pour la formation des cassures. Enfin, bien que les hotspots se localisent plutôt dans les séquences intergéniques, les gènes ciblés sont impliqués dans le développement du cerveau et des neurones. Ces résultats sont en accord avec l’origine majoritairement paternelle observée des mutations de novo associées aux troubles du spectre de l’autisme et de la schizophrénie et leur augmentation avec l’âge du père. Puisque les processus du remodelage de la chromatine des spermatides sont conservés dans l’évolution, ces résultats suggèrent que le remodelage de la chromatine de la spermiogenèse représente un mécanisme additionnel contribuant à la formation de mutations de novo, expliquant le biais paternel observé pour certains types de mutations. / Abstract : Germline mutations may arise from several endogenous and exogenous mechanisms in both male and female. However, recent next-generation sequencing (NGS) data confirmed that de novo mutations arise primarily in males. This observation suggests that specific spermatogenesis events are involved in the male mutation bias. One potential origin for male-driven mutations is the differentiation of spermatids into spermatozoa, which involves one of the most striking and global chromatin remodeling processes, where histone-bound chromatin is converted into highly condensed protaminated DNA toroid. Using pulse-field gel electrophoresis and comet assay on flow cytometry sorted cells, it was established that chromatin remodeling process is characterized by a transient surge in DNA double strand breaks (DSBs) in the whole population of murine spermatids, which get repaired by the end of spermiogenesis. Using a highly active nuclear extract and immunofluorescences, topoisomerases and markers of DNA repair systems were shown at these steps. Since haploid cells cannot rely on homologous recombination for templated DNA repair, it was hypothesized that this process may be genetically unstable and largely responsible for the observed male de novo mutations bias. Although very challenging, a method allowing the specific genome-wide mapping of DSBs using NGS was developed to establish the genomic distribution of DSBs during chromatin remodeling. It was shown that intergenic regions were enriched in DSBs, particularly LINE1, satellite DNA and simple repeats. Motif finding on potential hotspots showed that proteins from FOX and PRDM families may be implicated. Although homologous recombination cannot take place during spermiogenesis, an enrichment in BRCA1 motif was found, which is also known to be implicated in NHEJ and removal of topoisomerase adducts. Topoisomerase-like SPO11 motif was also enriched suggesting that the meiotic machinery may also be implicated during chromatin remodeling. Moreover, although DSBs tend to accumulate in intergenic regions, gene ontology analysis of hotspot-containing genes showed a marked enrichment in genes related to neurons and brain development. This result hence supports the fact that neurological disease associated mutations are also male biased and associated with advanced paternal age. Since DSB formation during spermiogenesis is conserved through evolution, these results suggest that chromatin remodeling in spermatids represents a significant component in the reported male de novo mutation bias.