La phosphatase PPEF1 (protein phosphatase with EF-hand domain 1) est impliquée dans plusieurs processus cellulaires chez les mammifères comme la réponse aux stress, la survie cellulaire et la prolifération. Cette protéine est présente de manière universelle chez les eucaryotes et elle est majoritairement exprimée dans le cerveau des tissus fœtaux et dans les testicules. Une expérience ayant pour but d’étudier le rôle de la calmoduline dans les mécanismes entourant l’activité des spermatozoïdes nous a permis de découvrir cette phosphatase. PPEF1 n’a jamais été caractérisée dans un contexte reproductif, et a été très peu étudiée de manière plus générale comparativement aux autres phosphatases. Cette étude vise à élucider le rôle de cette phosphatase dans les spermatozoïdes et à vérifier notre hypothèse selon laquelle elle pourrait être impliquée dans la motilité et la capacitation des spermatozoïdes. Les résultats obtenus démontrent la présence de cette protéine et de ses transcrits dans les testicules et les spermatozoïdes. PPEF1 est localisée aux membranes et palmitoylée ; la protéine est relocalisée dans les spermatozoïdes au cours de leur capacitation. L’immunoprécipitation de PPEF1 a permis d’identifier des interacteurs possibles, impliqués dans les processus biologiques de capacitation et de motilité des spermatozoïdes, de même que dans l’interaction avec l’ovocyte. L’immunoprécipitation de PPEF1, de même qu’une protéine recombinante, nous ont permis de déterminer que PPEF1 possède une activité phosphatase. Les résultats obtenus corroborent l’hypothèse de départ. Davantage d’études seront toutefois nécessaires pour déterminer les cibles de déphosphorylation et les interacteurs de PPEF1 dans les spermatozoïdes. Il s’agit d’une première étude sur la phosphatase PPEF1 dans un contexte reproductif. / PPEF1 phosphatase (protein phosphatase with EF-hand domain 1) is involved in several cellprocesses such as stress response, cell survival and proliferation. This protein is ubiquitously expressed in eukaryotes, mostly in brain fetal tissues and in testis. A study to unravel the role ofcalmodulin in sperm function led us to the discovery of this phosphatase in spermatozoa. PPEF1 hasnever been studied in a reproductive context and has been poorly described compared to other phosphatases. The purpose of this study is to understand the role of this phosphatase in spermatozoa .Our hypothesis is that PPEF1 is involved in sperm motility and capacitation. Results show the presence of this protein and its transcript variants in testis and sperm cells. PPEF1 localizes to sperm membranes and is palmitoylated; the protein is relocated in spermatozoa during capacitation. Immunoprecipitation of PPEF1 led to the identification of putative interactors that are involved inbiological processes of capacitation and motility of spermatozoa, as well as in sperm-oocyte interaction. This protein shows a phosphatase activity when immunoprecipitated; it is also the case of a PPEF1 recombinant protein. Our results corroborate the initial hypothesis. Other studies will benecessary to identify the proteins de phosphorylated by PPEF1 and to confirm its interactions withother proteins in spermatozoa. It is the first study on the phosphatase PPEF1 in a reproductive context.

Sur onze familles actuellement connues, la phosphodiestérase 10 (PDE10) est une des plus récemment découverte. Si elle est surtout exprimée dans le cerveau (striatum), où elle a beaucoup été étudiée car impliquée dans plusieurs pathologies neurologiques, elle est aussi exprimée dans le testicule. Cette PDE est capable d'hydrolyser à la fois l'AMPc et le GMPc, mais est bien plus efficace sur le premier. Ce mémoire sera consacré à l'étude de la PDE10 dans le spermatozoïde, depuis sa découverte et sa caractérisation, jusqu'à des ébauches de pistes sur sa régulation et son rôle dans la physiologie spermatique. L'étude se concentrera principalement sur un modèle bovin, mais des aspects humains de la PDE10 spermatique y seront également abordés. On y apprendra que l'isoforme retrouvée chez le bovin est celle nommée PDE10X4 et que celle retrouvée chez l'humain lui est très similaire. La protéine est retrouvée dans la région acrosomale du spermatozoïde et semble plutôt cytosolique, même si une association aux membranes n'est pas exclue. La protéine semble faire partie de complexes protéiques de haut poids moléculaire dont les autres membres restent à déterminer. La régulation de PDE10 spermatique semble assez différente de ce que l'on retrouve dans le striatum, puisque dans le gamète mâle, on ne retrouve ni phosphorylation ni palmitoylation de PDE10. L'impact de PDE10 sur la phosphorylation des protéines et la motilité des spermatozoïdes est abordé. Pour terminer, PDE10 semble impliquée dans la réaction d'acrosome, mais son rôle précis reste encore à définir. / Eleven phosphodiesterases (PDE) families are actually known and PDE10 is one of the most recently discovered. It is expressed principally in the brain where it is involved in some mental disorders, and then well studied. But it is also expressed in the testis, where less is known. PDE10 can degrade both cAMP and cGMP but is way more potent with the first one. This memoir is about the situation of the PDE10 in the spermatozoa, from its characterization and localization to the first steps toward its regulation and its functions in the sperm physiology. Although we will focus on a bovine sperm model, we will also have a look on the situation in human spermatozoa. We show that the bovine PDE10 isoform found in the spermatozoa correspond to the predicted PDE10X4 sequence and that the one found in human spermatozoa is really similar. The protein localizes in the acrosomal region and is probably cytosolic, although we can't exclude an association to membranes. PDE10 seems to be part of high molecular weight protein complexes but we need to identify the other protein members. The regulation of PDE10 seems different in spermatozoa than in the striatum where the protein is spatially and functionally regulated by phosphorylation and palmitoylation. These two events don't occur in the male gamete. We will consider the impact of the PDE10 on the protein phosphorylation status and on the control of the motility. In the end, we PDE10 seems to have an impact on the acrosomal reaction, but further work is needed to understand its precise role.

Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) est une protéine spermatique possédant une activité hyaluronidase dans son domaine N-terminal, contribuant à la dispersion des cellules du cumulus entourant l’ovocyte. Elle possède aussi une capacité de liaison à la zone pellucide (ZP) dans son domaine C-terminal. Nos études précédentes chez le taureau ont démontré la présence de deux isoformes potentielles de SPAM1 de ~70 et 80 kDa. Ces mêmes études ont permis d’émettre l’hypothèse que ces deux isoformes de SPAM1 ont des domaines C-terminaux différents, des origines différentes (testicule ou épididyme) et sont localisées dans la région acrosomale ou post-acrosomale du spermatozoïde. Puisque le domaine C-terminal est impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, nous voulions caractériser les deux domaines C-terminaux afin de mieux connaître le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. Deux transcrits de Spam1 ont été trouvés dans les tissus testiculaires et épididymaires. Ces transcrits possèdent une identité dans leur séquence nucléotidique en 3’ de la région codante, mais diffèrent par la présence ou l’absence de 90 nucléotides (exon 3 du gène Spam1). Nous avons identifié PH-20, une homologue potentielle de SPAM1 chez l’espèce bovine. Puisque SPAM1 et PH-20 sont similaires en N-terminal, notre anticorps dirigé contre la portion N-terminale de SPAM1 pourrait, théoriquement, reconnaître PH-20. Pour confirmer ceci, nous avons tenté de produire une protéine recombinante PH-20, mais sans succès. Nous voulions déterminer si SPAM1 fait partie d’un complexe multiprotéique impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, tel que rapporté chez l’humain. Nos résultats suggèrent que SPAM1 est associée aux protéines d’ancrage AKAPs, retrouvées majoritairement au niveau de la gaine fibreuse du flagelle des spermatozoïdes. La caractérisation des isoformes de SPAM1, de son homologue PH-20, ainsi que des complexes multiprotéiques dont fait partie SPAM1 sont importantes afin d’approfondir nos connaissances sur le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. / Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) is a sperm protein that has a hyaluronidase activity in its N-terminus, aiding in the dispersal of the cumulus cells surrounding the egg. It also has a zona pellucida (ZP) binding activity in its C-terminus. Our previous studies showed that there are two potential SPAM1 isoforms that have a molecular weight of ~70 and 80 kDa in the bovine species. From these studies, we hypothesized that these two SPAM1 isoforms had different C-terminal domains, different origins (testis or epididymis) and were localised in the acrosomal or post-acrosomal regions of spermatozoa. Seeing as it is the C-terminal domain that is involved in ZP binding, we aimed to characterize the two C-terminal domains in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions. Although the 3’ nucleotide sequences were identical, two Spam1 transcripts varying by the presence or absence of 90 nucleotides (exon 3 of the Spam1 gene) were found in both testicular and epididymal tissues. During our studies, we also identified PH-20, a potential SPAM1 homolog. In order to determine if PH-20 is one of the two potential SPAM1 isoforms that is recognized by our antibody directed against the N-terminal domain, we attempted the production of a PH-20 recombinant protein, without success. We also sought to determine if SPAM1 is part of a multimeric protein complex involved in spermatozoa-ZP interactions, as reported in humans. Our results suggest that SPAM1 is associated with AKAPs, which are anchoring proteins abundantly found in the fibrous sheath of sperm flagella. Characterizing the SPAM1 isoforms, its homolog PH-20, as well as the multimeric protein complexes SPAM1 is part of, are important in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions.

Au cours de la cryoconservation, le spermatozoïde subit d'importants dommages. Ces dommages prennent la forme de perte de motilité ainsi que de dommages sous-létaux à différents niveaux. Parmi ces derniers certains effets cryo-capacitants sont de plus en plus documentés. Ils contribuent à diminuer la durée de vie et à réduire le pouvoir fécondant du spermatozoïde cryoconservé. Au cours de cette étude, nous avons étudié le comportement de quatre marqueurs spécifiques de compartiments subcellulaires différents suite à la cryoconservation du sperme humain. La protéine P34H, l'a-tubuline, l'acrosine et les phosphotyrosines représentaient respectivement, la membrane plasmique, le cytosquelette, la matrice acrosomale (via l'entrée de calcium) et les voies de signalisation intracellulaires. Chaque marqueur a été étudié avant et après cryoconservation. Une perte de 50% de la protéine P34H, une augmentation de détection de 200% de l'a-tubuline, une activation de la pro-acrosine en sa forme active, la p-acrosine, et une augmentation de la phosphorylation de deux protéines en leurs résidus tyrosine ont été observées. De plus, l'augmentation de détection de l'a-tubuline s'est révélée proportionnelle au temps d'entreposage dans l'azote liquide, une différence significative étant présente dès 15 semaines d'entreposage. À la lumière de ces résultats, il apparaît évident que la cryoconservation du sperme humain est associée à des cryo-dommages sous-létaux prenant place dans différents compartiments de cette cellule hautement spécialisée. Ces dommages contribuent certainement à la perte de pouvoir fécondant observée dans le sperme cryoconservé.

Les spermatozoïdes complètent l'acquisition de leur pouvoir fécondant lors d'un processus de maturation post-éjaculatoire nommé la capacitation. Ce processus nécessite un ensemble de modifications membranaires et intracellulaires, dont l'augmentation de la phosphorylation en tyrosine des protéines. Différentes enzymes à activité tyrosine kinase participent à cette augmentation mais aucune n'a été trouvée responsable de la totalité des événements de phosphorylation en tyrosine associés à la capacitation. L'expression de la Janus kinase (JAK) 1 fut récemment démontrée dans les spermatozoïdes. Toutefois, sa contribution à l'augmentation du contenu en phosphotyrosine des protéines n'est pas déterminée. Dans les cellules somatiques, les substrats des JAKs sont des facteurs de transcription de la famille des signal transducer and activator of transcription (STAT). Cette cascade de signalisation intervient dans une multitude de processus biologiques et est activée en réponse à la liaison des cytokines et des facteurs de croissance. Bien que l'expression du récepteur de l'interleukine-6 (IL-6) et de certains membres de la famille des STATs a préalablement été rapportée dans les spermatozoïdes, leur rôle lors du processus de capacitation n'est pas encore déterminé. Le but de ce projet de doctorat consistait donc à caractériser les intermédiaires de la voie JAK/STAT présents dans les spermatozoïdes humains. J'ai d'abord confirmé la présence du récepteur de 1TL-6 à la surface membranaire des spermatozoïdes sans qu'il soit possible, toutefois, de démontrer son activation et d'identifier des substrats potentiels de JAK1. De façon surprenante, les facteurs de transcription STAT1, 3, 4, 5 et 6 sont tous détectés dans les spermatozoïdes. À l'exception de STAT4, présent au niveau de la thèque périnucléaire, tous ces intermédiaires sont associés aux structures cytosquelettiques du flagelle. La localisation cellulaire des STATs ajoutée à l'absence d'activité de transcription dans les spermatozoïdes suggèrent fortement que ces protéines jouent un rôle moins classique dans les gamètes mâles matures. L'inhibition de STAT3 lors du processus de capacitation produit une baisse de la motilité et une altération de la fonction mitochondriale. Les résultats de cette étude sont en accord avec un rôle de STAT3 dans des activités indépendantes de son activité de facteur de transcription et reliées à la survie des spermatozoïdes lors des événements précédents la fécondation. Enfin, j'ai tenté d'explorer l'implication de STAT3 dans la voie dépendante de l'AMPc. Cette dernière étude suggère qu'une voie de signalisation commune mène à l'activation de la protéine kinase dépendante de l'AMPc et a permis d'identifier un nouveau substrat potentiel de cette enzyme dans les spermatozoïdes, soit la triosephosphate isomérase.

La fécondation dépend de la capacité de deux cellules uniques à s’unir :l’ovocyte et le spermatozoïde. Alors que le stock d’ovocytes est établi dès la puberté, les spermatozoïdes sont produits de façon continue à partir d’une réserve de cellules germinales souches (spermatogonies). Immobile et inapte à la fécondation, le spermatozoïde testiculaire doit subir un processus de maturation qui débute dans l’épididyme et se poursuit dans les voies génitales femelles. Bien qu’une première forme de mobilité soit acquise au contact du fluide épididymaire, le spermatozoïde subit, tout au long de son parcours dans le tractus femelle, de nombreuses modifications structurelles et biochimiques appelées « capacitation » et qui s’avèrent indispensables à l’acquisition de son pouvoir fécondant. La production de spermatozoïdes fertiles est un processus hautement régulé, notamment via l’ion calcium ;second messager crucial de nombreux processus de signalisation intracellulaire. Les modifications de la concentration intracellulaire de calcium sont indispensables pour le développement du potentiel de fécondation du sperme via la modification du profil de mobilité vers l’hyperactivation ou encore la réalisation de la réaction acrosomiale. Différents mécanismes de régulation de la concentration intracellulaire calcique ont déjà été mis en évidence dans les spermatozoïdes :canaux calciques, réserves intracellulaires de calcium… Toutefois, peu d’informations relatent la présence et/ou l’implication de protéines liant le calcium (Calcium-Binding Proteins - CaBP) au sein de ce type cellulaire.Notre étude a pour but de caractériser la présence et l’implication potentielle de EF-Hand CaBP dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes murins. Nous nous sommes principalement focalisés sur l’étude de trois membres de cette famille protéique :la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine. Nos investigations ont été menées de manière comparative entre des spermatozoïdes de type Wild-type (WT) et des spermatozoïdes n’exprimant pas une ou plusieurs CaBP (calrétinine knock-out - CR-/-, calbindine D-28k - knock-out CB-/-, triple knock-out pour la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine - CR-/-CB-/-PV-/-). La première partie de notre projet décrit la localisation et l’expression de la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine dans les spermatozoïdes de souris et de rats par immunofluorescence et Western blotting. Ces protéines ont été localisées au niveau de la pièce principale du flagelle et au niveau de la Redundant Nuclear Envelope dans le cas de la parvalbumine. Au cours de la seconde partie du projet, des études de mobilité ainsi que des quantifications du taux de réaction acrosomiale ont été menées en comparant les spermatozoïdes WT aux cellules CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/-. Alors qu’aucune différence n’a été constatée entre les taux de réaction acrosomiale WT versus knock-out tant en condition basale qu’induite, l’absence d’une ou plusieurs protéines apparaît influencer certains paramètres de mobilité des spermatozoïdes. En effet, les spermatozoïdes CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/- ont présenté une fréquence du battement de flagelle (BCF) plus élevée par rapport à la fréquence mesurée chez les spermatozoïdes WT, paramètre modifié notamment au cours de l’hyperactivation. Cette différence pourrait être liée à une modification du tamponnage calcique ou à une régulation différente du canal calcique CatSper, acteur majeur du développement de l’hyperactivation. Les résultats préliminaires des mesures électrophysiologiques suggèrent un rôle potentiel de la calrétinine dans la régulation de l’activité de ce canal. Par ailleurs, la comparaison entre le nombre de petits par portées WT par rapport aux portées CR-/- ou CR-/-CB-/-PV-/- a indiqué que l’absence d’expression d’une ou plusieurs EF-Hand CaBP réduisait le nombre de naissances par portée au sein des génotypes knock-out.En conclusion, l’ensemble de nos résultats expérimentaux ont démontré la présence de trois EF-Hand CaBP au niveau des spermatozoïdes murins et permis d’apporter de nouvelles informations quant à l’implication potentielle de celles-ci dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans les troupeaux laitiers, le succès de l'insémination artificielle dépend, en grande partie, de la qualité de la semence. D est important de disposer de techniques analytiques fiables permettant d'évaluer la qualité de la semence. Actuellement, aucun paramètre pris isolément n'est corrélé de façon satisfaisante à la fertilité. L'évaluation multiparamétrique de la semence est une option intéressante pour améliorer l'efficacité des tests de fertilité. Ce mémoire porte sur la caractérisation, via la cytometric en flux, des spermatozoïdes bovins cryopréservés. Différents paramètres ont été étudiés tels que la viabilité, l'activité mitochondriale, l'intégrité de la membrane acrosomale, le pH intracellulaire, le Ca2+ intracellulaire et celui emmagasiné dans la cellule. Ces paramètres ont été évalués postdécongélation et suite à cinq heures d'incubation en présence ou non d'héparine comme inducteur de la capacitation. Pour chacune des conditions, on a étudié les effets et les interactions de chacun des paramètres et leur relation avec la fertilité in vivo.

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3- EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic- that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

En raison de préoccupations environnementales, économiques et sociales, de nombreux efforts ont été déployés au cours des dernières années afin de développer de nouvelles voies de valorisation des co-produits issus de l'industrie de transformation du poisson. À cet effet, il a été constaté que la transformation de ces co-produits en hydrolysats représentait une avenue d'intérêt puisque celle-ci permettait de produire des ressources ayant des activités biologiques. Toutefois, malgré ces aspects prometteurs, les hydrolysats de poisson présentent également l'inconvénient majeur d'être associés à des odeurs déplaisantes ce qui limite leur utilisation. Ainsi, le développement d'une méthode de désodorisation efficace revêt, dans ce contexte, un caractère crucial. L'objectif principal de cette thèse était de développer une méthode de désodorisation appliquée à un hydrolysat de laitance de hareng en évaluant, pour ce faire, la performance des procédés d'électrodialyse (ED) et de désaération à réduire le contenu odorant de cet hydrolysat. Dans un premier temps, le contenu odorant de l'hydrolysat de laitance de hareng a été caractérisé. Il a alors été démontré que le contenu odorant de cet hydrolysat comprenait 15 composés considérés comme principaux contributeurs à son odeur ainsi que les molécules de diméthylamine (DMA), triméthylamine (TMA) et d'oxyde de triméthylamine (TMAO). Ensuite, la performance des procédés d'ED et de désaération à réduire ce contenu odorant a été évaluée. L'ED ne s'est pas avérée performante à des fins de désodorisation et ce, indépendamment des conditions de pH et de courant testées. En revanche, le procédé de désaération a permis de réduire le contenu des composés considérés comme ayant une contribution significative à l'odeur de l'hydrolysat lorsque le traitement a été conduit à pH 7. Également, il a été constaté que la simple basification de l'hydrolysat à pH 10 permettait de conduire à une diminution significative du contenu des principaux contributeurs à l'odeur de ce dernier. Dans un second temps, puisque le traitement de désaération à pH 7 ainsi que la simple basification ont été identifiés comme des avenues d'intérêt afin de réduire le contenu odorant de l'hydrolysat de laitance de hareng, un intérêt particulier a été porté à ces deux conditions. Plus précisément, comme les solutions d'hydrolysat correspondant à ces conditions avaient subi en premier lieu un ajustement de pH puis un brassage d'une nuit sous inertie avant que d'être finalement traitées ou non par désaérateur, il demeurait indispensable de venir préciser le rôle respectif de chacune de ces étapes sur le contenu odorant ciblé. Il a alors été démontré que le brassage sous inertie n'avait aucun impact sur le contenu odorant ciblé contrairement au pH et au désaérateur. En effet, à pH 7, le désaérateur s'est avéré performant pour réduire le contenu des principaux contributeurs à l'odeur de l'hydrolysat du fait de leur meilleure disponibilité. A contrario, le traitement de désaération à pH 10 s'est accompagné d'une diminution dans le contenu en TMA et en DMA du fait de leur meilleure disponibilité sous de telles conditions. Finalement, lorsque la combinaison d'un traitement de désaération à pH 7 et d'une basification subséquente a été évaluée, une baisse significative du contenu des principaux contributeurs à l'odeur de l'hydrolysat a également été observée. Les analyses sensorielles ont confirmé que la combinaison d'un traitement de désaération à pH 7 et d'une basification subséquente ainsi que le simple traitement de désaération à pH 10 étaient les conditions les plus optimales pour désodoriser l'hydrolysat de laitance de hareng. Finalement, la méthode de désodorisation a été optimisée. À cet effet, la combinaison de traitements de désaération en conditions neutre et basique peut être considérée comme l'avenue la plus optimale afin de désodoriser l'hydrolysat de laitance de hareng. La performance de ces résultats a également été démontrée d'un point de vue sensoriel. De plus, un tel traitement n'a pas affecté la capacité antioxydante de l'hydrolysat de laitance de hareng. Ainsi, les travaux entrepris dans le cadre de cette thèse ont permis de développer une méthode de désodorisation efficace et simple d'utilisation d'un hydrolysat de laitance de hareng. Ceci offre donc l'opportunité d'accroître le potentiel d'utilisation de cette ressource d'intérêt. / Due to environmental, economic and social concerns, many efforts have been made over the past few years to develop new valorization ways of by-products originating from the fish processing industry. For this purpose, the transformation of these by-products into hydrolysates was perceived as a promising avenue since it could result in the production of resources evidencing biological activities. Nevertheless, in spite of these promising aspects, fish hydrolysates present as well the major drawback to be associated with off-flavors limiting their use. Therefore, the development of an effective deodorization method appears to be, in this context, of significant importance. The main objective of this thesis was to develop a deodorization method applied to herring milt hydrolysate by assessing, to do so, the performance of electrodialysis (ED) and deaeration processes to reduce the odorous content of this hydrolysate. Firstly, the odorous content of herring milt hydrolysate was characterized. It was demonstrated that the odorous content of this hydrolysate included 15 compounds considered as being the main contributors to its odor as well as the molecules of dimethylamine (DMA), trimethylamine (TMA) and trimethylamine oxide (TMAO). Then, the performance of ED and deaeration processes to reduce this odorous content was assessed. At that stage, it was noticed that ED was not effective for deodorization purposes, independently of the pH and current conditions. On the contrary, the deaerator was efficient to reduce the content of the compounds considered as being the most potent odor-active ones of the hydrolysate while the treatment was conducted at pH 7. Also, it was found that the simple basification of the hydrolysate at pH 10 led to a significant decrease in the content of the most potent odor-active compounds. Secondly, since the deaerator treatment at pH 7 and the simple basification were identified as avenues of interest to reduce the odorous content of herring milt hydrolysate, a particular attention was paid regarding these two conditions. More precisely, since such results were obtained on herring milt hydrolysate solutions whose pH was first adjusted either to 7 or 10 before being stirred overnight with nitrogen and then treated or not by deaerator, in order to develop an optimal deodorization method, it remained essential to clarify the respective role of each of these steps. It was demonstrated that the overnight stirring had no impact on the targeted odorous content on the contrary to pH and deaeration step. In fact, at pH 7, the deaerator was shown to be effective to reduce the content of the most potent odor-active compounds of herring milt hydrolysate due to their better availability. On the contrary, the deaerator treatment at pH 10 was shown to be effective to reduce the DMA and TMA contents due to their better availability under such conditions. Finally, while the combination of the deaerator treatment at pH 7 and the subsequent basification was assessed, a significant decrease in the content of the most potent odor-active compounds was observed as well. Sensory analyses confirmed that the combination of deaerator treatment at pH 7 and subsequent basification as well as a simple deaerator treatment at pH 10 were the most optimal conditions for the deodorization of herring milt hydrolysate. Finally, the deodorization method by deaerator was optimized. Deaerator treatments under neutral and basic conditions could be considered as the most optimal avenue for the deodorization of herring milt hydrolysate. The performance of these results was demonstrated from a sensorial point of view as well. Also, such treatment had no impact on the antioxidant capacity of herring milt hydrolysate. This thesis work allowed to develop an effective and easy-to-use deodorization method of herring milt hydrolysate. Therefore, this represents the opportunity to increase the potential for the use of this valuable resource.