L’abeille domestique (Apis mellifera Linnaeus) joue un rôle crucial comme pollinisateur dans l’industrie de l’agriculture. Cependant, durant les dernières décennies, une mortalité des colonies d’abeilles a été observée partout à travers le monde. La conservation du sperme d’abeille est un outil efficace pour sauvegarder la diversité génétique. Sa conservation est possible à température pièce, mais la cryoconservation serait une meilleure méthode pour la conservation à long terme. Notre objectif général est de développer une méthode de cryoconservation de la semence d’abeille. L’hypothèse no.1 était que la cryoconservation de la semence d’abeille est plus efficace à long terme que les températures au-dessus de 0 °C. Nous avons évalué l’efficacité, basé sur la viabilité des spermatozoïdes, de deux températures de conservation: -196 °C et 16 °C. Après un an de conservation, la semence congelée avait une meilleure viabilité comparée à 16°C (76% ± 5% vs 0%; p < 0,05). Par la suite, la spermathèque des reines inséminées avec la semence cryoconservée a été évaluée par la migration des spermatozoïdes ainsi que la viabilité des spermatozoïdes. Il y avait beaucoup de variabilités dans nos résultats. Nous n’avons pas été en mesure de vérifier si l’ajout de la centrifugation après la conservation améliore la fertilité des reines après insémination. Toutefois, nos résultats confirment que la cryoconservation est une technique efficace pour conserver la semence d’abeille à long terme. / Honey bees (Apis mellifera Linnaeus) are critical players in the agricultural industry for food production as they account for the vast majority of insect pollination. In the last decades, however, there have been dramatic losses of honey bee colonies worldwide. Coupled with instrumental insemination, conservation of honey bee sperm is an effective strategy to protect the species and their genetic diversity. Sperm storage is possible at room temperature, but for many mammal species, cryopreservation is the preferred method for the long-term storage of gametes. However, cryopreservation of honey bee drone semen is not optimized. Our overall objective is to develop a method of drone semen cryopreservation, therefore, two experiments were conducted. Hypothesis #1 was that cryopreservation of drone semen is more effective for long-term storage than at above-freezing temperatures. We therefore compared the efficacy based on sperm viability, of two honey bee semen preservation temperatures: frozen (-196°C) and 16°C. After 1 year of storage, frozen sperm viability was higher than at 16°C (76% ± 5% vs. 0%; p < 0.05), showing that cryopreservation is necessary to conserve semen in vitro. However, the cryoprotectant used for drone sperm freezing, DMSO (dimethyl sulfoxide), is toxic to queens after instrumental insemination. Hypothesis #2, therefore, was that centrifugation of cryopreserved semen to remove DMSO prior to insemination improves queen fertility. Our results indicate that centrifuging semen does not affect sperm viability (78% ± 3% vs 75% ± 4% viable sperm; p > 0.05). After queen insemination, both spermathecae and brood production were evaluated, but the results varied greatly, possibly due to the undesirable mucus present in the semen. Therefore, we cannot yet confirm that centrifugation improves queen health after insemination. Nonetheless, our study confirms that cryopreservation of honey bee sperm is necessary and possible for long-term conservation.

La protéine Spam-1, qui est présente à la surface des spermatozoïdes, faciliterait le passage des gamètes mâles à travers le cumulus, en coupant les liens d’acide hyaluronique présents entre les cellules, et serait impliquée dans le processus de liaison secondaire des spermatozoïdes à la zone pellucide de l’ovule. Le but de cette étude, par la construction de protéines recombinantes fluorescentes contenant la séquence des différents domaines fonctionnels de Spam-1, est de démontrer que la protéine spermatique bovine Spam-1 se lie directement à la zone pellucide de l’ovule et de clairement démontrer que c’est la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée. Les résultats obtenus dans le présent mémoire permettront de déterminer l’importance de Spam-1 dans la liaison du spermatozoïde à l’ovule au moment de la fécondation et ainsi de mieux caractériser les mécanismes d’interaction sperme/ovule. / Spam-1 is a sperm surface protein that would help the spermatozoa going through the cumulus, disrupting the hyaluronan around the egg. It would also have a role to play in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida of the oocyte. The aim of the present study, by the construction of various fluorescent recombinant proteins containing the sequences of the different domains of Spam-1, is to clearly demonstrate that bovine spermatic Spam-1 protein is directly implicated in the secondary binding of the spermatozoa to the zona pellucida and to show that the C-terminal domain is implicated. The results of this study are going to determine the importance of Spam-1 in the spermatozoa binding to the zona pellucida and in getting a better understanding of the mechanisms surrounding the interactions between spermatozoa and oocyte.

Les Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERKs) appartenant à la famille des MitogenActivated Protein Kinases (MAPKs) sont des protéines impliquées dans les voies de transduction cellulaires. Récemment, des équipes de recherche ont démontré la présence des ERKs chez les spermatozoïdes humains et une implication possible lors de la capacitation et de la réaction acrosomiale. Cependant, étant donné l'enchevêtrement des diverses voies de signalisation chez le spermatozoïde, la voie des ERKs demeure un sujet d'études complexe et controversé. De plus, les effecteurs ainsi que les substrats de cette voie ne sont pas encore identifiés. Nous avons démontré la présence des ERKs chez les spermatozoïdes porcins. Notre hypothèse est que les ERKs sont impliquées lors de la capacitation et la réaction acrosomiale chez les spermatozoïdes porcins. Nos résultats démontrent que bien que les ERKs soient sous leur forme active lors de la capacitation, elles n'auraient pas de rôle essentiel lors de la capacitation et la réaction acrosomiale chez les spermatozoïdes porcins.

La fertilité mâle se définit comme étant la capacité de l'individu à produire des spermatozoïdes fonctionnels et à les livrer au tractus génital femelle. Les variations de fertilité interindividuelles sont tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme. tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Pas de résumés / No abstract

La valeur sélective (succès reproducteur) du mâle se traduit par son nombre d'accouplements et sa descendance obtenue par accouplement (Dewsbury, 1982; Simmons, 2001). Le succès reproducteur d'un mâle dépend essentiellement du nombre de ses spermatozoïdes qui réussissent la fécondation des œufs. En situation de compétition, un mâle doit maximiser son succès reproducteur par rapport à ses rivaux. Chez les insectes, lors des accouplements multiples de la femelle, il peut y avoir une compétition spermatique entre les éjaculats de différents mâles au sein de l'un (des) organe(s) de stockage. Le principal outil d'étude de la compétition spermatique est le suivi de la paternité des descendants. Un mutant récessif du caractère de la couleur des yeux (yeux rouges) a été utilisé pour étudier les différences dans la capacité d'accouplement et de fertilisation chez les mâles Anisopteromalus calandrae (Hymenoptera, Chalcidoidea, Pteromalidae). Ce travail de laboratoire a porté sur l'étude du succès reproducteur des mâles en relation avec leur réserve de spermatozoïdes disponible. Notre étude a porté dans un premier temps sur la quantification du stock de spermatozoïdes des mâles en fonction de différents traits d'histoire de vie (âge, expérience sexuelle) et de leur phénotype. Dans un second temps, l'étude du succès reproducteur des mâles en relation avec leur nombre de spermatozoïdes disponibles a été réalisée lors d'accouplements simples, d'accouplements multiples et en situation de compétition entre deux mâles. Les conséquences des accouplements doubles de la femelle sur la paternité des descendants des mâles de statuts différents (vierges 1 jour, vierges 21 jours, ou sexuellement expérimentés) ont été identifiées par l'utilisation du marqueur génétique de paternité (la couleur des yeux).<br />Les résultats montrent que (1) les mâles aux yeux rouges (R) et les mâles aux yeux foncés (W) sont différents dans leur capacité d'accouplement mais que les femelles R s'accouplent indifféremment avec les mâles des deux phénotypes. (2) Le comptage des spermatozoïdes dans les vésicules séminales des mâles vierges de 1 jour montre que les mâles R ont environ 1,46 fois plus de spermatozoïdes que les mâles W (4545 vs 3116). Les mâles expérimentés ont seulement 15% à 25% du stock initial d'un mâle vierge du même âge. Un mâle vierge de 21 jours a environ 1,8 fois plus de spermatozoïdes qu'un mâle vierge de 1 jour dans les deux morphes. (3) Après un accouplement simple des mâles, les nombres moyens de spermatozoïdes stockés dans la spermathèque des femelles ne sont pas différents entre eux (en moyenne 143 spermatozoïdes). (4) Les femelles réalisant des accouplements doubles n'augmentent pas leur stockage spermatique (193 spermatozoïdes pour deux accouplements vs 161 pour un), ni leur fécondité (respectivement 130 vs 108 descendants). (5) Un accouplement est suffisant pour assurer leur fécondité durant la vie reproductive des femelles et la sex-ratio est biaisée en faveur des femelles (environ 0,79). Les femelles accouplées avec les deux mâles de morphes différents produisent des descendants des deux phénotypes durant leur vie reproductive, quel que soit l'ordre des mâles dans la séquence de copulation. (6) Après une compétition entre deux mâles différents par leur phénotype, par leur âge ou par leur expérience sexuelle, c'est toujours le mâle ayant le plus de spermatozoïdes dans les vésicules séminales qui est le plus représenté dans la descendance quelle que soit la combinaison d'accouplement. Ces résultats concernant la paternité des descendants après une compétition entre deux mâles correspondent parfaitement à une loterie honnête, « fair raffle » proposée par Parker en 1990. (7) Quant à la quantité de spermatozoïdes transférés à la femelle, aucune augmentation ni diminution n'a été mise en évidence contrairement à ce qui est prédit par les théories concernant le risque de compétition spermatique ou l'intensité de compétition spermatique.

L’obtention de spermatozoïdes fécondants est un processus long et multi étapes, débutant par la production des gamètes mâles dans le testicule. Les spermatozoïdes sont ensuite successivement maturés au cours du transit épididymaire puis lors de leur passage dans les voies génitales femelles au cours du processus de capacitation. Ces étapes de maturation post-testiculaires concernent notamment la composition lipidique du gamète pour lui permettre d’acquérir une fluidité membranaire essentielle à la fécondation. Les résultats présentés dans cette thèse mettent en évidence l’importance de l’homéostasie lipidique épididymaire pour la maturation lipidique des spermatozoïdes et l’acquisition du pouvoir fécondant. Au niveau moléculaire cette homéostasie lipidique est régulée par les isoformes α et β des LXRs, les récepteurs nucléaires des oxystérols (NR1H3 et NR1H2, respectivement). Un régime alimentaire enrichi en cholestérol chez des souris jeunes invalidées pour les LXRs entraîne une infertilité avec une atteinte spécifique de l’épididyme. La maturation épididymaire des spermatozoïdes est alors altérée, entraînant des défauts de compositions lipidiques et protéiques de la membrane plasmique spermatique. Ces défauts ont des répercussions délétères sur la capacitation, issues de perturbations des flux calciques et de la tyrosine phosphorylation. En plus de leurs répercussions endocriniennes, les dyslipidémies semblent également affecter la maturation post-testiculaire. Ces résultats sont à considérer dans le cadre des protocoles de PMA puisque le bilan lipidique plasmatique ne fait pas partie des examens classiques des couples en PMA. Or en France, 55% des hommes entre 30 et 54 ans sont atteints d’une dyslipidémie. Ces désordres métaboliques lipidiques pourraient altérer la maturation post-testiculaire des gamètes, provoquant un certain nombre d’infertilités et/ou d’échecs en PMA. / The acquisition of fertile spermatozoa is a long and multi-stage process, beginning with the production of male gametes in the testis. Spermatozoa then undergo two successive maturation steps, first during the epididymal transit and then in the female genital tract during the capacitation process. The post-testicular maturation particularly impacts sperm lipid composition, leading to a higher membrane fluidity considered to be essential for fertilization. The results presented in this work show the importance of epididymal lipid homeostasis for sperm lipid maturation and acquisition of fertilizing ability. At the molecular level, lipid homeostasis is regulated by the LXRs (α and β isoforms), the oxysterol nuclear receptors (NR1H3 and NR1H2, respectively). A cholesterol-enriched diet in young LXR-null mice leads to infertility with a specific epididymal alteration. Sperm epididymal maturation is altered, leading to defects in lipid and protein composition of the spermatic plasma membrane. These defects have detrimental effects on the capacitation process, characterized by disturbances of calcium flows and tyrosine phosphorylation. In addition to their endocrine effects, dyslipidemia also appear to affect post-testicular maturation. These results have to be considered in the context of ART protocols, since the plasma lipid status is not part of the routine examinations for couples in ART protocols. Concomitantly, in France, 55% of men aged 30-54 are dyslipidemic, suggesting that these lipid metabolic disorders could alter sperm post-testicular maturation, causing a number of infertility and / or ART failures.

L’infertilité masculine est actuellement considérée comme un problème majeur qui pose une situation alarmante sur la santé publique. L’oligozoospermie, l’asthénozoospermie et la tératozoospermie sont les trois anomalies les plus connues des spermatozoïdes. Elles affectent, respectivement, la densité, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes. Un spermatozoïde anormal est très souvent corrélé à des altérations génétiques et épigénétiques qui peuvent affecter considérablement le transcriptome. Dans ce sens, le séquençage aléatoire du transcriptome entier des spermatozoïdes ou RNA-seq constitue un outil puissant pour caractériser ces maladies. Jusqu’à présent, il n’existe aucune étude exploitant des données RNA-seq chez des hommes présentant de telles anomalies spermatiques. L’objectif principal de notre étude fût d’identifier des profils distincts des modifications du transcriptome de chaque phénotype d’infertilité pour ainsi révéler des gènes-signatures qui tamponnent une spermatogenèse pathologiquePour ce faire, les transcriptomes des spermatozoïdes de 60 sujets infertiles atteints soit d’oligozoospermie, d’asthénozoospermie ou de tératozoospermie ont été comparés à ceux de 20 patients fertiles. Ces analyses supervisées nous ont conduit à identifier: (i) les gènes clés spécifiques aux différentes anomalies des spermatozoïdes (ii) les voies de signalisation associées, (ii) les différents longs ARNs non codants dérégulés dans ces anomalies. Au niveau de l’oligozoospermie, les transcrits de spermatozoïdes dérégulés étaient associées à divers stades de la spermatogenèse, y compris le cycle cellulaire méiotique, l’assemblage du complexe synaptonémal, la cohésion des chromatides sœurs, les processus métaboliques de piRNA, le processus catabolique protéique dépendant de la voie de l’ubiquitine, à la réponse aux dommages de l'ADN et particulièrement le processus de fécondation. Quant à l’asthenozoospermia, la spermatogenèse, l’assemblage du cil, des voies métaboliques reliées à la spermatogenèse, la chimiotaxie et la physiologie des cellules immunitaires ont été significativement dérégulés. De plus, ce qui nous a intéressé au plus était l’analyse des transcrits sous-exprimés qui a permis l’identification de nombreux transcrits associées aux modifications des histones. Nous avons aussi mis en évidence une sous expression des gènes différentiellement exprimés qui définit la tératozoospermie. Cette sous expression est associée au système ubiquitine-protéasome, à l’organisation du cytosquelette, au cycle cellulaire, à la SUMOylation en réponse aux dommages de l'ADN et aux protéines de réparation ainsi qu’à de nombreux modulateurs épigénétiques. Les gènes signature de l'oligozoospermie ont été liés au processus de fécondation et les composants de la matrice extracellulaire, tandis que ceux de la tératozoospermie sont liés à la spermatogenèse et la morphogenèse cellulaire, alors que les gènes signature de l'asthénozoospermie sont impliqués dans l'assemblage du ribosome et du flagelle. En complément de cette étude, nous avons réalisé une étude très globale du paysage épigénétique du sperme des hommes infertiles. Nous avons, ainsi comparé les niveaux des espèces réactives de l’oxygène (ERO), de méthylation de l’ADN, ainsi que l’intégrité de la chromatine dans les spermatozoïdes de 30 individus infertiles avec ceux de 33 individus fertiles. Nos analyses montrent des niveaux élevés d’ERO chez les individus infertiles. Ces niveaux sont d’une part négativement corrélés avec les niveaux de méthylation globale de l’ADN et d’autre part négativement corrélés avec ceux de la 5-hydroxyméthylcytosine et de la 5-formylcytosine (intermédiaire dans le processus de déméthylation active). Ces derniers suggèrent qu’une infertilité associée au stress oxydatif conditionne l’épigénome du sperme. En conclusion, l’ensemble de notre travail apporte des ressources précieuses et originales dans la compréhension des pathologies de sperme. / Male infertility is actually considered as a public alarming health problem. The sperm pathologies spectrum ranges between different phenotypes including oligozoospermia, asthenozoospermia and teratozoospermia depending on the sperm conventional parameters abnormalities. Abnormal sperm is characterized by genetic alterations and epigenetic alterations which can affect the transcriptome extensively. These alterations in RNA profiles are retrospectively indicative of aberrant spermatogenic events. RNA-seq is a powerful tool for comprehensive characterization of whole transcriptome. To date, RNA-seq analysis of sperm from infertile men has not been reported. Our objectives are: (i) recognize key clusters, key pathways and specific gene transcripts for different sperm abnormalities; (ii) catalog the spermatozoal lncRNAs in different sperm pathologies; (iii) identify signature genes which are mechanistically important in the cascade of events driving a pathological spermatogenesis; (iii) portray the global epigenetic landscape in sperm from infertile men. Expression data from 60 sperm samples from 3 groups of infertile men (oligozoospermia, asthenozoospermia, and teratozoospermia) were generated on Illumina HiSeq platform, compared to 20 fertiles, and the resulting gene expression patterns were analyzed for functional enrichment. Our supervised analyses identified numerous differentially expressed genes between fertile and infertile men. In oligozoospermia, the deregulated spermatozoal transcripts were associated with various stages of spermatogenesis including meiotic cell cycle, synaptonemal complex assembly, sister chromatid cohesion, piRNA metabolic process, ubiquitin-dependent protein catabolic process, cellular response to DNA damage stimulus and interestingly fertilization. As for asthenozoospermia, spermatogenesis, cilium assembly, metabolic-related pathways, chemotaxis and immune cell physiology were most significantly differentially expressed. Interestingly, numerous transcripts associated with histone modifications were highly down-regulated. With regards to teratozoospermia, we evidenced sperm-specific differentially expressed genes which are involved in the ubiquitin-proteasome, cytoskeleton organization, the cell cycle pathway, SUMOylation of DNA damage response and repair proteins, as well as many putative epigenetic modulators of gene expression.. We also attempted to identify distinct patterns of gene expression changes that were definite to the different abnormal sperm phenotypes in infertile men relative to controls. Signature genes of oligozoospermia were over-enriched by genes involved in fertilization and extracellular matrix components, while signature genes of teratozoospermia were enriched by genes involved in spermatogenesis and cellular components involved in morphogenesis, whilst signature genes of asthenozoospermia were enriched by genes implicated in ribosome and cilium assembly.We complemented this work by a parallel epigenetic analysis of the global epigenetic landscape in infertile men. We compared the levels of reactive oxygen species (ROS), DNA integrity and global epigenetic parameters in sperm from 33 infertile subjects with abnormal semen parameters compared to fertile individuals. We pointed out that infertile men are characterized by strikingly high levels of reactive oxygen species (ROS) which were in part negatively correlated with the global DNA methylation, and positively correlated with the levels of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine (active demethylation intermediates). These findings suggest that male infertility associated with oxidative stress shapes the sperm epigenetic landscape. In summary, this original work yielded a transcriptional portrait of sperm abnormalities and provided valuable resources that would further elucidate sperm pathologies.