L'oxygène singulet (1O2) , premier état électronique excité du dioxygène, est l'agent cytotoxique majeur en photo-thérapie dynamique. Nous avons utilisé l'activation optique directe du dioxygène pour faire un lien quantitatif entre taux de production d'1O2 et mort cellulaire. Dans des sphéroïdes tumoraux, qui reproduisent in vitro la géométrie des tumeurs, nous mettons en évidence de la mort cellulaire à longue portée qui ne peut être expliquée par l'action directe de 1O2 . Cette mort est due à de l' 1O2 produit au sein des sphéroïdes mais à l'extérieur des cellules. Nous avons mis en place une expérience qui nous permets de contrôler spatialement la production de 1O2 à l'extérieur des cellules. La mort cellulaire observée à longue portée dans ces expériences implique la présence d'espèces réactives de l'oxygène secondaires.Enfin, certaines modalités de mort sont privilégiées du point de vue thérapeutique pour, entre autres, limiter la réponse inflammatoire. Nous avons mis en place une expérience in vitro qui nous permet d'observer différentes modalités de mort en fonction du taux de production de 1O2 et de la durée d'exposition. / Singlet oxygen (1O2) is the first excited state of molecular oxygen. It is the major cytotoxic agent in photo-dynamic therapy. We use direct optical excitation of oxygen to quantitatively estimate 1O2 production rate in cells and to study its cytotoxic effects.In multicellular tumor spheroids, which mimic tumor geometry in vitro, we highlight long-range cell death that cannot be explained by singlet oxygen alone. This death is caused by 1O2 generated within spheroids but outside of the cells. We set up an experiment enabling spatial control of extra-cellular 1O2 production. The measured long-range cell death in these experiments implies the presence of secondary reactive oxygen species. Lastly, some cell death modalities are preferred from a treatment perspective, in order, for example, to limit inflammatory response. We set up an in vitro experiment that enabled us to observe different cell death modalities according to 1O2 production rates and exposure times.

Le cancer de l'ovaire représente la première cause de décès par cancer gynécologique. La survie globale des patientes à 5 ans est inférieure à 30%. Ce sombre pronostic s'explique à la fois par la découverte tardive de la maladie et par le développement d'une chimiorésistance. L'ascite est un fluide exsudatif qui est fréquemment accumulé dans la cavité péritonéale au cours de la progression des cancers de l'ovaire. Ce « microenvironnement tumoral » particulier contribue à la dissémination des cellules cancéreuses et à leurs implantations péritonéales.L'objectif global du travail de thèse a été, d'une part d'évaluer l'influence de l'ascite sur le comportement des cellules cancéreuses ovariennes et d'autre part, d'étudier les mécanismes de résistance à la perte d'ancrage des cellules cancéreuses ovariennes.Nous avons ainsi démontré que l'ascite induit une transition épithélio-mésenchymateuse partielle et que les modifications des comportements cellulaires observées sont dépendantes des intégrines alpha-v.Deux ligands de ces intégrines, la vitronectine et la fibronectine, ont été purifiés selon un protocole original permettant la caractérisation des deux protéines à partir d'une même ascite. Ces protéines ascitiques ont des propriétés différentes selon leur origine, donc selon les patientes dont elles sont issues, et influencent le comportement adhésif des cellules avec un degré variable. L'importance de la signalisation dépendante des intégrines alpha-v et des voies MAP Kinases a également été démontrée dans l'établissement d'une résistance des sphéroïdes tumoraux à l'anoïkis.En perspective, approfondir les connaissances des processus cellulaires et moléculaires conduisant à la dissémination intrapéritonéale et à l'émergence de chimiorésistance ainsi que déterminer le rôle potentiel de protéines ascitiques dans ces processus pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. / Ovarian cancer is the most lethal gynaecological malignant disease, mainly due to late diagnosis and to acquired chemoresistance. An exudative fluid named ascites is frequently accumulates within the abdominal cavity during ovarian cancer progression. This unique tumor microenvironment contributes to cancer cell dissemination and peritoneal metastasis.The aim of the study was to evaluate the influence of ascites on cancer cell behaviors and to better understand the mechanisms of ovarian cancer cell resistance to the loss of anchorage.We demonstrate that ascites induces a partial epithelial–mesenchymal transition and that the modifications of cell behaviors observed are dependent of alpha-v integrins. A combined purification protocol has been established in order to purify vitronectin and Fibronectin, both ligands of these integrins, from a single pathological sample. These purified ascitic proteins have different molecular features according to the patients and impact the adhesive cell behavior with various degrees.Moreover we showed the importance of alpha-v integrins and MAP Kinases signalling pathways in the anoikis resistance of ovarian cancer spheroids.Our prospects are i) to increase the knowledge of the cellular and molecular processes leading to the intraperitoneal dissemination and to the emergence of chemoresistance and also ii) to determine the potential role of ascitics proteins in these processes. We will expect that these investigations couldlead to the discovery of new therapeutic targets.

De nombreuses stratégies thérapeutiques sont explorées pour trouver un traitement curatif aux gliomes de haut grade pour lesquels il n'existe pas de réelle solution. Parmi ces techniques, la radiothérapie apporte une réponse significative mais limitée par un effet différentiel insuffisant pour éradiquer la tumeur tout en préservant les tissus sains. La radiothérapie stéréotaxique par rayonnement synchrotron permet d'augmenter cet effet différentiel en augmentant localement la dose de rayonnement au niveau de la tumeur, par l'effet synergique d'une irradiation avec des rayons-X de basse énergie (< 100 keV) en présence d'un élément lourd préalablement incorporé à la tumeur. Ce travail de doctorat s'inscrit dans le cadre de la préparation des essais cliniques de radiothérapie stéréotaxique prévus au synchrotron de Grenoble. Le premier objectif de ce travail a été l'optimisation des paramètres l'irradiation basée sur une étude dosimétrique globale des plans de traitement. Nous avons notamment montré l'intérêt d'utiliser un nombre fini et apparié de faisceaux correctement pondérés pour homogénéiser la dose dans la tumeur. La suite de ces travaux a consisté en l'étude de la répartition des dépôts d'énergie à l'échelle cellulaire prenant en compte la distribution fine de l'élément lourd dans le tissu (micro-dosimétrie). Il est en effet crucial que les photoélectrons générés sur les atomes lourds, qui restent dans l'espace extracellulaire dans le cas des agents de contraste iodés, puissent atteindre les cibles cellulaires. Cette approche microdosimétrique a été comparée à des résultats de survie cellulaire obtenus in vitro, soit sur un modèle cellulaire 3D (cellules tumorales cultivées sous forme de sphéroïdes), soit sur des cellules irradiées en suspension dans un milieu iodé.

L’objectif de ce travail était de mettre au point un modèle de culture cellulaire, afin d’étudier in vitro l’incidence sur la physiologie des cellules pulpaires et en particulier de l’odontoblaste, de biomatériaux utilisés pour traiter les effractions de pulpes dentaires. Ce modèle repose sur l’utilisation de culture sphéroïdes dont la conformation spatiale reproduit plus fidèlement l’environnement in vivo que les cultures bidimensionnelles. Après avoir élaboré le modèle sphéroïde à partir de lignées murines, des expérimentations visant à déterminer la cytotoxicité des matériaux ont été effectuées. Leurs capacités à induire la biominéralisation ont également été évaluées. La dernière partie de ce travail avait pour objectif d’immortaliser des primocultures de cellules pulpaires humaines en transfectant les gènes SV40 et hTERT, afin d’établir une lignée cellulaire / The aim of this study was to develop a cell culture model to assess in vitro the effects on the physiology of pulp cells, in particular the odontoblasts, of biomaterials used to treat dental pulp exposures. This model is based on the use of spheroid culture whose spatial configuration reproduces the in vivo environment more faithfully than do two-dimensional cultures. After developing the spheroid model from mouse lines, experiments to determine the cytotoxicity of the materials were conducted. Their ability to induce bio-mineralisation was also assessed. The last part of this work aimed to immortalise primo-cultures of human pulp cells by transfecting hTERT and SV40 genes, in order to establish a new cell line

Au cours des dernières décennies, des systèmes de taille nanométrique chargés en principes actifs (nanomédicaments) et des nouvelles stratégies thérapeutiques ont été développés afin de surmonter les limitations liées à la chimiothérapie conventionnelle telles qu’une distribution non spécifique, une mauvaise accumulation dans les tissus cibles ainsi qu’une métabolisation rapide. Cependant, le succès des nouveaux médicaments en clinique reste encore limité et seulement un faible nombre de nanomédicaments est actuellement commercialisé.Une divergence entre les résultats précliniques in vitro et les performances obtenues in vivo est souvent observée dans la première étape du développement d'un médicament. Cet écart pourrait être attribué au manque de modèles pertinents, représentatifs de la pathologie observée chez l’Homme et qui soient de bons prédicteurs de la réponse thérapeutique chez les patients. En effet, les modèles utilisés aujourd’hui (généralement culture cellulaire en deux dimensions, 2D) ne reproduisent pas la structure complexe de la tumeur in vivo. Ainsi, ils ne permettent pas une évaluation fiable du potentiel thérapeutique réel des médicaments. Dans cette optique, les méthodologies de culture de cellules en trois dimensions (3D) sont extrêmement avantageuses. Ces méthodologies permettent, en effet, la construction de systèmes cellulaires pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. Parmi ces modèles, l'assemblage de cellules sous forme de sphéroïdes multicellulaires a été largement exploré. Néanmoins, les sphéroïdes décrits jusqu'à présent correspondent à des nodules formés exclusivement de cellules cancéreuses, ce qui constitue une vraie limitation. En effet, ces sphéroïdes ne reproduisent pas l’organisation de la tumeur et l'hétérogénéité du microenvironnement, et par conséquent ils ne parviennent pas à mimer les multiples barrières biologiques que les médicaments doivent traverser pour atteindre les cellules cibles.Dans cet esprit, l'objectif de cette thèse de doctorat était de surmonter ces limitations et de construire des modèles pertinents qui reproduisent in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement afin de i) mieux comprendre les mécanismes de passage des nanomédicaments et ii) mieux prédire l’efficacité des nouveaux traitements.Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés au cancer du pancréas qui est caractérisé par la présence d'un abondant stroma formant un bloc fibreux (réaction desmoplastique) qui limite la pénétration des médicaments et réduit ainsi leur efficacité. Cette tumeur représente donc un bon exemple de barrière biologique tumorale.La partie principale de ce travail de recherche repose sur la construction et la caractérisation complète d’un nouveau type de sphéroïde multicellulaire, capable de reproduire in vitro la relation entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, grâce à la co-culture de cellules cancéreuses pancréatiques, de fibroblastes et de cellules endothéliales. Les études de cytotoxicité in vitro nous ont permis d’investiguer la capacité de ce modèle à reproduire la résistance des cellules cancéreuses aux traitements observés in vivo. Grâce à la Microscopie de Fluorescence à Feuillet de Lumière nous avons pu étudier la pénétration de la doxorubicine, soit en forme libre, soit encapsulée dans des nanoparticules, au sein des sphéroïdes. Ensuite, afin de mieux comprendre comment les médicaments et nanomédicaments interagissent avec la tumeur, nous avons cherché à combiner la culture 3D avec des conditions dynamiques contrôlées dans un dispositif microfluidique. Pour atteindre cet objectif, nous avons conçu et fabriqué une puce sur mesure, adaptée pour loger à la fois le sphéroïde et des canaux dans lesquels les cellules endothéliales pourront s’organiser sous forme de vaisseaux. / In the last decades, various engineered systems for drug delivery (i.e., nanomedicines) have been developed with the aim to overcome the limits associated to conventional chemotherapy, such as non-specific drug distribution, poor delivery to the target tissue and rapid metabolism. However, the success of new therapeutic strategies in the clinic is still suboptimal and only a limited number is currently marketed.A discrepancy between promising preclinical in vitro results and the in vivo performances is often observed in the early stage of drug development and might be ascribed to the lack of capacity of the models commonly used for in vitro studies to faithfully reproduce the pathophysiology of solid tumors. These models mainly consist of cancer cells cultured as flat (two dimensional, 2D) monolayers or assembled to form three dimensional (3D) multicellular tumor spheroids (MCTS).However, being composed exclusively of one cell type, these models are too simplistic. They do not allow to reproduce the heterogeneous cellular composition, as well as, the complex architecture of the tumor and its surrounding microenvironment. Thus, they fail to replicate the multiple biological barriers that drugs and nanomecidines have to cross in order to reach the target cells.The aim of this PhD thesis was to overcome these limitations and construct a reliable tool for an appropriate in vitro evaluation of the therapeutic potential of nanomedicines and other chemotherapies. Attention has been focused on the pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) whose strong fibrotic reaction represents a well-known example of a tumor biological barrier responsible of the limited efficacy of the treatments. The main part of this research work relies on the construction and complete characterization of novel hetero-type MCTS based on a triple co-culture of pancreatic cancer cells, fibroblasts and endothelial cells, and thus capable to integrate the cancerous component and the microenvironment of the tumor. The constructed 3D model has demonstrated the capacity to reproduce in vitro the influence of the microenvironment on the sensitivity of cancer cells to chemotherapy. In addition, by combining the 3D model and the innovative Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM), we have been able to investigate the penetration of the anticancer drug doxorubicin (in a free form and loaded into nanoparticles (NPs)) in a high informative manner. Then, in order to acquire a better understanding on how nanomedicines and other anticancer chemotherapies interact with the tumor, we sought to combine the hetero-type 3D culture with controlled flow conditions in a microfluidic device. To reach this goal we have designed and fabricated a tailor-made chip suitable to host both a MCTS and a perfusable microvascular network (i.e., MCTS-on-a-chip).

À la suite d'un diagnostic de cancer de l'ovaire, la prise en charge thérapeutique constitue une étape déterminante dans la survie des patientes atteintes. Actuellement, la plupart de celles-ci subiront une cytochirurgie suivie d'une chimiothérapie standard comprenant du Cisplatin (ou Carboplatin) et du Paclitaxel. Malgré une réponse initiale adéquate, il a été démontré que 75-80% d'entre elles récidiveront peu de temps après la fin de leurs ("leurs" prend un "s" si chaque femme à plusieurs traitements) traitements. Dans ces cas de récidive, la plupart des patientes développeront aussi une résistance à la chimiothérapie. A ce stade, l'administration d'un traitement efficace devient donc un problème de taille pour les oncologues. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans notre programme de recherche, nous avons évalué le profil d'expression génique de six paires de tumeurs prélevées avant et après la chimiothérapie (CT) de six patientes atteintes d'un cancer épithéliale de l'ovaire (CEO), dans le but de pouvoir caractériser moléculairement les récidives résistantes de l'ovaire. Nos résultats ont montré la présence d'une signature moléculaire spécifique dans les tumeurs post-CT présentant une surexpression de gènes associés à des mécanismes connues de chimiorésistance et à la régulation négative de la prolifération. D'autres gènes liés à la réponse aux traitements, à l'apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et à la régulation positive de la prolifération sont sous-exprimés dans ces mêmes tumeurs. Nous avons aussi analysé le profil d'expression génique de tumeurs primaires de l'ovaire de type séreux présentant différentes réponses aux agents chimiothérapeutiques, dans le but d'identifier une signature moléculaire spécifique associée à la réponse aux traitements primaires. Nos résultats suggèrent que la chimiorésistance innée peut être attribuée à une action combinée de différents facteurs liés au transport de la drogue (acquisition/excrétion), à la prolifération cellulaire ainsi qu'à des altérations dans le métabolisme, la réponse inflammatoire et l'apoptose. Une liste prédictive contenant 43 gènes a été développée et possède la capacité de pouvoir classifier les patientes ayant une tumeur séreuse de l'ovaire selon leur risque de récidiver tôt ou tard à la suite de leurs CT Découlant de ces études, plusieurs biomarqueurs associés à la chimiorésistance ont été identifiés. L'expression de certains d'entre eux a été validée dans une cohorte contenant 166 patientes atteintes de CEO présentant différents temps de survie (survie avec ou sans progression de la maladie) suivant leurs (idem) traitements de CT initiaux. Sur une liste contenant 15 candidats potentiels, nous avons observé qu'une plus faible expression protéique du biomarqueur HSP10 ainsi qu'une diminution de la prolifération cellulaire (via une plus faible expression du marqueur Ki67) prédisent une plus faible survie sans progression de la maladie et donc, par déduction, une plus grande chance de développer une chimiorésistance. L'expression protéique d'autres biomarqueurs (CTSL2 et MUC1) a été évaluée dans notre cohorte et nous avons trouvé que ceux-ci montraient une tendance à être associés avec la survie des patientes. Ceux-ci devront cependant être revalidés dans une plus grande cohorte de patientes. L'analyse des profils d'expression génique des tumeurs chimiorésistance de l'ovaire a aussi mené à l'identification de l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires (Célébrex) en termes de traitement potentialisateurs pouvant augmenter l'effet cytotoxique du Cisplatin sur les cellules de cancer de l'ovaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la réponse immédiate des cellules de cancer de l'ovaire aux traitements de CT ainsi que l'émergence d'une chimiorésistance précoce, nous avons étudié les profils d'expression génique de sphéroïdes dérivés de six lignées cellulaires de cancer de l'ovaire suivant un traitement avec des agents chimiothérapeutiques couramment utilisés dans le traitement des CEO (Cisplatin, Paclitaxel et Topotecan). Nous avons trouvé que l'induction de gènes liés aux mécanismes de réplication et de réparation de l'ADN dans les sphéroïdes traités avec du Cisplatin et du Topotecan pourraient être associée avec la réponse immédiate aux traitements et pourrait être liée à un mécanisme précoce de résistance. De façon similaire, la surexpression de différents isotypes de tubulines suivant un traitement des sphéroïdes avec du Paclitaxel pourrait représenter un effet compensatoire précoce à l'action de cette drogue. Finalement, les conditions de croissance en sphéroïde, condition reconnue pour altérer l'expression génique, pourrait substantiellement contribuer à réduire l'efficacité des agents chimiothérapeutiques sur les sphéroïdes de cancer de l'ovaire. Pris ensemble, les résultats présentés dans cette thèse aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens et aideront à définir de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour ce type de patientes.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique dégénérative des muscles qui touche un garçon sur 3500. L'absence de la protéine à l'origine de la maladie, la dystrophine, entraîne une fragilité musculaire ce qui engendre une dégradation prématurée des muscles. Parmi les différentes thérapies à l'étude, on retrouve la greffe de myoblastes sains qui permet de rétablir en partie l'expression de la protéine. Cependant, la migration et la survie limitées des myoblastes ainsi que l'induction du système immunitaire restent des problèmes importants rencontrés par ce traitement. Les cellules souches isolées du muscle (MDSC) pourraient offrir un bon potentiel thérapeutique. Par exemple, il a été démontré qu'elles possèdent la capacité de migrer des vaisseaux sanguins vers les fibres musculaires pour régénérer l'expression de la dystrophine dans les muscles de souris mdx (modèle de la DMD). Toutefois, il existe plusieurs techniques d'isolement de ces cellules et les caractéristiques des différentes sous-populations sont encore mal connues. De plus, les MDSC sont très rares à l'intérieur du muscle, il faut donc utiliser des techniques permettant d'isoler un nombre maximal de cellules et des milieux soutenant une meilleure prolifération des MDSC. À cet effet, nous utilisons avec succès un milieu de culture sans sérum décrit précédemment dans la littérature pour la croissance des cellules souches de la peau. Dans ce milieu, nous avons identifié que les MDSC forment des sphéroïdes et augmentent leur population de quatre fois en dix jours. Le volume des sphéroïdes augmente aussi tout au long de la culture jusqu'à atteindre un plateau après dix jours. Dans ce travail, nous avons déterminé que la formation des sphéroïdes est un processus obligatoire dans l'expansion des MDSC. Étant donné que la plupart des protocoles nécessitent l'obtention de cellules dissociées, nous avons donc développé des techniques de dissociation enzymatique minimisant le dommage fait aux cellules et aux récepteurs cellulaires tout en maximisant le bris des sphères. L'effet du milieu de culture sur la croissance des différentes sous-populations a également été mesuré. Nous avons également déterminé que les cellules exprimant le récepteur Seal, caractéristique des cellules souches de souris, pouvait proliférer dans le milieu. Par contre, l'expression de CD34, un autre marqueur de cellules souches hématopoïétiques, chute rapidement après la mise en culture. Comme la prolifération des MDSC est faible, différents paramètres de culture ont été variés afin de voir leur influence sur la croissance. Nous avons observé que les hautes densités cellulaires initiales (2 xl0E5 cellules/ml) et les plus grands volumes de culture utilisés (plaque 6-12 puits) ont une influence positive sur l'expansion des cellules.

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement alternatif à la chirurgie en oncologie utilisant un photosensibilisateur (PS), la lumière visible et l’oxygène moléculaire. La méta-tétra(hydroxyphényl)chlorine (mTHPC) est l’un des PS de deuxième génération les plus utilisés en clinique en raison de son absorption dans le rouge lointain et d’un rendement quantique en 1O2 élevé. De par sa nature hydrophobe, la mTHPC est partiellement agrégée dans la circulation sanguine diminuant sa biodistribution. Dans le but d’améliorer la sélectivité tumorale de la mTHPC, différentes stratégies de vectorisation ont été développées. La formulation liposomale de mTHPC non PEGylée (Foslip®) améliore la biodistribution ainsi que les propriétés pharmacocinétiques de la mTHPC. Cependant, une rapide destruction des liposomes en circulation ainsi qu’une rapide libération de la mTHPC sont des inconvénients majeurs. Une alternative possible est l’utilisation de vésicules extracellulaires (VE). Dérivées des cellules, les VE possèdent une stabilité naturelle dans la circulation sanguine et une capacité à transporter et délivrer leur contenu de manière spécifique aux cellules cancéreuses. Cette vectorisation est intéressante en PDT en raison d’une importante capacité d’encapsulation des porphyrines. Le but de cette étude était d’évaluer l’intérêt des VE en tant que nanovecteur de la mTHPC dans divers modèles précliniques comparé au Foslip®. Contrairement au Foslip®, l’intégrité membranaire des VE est conservée en présence de 20% de plasma. In vitro, les mTHPC-VE ont montré une internalisation cellulaire par un mécanisme actif d’endocytose. Dans un modèle cellulaire en 3D de sphéroïdes multicellulaires, les mTHPC-VE ont permis d’accroitre l’accumulation cellulaire, la diffusion au sein de ce modèle ainsi que l’efficacité PDT. In vivo, les mTHPC-VE apparaissent plus efficace au niveau PDT avec un retard de croissance tumorale significativement augmenté. En conclusion, l’intégration de la mTHPC au sein des VE améliore l’efficacité PDT dans les différents modèles d’étude. Le suivi des mTHPC-VE à l’aide d’un traceur radioactif chez la souris ainsi que l’étude du ciblage de la vascularisation tumorale seront étudiés dans la suite du travail / Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment to surgery in oncology using photosensitizer (PS), light and oxygen. Meta-tetra(hydroxylphenyl)chlorin (mTHPC) is one of the most used PS in clinics due to its high absorption in the deep red and high 1O2 quantum yield. In order to improve the mTHPC tumor selectivity different attempts of nanovectorisation were conducted. Non-PEGylated liposomal mTHPC (Foslip®) increase biodistribution and pharmacokinetic properties. However, the rapid liposome destruction during circulation and rapid mTHPC release are obvious shortcomings. Alternatively, mTHPC vectorization could be realized by extracellular vesicles (EVs). Derived from the cell, EVs possess a natural stability in bloodstream and ability to transport and deliver cargo molecules into cancer cells. This formulation is interesting for PDT due to the ability to encapsulate porphyrins. The aim of the present study was to determine the interest of EVs as mTHPC nanocarriers in various preclinical models compared to Foslip®. In contrast to Foslip®, membrane integrity of mTHPC-EVs was conserved in 20% of plasma. In vitro, mTHPC-EVs showed cellular internalization by an active endocytosis mechanism. In a 3D model of spheroids, mTHPC-EVs have improved cellular uptake, better diffusion inside spheroid and increased PDT efficacy. In vivo, mTHPC-EVs appeared to be more potent in terms of PDT efficacy, with a tumor growth delay significantly higher. In conclusion, integration of mTHPC in EVs improves PDT efficacy in various preclinical models. The tracking of mTHPC-EVs using a radioactive tracer in xenografted rodents as well as the study of vascularization targeting will be studied in the next step of this work

Le cancer de l'ovaire représente la première cause de décès par cancer gynécologique. La survie globale des patientes à 5 ans est inférieure à 30%. Ce sombre pronostic s'explique à la fois par la découverte tardive de la maladie et par le développement d'une chimiorésistance. L'ascite est un fluide exsudatif qui est fréquemment accumulé dans la cavité péritonéale au cours de la progression des cancers de l'ovaire. Ce " microenvironnement tumoral " particulier contribue à la dissémination des cellules cancéreuses et à leurs implantations péritonéales.L'objectif global du travail de thèse a été, d'une part d'évaluer l'influence de l'ascite sur le comportement des cellules cancéreuses ovariennes et d'autre part, d'étudier les mécanismes de résistance à la perte d'ancrage des cellules cancéreuses ovariennes.Nous avons ainsi démontré que l'ascite induit une transition épithélio-mésenchymateuse partielle et que les modifications des comportements cellulaires observées sont dépendantes des intégrines alpha-v.Deux ligands de ces intégrines, la vitronectine et la fibronectine, ont été purifiés selon un protocole original permettant la caractérisation des deux protéines à partir d'une même ascite. Ces protéines ascitiques ont des propriétés différentes selon leur origine, donc selon les patientes dont elles sont issues, et influencent le comportement adhésif des cellules avec un degré variable. L'importance de la signalisation dépendante des intégrines alpha-v et des voies MAP Kinases a également été démontrée dans l'établissement d'une résistance des sphéroïdes tumoraux à l'anoïkis.En perspective, approfondir les connaissances des processus cellulaires et moléculaires conduisant à la dissémination intrapéritonéale et à l'émergence de chimiorésistance ainsi que déterminer le rôle potentiel de protéines ascitiques dans ces processus pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Le microenvironnement tumoral, l'angiogenèse tumorale et l'hypoxie jouent un rôle crucial dans la progression tumorale et le développement de thérapies de nombreux cancers. Les limites de pénétration des médicaments, les phénomènes de résistance aux anti-cancéreux, la vascularisation de la tumeur et l’hypoxie sont tous des paramètres influençant les effets du médicament. La culture cellulaire 3D permet de créer un microenvironnement qui imite l’architecture et la fonction des tissus in vivo. L’expression de gènes et de protéines modifiée par l’environnement 3D est une autre caractéristique qui impacte l’effet d’une molécule thérapeutique. Dans notre première étude, afin de développer un modèle 3D vascularisé imitant celle des tumeurs in vivo, nous avons mis en culture des cellules endothéliales en 2D avec des cellules tumorales en 3D. Après 2 semaines de culture, un réseau vasculaire s’est organisé avec des structures de type tubulaire présentant une lumière et exprimant différents marqueurs angiogéniques tels que VEGF, CD31 et Collagène IV. Dans notre deuxième étude, nous avons développé un modèle d’hypoxie in vitro intégrant l'environnement 3D et un agent mimétique de l'hypoxie (CoCl2). Le but de ce modèle est de créer un modèle d'hypoxie imitant les tumeurs in vivo et de montrer l'importance de l'hypoxie dans la réponse et la résistance aux médicaments. Ces résultats ont révélé que la meilleure condition était la combinaison 3D+CoCl2, conduisant à la surexpression des gènes relatifs à l’hypoxie (GLUT1/3, VEGF) et à la résistance aux médicaments (ABCG2, MRP1). L'angiogenèse et l'hypoxie sont des facteurs clés pour le microenvironnement tumoral in vivo et ils doivent être adoptés dans la conception de modèles tumoraux in vitro pour mieux sélectionner et cribler les médicaments anticancéreux. / The tumor microenvironment, tumor angiogenesis, and hypoxia play a critical role in the tumor progression and therapy development of many cancers. Limitations in drug penetration, multidrug resistance phenomena, tumor vascularization, and oxygen deficiency are all parameters influencing drug effects. 3D cell culture allows to create a microenvironment that more closely mimics in vivo tissue architecture and function, thus, gene and protein expression modified by the 3D environment are further features that affect treatment outcome. In our first study, in order to develop a vascularized 3D model like in vivo tumors, we co-cultured 2D endothelial cells with 3D tumor cells. After 2 weeks of this combination, a vascular network was formed and organized with tubule-like structures presenting a lumen and expressing different angiogenic markers such as VEGF, CD31 and Collagen IV. In our second study, we developed an in vitro hypoxia model integrating the 3D environment and a hypoxia mimetic agent (CoCl2) to mimic the in vivo tumors and to show the importance of hypoxia in drug response and resistance. Results revealed that the best condition was the combination 3D+CoCl2 model, leading to overexpression oh hypoxia (GLUT1/3, VEGF) and drug resistance (ABCG2, MRP1) related genes. Taken together, angiogenesis and hypoxia are key factors for in vivo tumor microenvironment and they should be adopted in in vitro model design to better select and screen anticancer drugs.