De nombreuses observations astrophysiques indiquent l'existence de grandes quantités de masse manquante dans l'Univers, et ce de l'échelle galactique à l'échelle cosmologique. Découvrir la nature de cette masse invisible constitue le problème de la matière noire, qui apparaît comme l'un des enjeux majeurs de la physique moderne. Cette thèse s'inscrit dans le contexte de la détection indirecte de matière noire. Cette dernière serait composée de nouvelles particules élémentaires, dont les produits d'annihilation pourraient être observés dans le rayonnement cosmique. Nous étudions dans ce travail deux des canaux de recherche les plus prometteurs : les photons gamma et les anti-noyaux.Les objets astrophysiques permettant de placer les meilleures contraintes actuelles en rayons gamma sont les galaxies naines sphéroïdes (dSphs) de la Voie Lactée. La première partie de notre travail a été consacrée à contraindre les facteurs J d'annihilation de ces objets, qui quantifient l'amplitude des flux gamma attendus. Nous avons pour cela mis au point une configuration optimisée d'analyse de Jeans, pour reconstruire les profils de densité de matière noire et leurs incertitudes à l'aide des données cinématiques stellaires. Notre configuration a été obtenue à l'aide de tests systématiques sur de très nombreuses dSphs simulées, et nous l'avons appliquée à vingt-trois dSphs de la Voie Lactée. La seconde partie de notre travail a consisté à mener une recherche de noyaux d'anti-hélium dans les données collectées par l'expérience AMS-02 sur la Station Spatiale Internationale. Nous avons pour cela mis au point une classification par arbres de décision boostés, et notre analyse préliminaire a permis d'obtenir les meilleures contraintes actuelles sur les rapports anti-hélium sur hélium. / Many astrophysical observations suggest the existence of large amounts of missing mass in the Universe, from the galactic to the cosmological scale. Discovering the nature of this invisible mass forms the dark matter problem, which appears as one of the major challenges of modern physics. This thesis is established in the context of indirect detection of dark matter. The latter could consist of new elementary particles, whose annihilation products may be observed in cosmic rays. We study in this work two of the most promising research channels!: gamma-rays and anti-nuclei.The best constraints on dark matter properties from gamma-ray observations come from the dwarf spheroidal galaxies (dSphs) of the Milky Way. The first part of our work was devoted to computing the annihilation J-factors of these objects, which quantify the magnitude of the expected gamma-ray flux. We have developed an optimized Jeans analysis setup in order to reconstruct the dark matter density profiles of these objects and their associated uncertainties, using stellar kinematic data. Our optimized setup was obtained using systematic tests on numerous simulated dSphs, and we applied it to twenty-three dSphs of the Milky Way. The second part of our work was dedicated to the search for anti-helium nuclei in the cosmic ray data collected by the AMS-02 experiment on the International Space Station. We have developed a classification method using boosted decision trees, and our preliminary analysis has led to the best constraints to date on the anti-helium to helium ratio.

Les sphéroïdes multicellulaires tumoraux (SMT) constituent un outil prometteur dans le domaine de l’étude biologique des tumeurs. Le but de la thèse était de développer une technique de la formation de SMT et de démontrer la disponibilité de ces sphéroïdes comme modèle in vitro 3D pour tester l’efficacité de principes actifs anticancéreux ainsi que celle de formulations de délivrance de médicaments. L'effet d’auto-assemblage de cellules induit par une addition des peptides RGD cycliques a été étudié pour 16 lignées cellulaires de différentes origines. Le peptide cyclique RGDfK et sa modification avec le cation triphenylphosphonium (TPP) ont permis de mettre en évidence l’induction de formation de sphéroïdes. Les sphéroïdes ont été employés comme modèles pour évaluer la cytotoxicité de principes actifs antitumoraux (doxorubicine, curcumine, temozolomide) et un certain nombre de formulations nano- et micrométriques (microréservoirs, nano-émulsions et micelles). / Multicellular tumor spheroids (MTS) are a promising tool in tumor biology. The aim of the Thesis was to develop a novel highly reproducible technique for MTS formation, and to demonstrate the availability of these spheroids as 3D in vitro model to test anticancer drugs and drug delivery vehicles. Cell self-assembly effect induced by an addition of cyclic RGD-peptides directly to monolayer cultures was studied for 16 cell lines of various origin. Cyclo-RGDfK peptide and its modification with triphenylphosphonium cation (TPP) were found to induce spheroid formation. The spheroids were used as a model to evaluate the cytotoxicity of antitumor drugs (doxorubicin, curcumin, temozolomide) and a number of nano- and micro- formulations (microcontainers, nano-emulsions and micelles).

Aujourd’hui, la transplantation est le seul traitement efficace proposé aux patients souffrant d’une insuffisance hépatique fulminante. La nécessité de disposer d’un système de suppléance hépatique transitoire apparaît donc indispensable. C’est dans cet axe que se sont développés les systèmes qualifiés de foies bio artificiels (BAL). Leur principale caractéristique est d’incorporer un bioréacteur hébergeant des cellules pouvant restaurer l’activité hépatiques dans son ensemble. A l’heure actuelle, les hépatocytes primaire humains (HEP) issus de foies de donneurs non transplantables sont considérées comme le meilleur choix. Cependant, leur utilisation reste limitée par leur faible disponibilité et la difficulté à les maintenir différenciés en culture in vitro. Pour remédier à ce dernier point, l’approche la plus prometteuse semble être une co-culture des hépatocytes avec les cellules non parenchymateuses afin de recréer un environnement proche des sinusoïdes hépatiques. Ce travail de thèse repose sur la mise en place d’une nouvelle approche de co-culture tridimensionnelle sous la forme de sphéroïdes, d’HEP primaires avec les principaux types de cellules non-parenchymateuses (les cellules de Kupffer, les cellules endothéliales et les cellules étoilées) selon des proportions spécifiques. Puis de leurs encapsulations dans des billes d’alginate et leurs cultures au sein d’un bioréacteur à lit fluidisé. Ce modèle s’est révélé pertinent et approprié à maintenir les fonctions hépatiques dans le temps. Bien que beaucoup d’optimisation reste à définir, ce travail exploratoire témoigne de l’intérêt de cette approche intéressante pour le progrès des systèmes BAL. / Liver shortage makes transplantation inapplicable to all acute liver failure patients. Bioartificial Iiver (BAL) devices represent a temporary solution for these patients which are thereby bridged tilt Iiver transplantation or regeneration BAL treatment offers blood purification and substitution of metabolic functions through the activity of hepatocytes (HEPs), which are integrated in the device within acclimating containers, so-called bioreactors. Primary human hepatocytes are the ideal cell type to use in BAL, but they are scarcely available and difficult to maintain in vitro. Co-culture of HEPs with supporting cells has been proposed as the most promising strategy for preserving HEP behaviors in in vitro conditions. In fact, assisting cells types hold their ability to influence functional responses of the HEPs by providing them with cues of the native organ.This PhD work proposed a novel approach of co-culture for the functional sustain and preservation of the HEPs in the environment of the fluidized bed bioreactor (designed in our Iaboratory). Definition of this model took inspiration from the cellular organization in the organ; therefore, it employed three major sinusoidal non-parenchymal cell populations (liver sinusoidal, Kupffer, and hepatic stellate cells) which, together with HEPs, were cultured with three-dimensional arrangement (spheroids) and according to specific proportions. The resulting model was characterized in terms of functional benefits for the HEPs, and then applied in the microenvironment of alginate beads, which provide cells with immunological and mechanical protection in the fluidized bed bioreactor. This spheroidal multi-cultured model revealed its potentiality in sustaining in vitro HEP behaviors over time. Although much remains to be refined, this model may represent an interesting approach for the progress of BAL

La nécessité de nouveaux modes de suppléance hépatique se fait clairement ressentir pour maintenir en vie les patients en attente d’une greffe. Des traitements, basés sur l’utilisation de cellules cultivées dans un environnement adéquat, pourraient même permettre le rétablissement de certains patients en insuffisance hépatique sévère et ainsi éviter la greffe et les traitements immunosuppresseurs associés. Une suppléance hépatique efficace pourrait aussi servir au rétablissement des patients récemment greffés ou ayant subi une hépatectomie. L’objectif de cette thèse a été de développer, créer et valider un nouveau foie bioartificiel avec une prise en compte des contraintes réglementaires des médicaments combinés de thérapie innovante. Ce BAL doit pouvoir inclure des bioréacteurs à lit fluidisé perfusés par du plasma et contenant des sphéroïdes d’hépatocytes encapsulés. Des microparticules de verre, ajoutés aux billes d’alginate pour les alourdir, permettent d’obtenir une fluidisation optimale dans du plasma pathologique sans que des effets délétères ne soient observables ni pour les cellules ni pour les propriétés mécaniques des billes. Une méthode de culture cellulaire utilisant un revêtement anti-adhérent sur des boites de Petri en verre permet de produire un nombre important de sphéroïdes viables in vitro. Ces sphéroïdes encapsulés peuvent être maintenus vivants et métaboliquement actifs dans un bioréacteur à lit fluidisé pendant au minimum 4 jours.Pour assurer l’efficacité du BAL et la sécurité des patients, une circulation extracorporelle complexe a été mise au point pour être compatible avec une machine d’épuration extracorporelle commerciale, la Prismaflex® de la société Gambro, déjà utilisée en soins intensifs. Une étude préclinique sur un modèle ovin a montré que le traitement était bien toléré en ce qui concerne les aspects hémodynamiques. La prochaine étape concerne la mise en place d’une étude dans un modèle porcin d’insuffisance hépatique, avant de pouvoir procéder aux premiers essais cliniques. / The need for new liver support devices is clearly felt to allow keeping alive patients waiting for a transplant. Treatments, based on the use of cells cultured in an adequate environment, may even allow the recovery of some patients suffering from acute liver failure and avoid graft and associated immunosuppressive therapies. A hepatic substitution could also be used to reestablish patients recently transplanted or who had underwent an hepatectomy.. The objective of the thesis was to design, create and validate of a new bioartificial liver with consideration for the regulatory requirements of the Advanced Therapies Medical Product (ATMP). This device has to include fluidized bed bioreactors perfused with plasma and hosting alginate-encapsulated hepatocytes spheroids. Microparticles of glass have been added to weight down alginate beads in order to have an optimal fluidization in pathological plasma without negative effects neither on cells metabolism nor on mechanical properties of the beads. A cellular culture method using non adhesive coating in Petri dish led to the production of a large amount of viable spheroids in vitro. These encapsulated spheroids can be kept alive and metabolically active in a fluidized bed bioreactor during a minimum of four days. To ensure the efficacy of the BAL and the safety of patients, a complex extracorporeal circulation was designed to be compatible with a commercial medical device, the Prismaflex® monitor of the company Gambro, already used in intensive care units. A preclinical study on sheeps has shown that the treatment was well tolerated in terms of hemodynamics considerations. The next step is the establishment of a study in a porcine model of liver failure, before we can proceed to the first clinical trial.

L’adénocarcinome épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus mortel. La recherche de nouvelles thérapies repose principalement sur des modèles précliniques 2D et in vivo avec des lignées cellulaires (LC) pour générer les évidences nécessaires à l’initiation d’essais cliniques. Ce processus requiert des fonds substantiels en recherche/santé qui est associé à un taux d’attrition élevé laissant supposer des lacunes dans le modèle actuel. Nos publications antérieures suggèrent que la sensibilité in vitro de nos LC du CEO à la chimiothérapie carboplatin varie en 2D ou 3D. Il reste à élucider lequel de ces modèles est le plus représentatif de la réponse in vivo. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que le modèle 3D refléterait plus étroitement la sensibilité in vivo. L’objectif de cette étude était de caractériser la réponse au carboplatin de nos LC du CEO en monocouches et en sphéroïdes (3D), puis de les comparer à leur réponse in vivo (xénogreffes). Un total de 6 LC du CEO a été injecté dans des souris qui ont reçues trois différentes concentrations de carboplatin. Leurs réponses ont été évaluées/classées selon leurs mesures de volume tumoral et l’immunofluorescence. Ces mêmes LC ont été ensemencées dans des plaques à très faible adhérence pour former des sphéroïdes et les traiter. Des analyses de cytométrie en flux ont été effectuées afin de classer les LC selon leur concentration inhibitrice médiane (CI50). Nous avons comparé le tout aux résultats 2D (CI50) précédemment publiés. Nos résultats montrent que le système 3D démontre la meilleure concordance avec le modèle in vivo. Notamment, notre LC ultra-résistance en 2D devient plus sensible en modèle murin ou encore en 3D. Inversement, une LC ultra-sensible en 2D est plus résistante en xénogreffe et en sphéroïde. Les résultats découlant de notre étude sont importants à considérer lors d’investissement de temps et de fonds dans les études de criblage et de prédiction de réponses thérapeutiques. / Epithelial ovarian adenocarcinoma (EOC) is the most lethal gynecological cancer. The drug discovery pipeline is heavily based on preclinical models. Typically, 2D cell line (CL)-based models are used to screen compounds followed by validation in animal models to generate the evidence needed to design clinical trials. This process incurs a high cost to the research pipeline and still results in high drug attrition rates. This may in part reflect the poor translation of preclinical to clinical results and points to deficiencies in modeling. Previous work from our laboratory shows that the sensitivity of our EOC CLs to carboplatin therapy varies between 2D and 3D in vitro models, however it is unclear how these differences align with the in vivo response. We hypothesize that 3D models will more closely reflect therapeutic in vivo response. The objective of this study was to characterize the carboplatin sensitivity of EOC CLs in 2D and 3D-spheroids and compare them to in vivo response using mouse xenografts. We injected mice with 6 different EOC CLs that were treated with 3 different carboplatin concentrations. Tumor volume measurements and immunofluorescence viability stains were used to categorize CLs by their sensitivity. The same CLs were seeded in low attachment plates to form, and thereafter treat, spheroids. Flow cytometry analysis was used to classify CLs by their 50% inhibitory response (IC50). The 2D response (IC50) for these CLs has previously been published. Our results show that therapeutic response changes significantly for a single CL between different systems, and the 3D model was most concordant with the in vivo model. Our ultra-resistant CL in 2D became more sensitive in 3D/mouse models. In contrast, the highly 2D sensitive CL became more resistant in our xenograft/spheroid models. The results are important to consider when investing time/funds in drug screening and therapeutic response prediction studies.

La thérapie photodynamique (PDT) est un traitement alternatif du cancer plus ciblé et moins invasif que les modalités traditionnelles. La Temoporfine (mTHPC, nom sous forme médicamenteuse : Foscan®), est l'un des PS les plus puissants cliniquement approuvés. Cependant, sa faible solubilité en milieu aqueux a provoqué plusieurs complications lors de son administration. La présente étude vise à mettre au point des nanoparticules constituées d’une molécule anticancéreuse couplée à la cyclodextrine intégré dans un liposome (drug-in-cyclodextrin-in-liposome, DCL) en couplant deux systèmes d'administration indépendants : les complexes d'inclusion cyclodextrine-mTHPC et les vésicules liposomales pour améliorer le transport et la pénétration de la mTHPC dans le tissu cible. La formation de complexes d'inclusion entre les cyclodextrines et la mTHPC a été étudiée en détail. Sur la base de ces données, des mTHPC-DCL à simple et double charge ont été préparées, optimisées et caractérisées. Il a été démontré que les mTHPC-DCL sont stables et que presque tous les mTHPC-DCL sont liés à β-CDs dans la lumière aqueuse interne des liposomes. L'influence des DCLs sur l'accumulation, la distribution et l'efficacité photodynamique de la mTHPC a été étudiée dans des modèles cellulaire en monocouche et sphéroïde multicellulaires 3D d’adénocarcinome de pharynx humain (HT29). En utilisant des sphéroïdes, nous avons démontré que le DCL à base de triméthyl-β-CD fournissait une accumulation homogène de la mTHPC dans tout le volume des sphéroïdes tumoraux, suggérant ainsi une distribution optimale de la mTHPC. / Photodynamic therapy (PDT) is an alternative cancer treatment which offers a more targeted and less invasive treatment regimen compared to traditional modalities. Temoporfin (mTHPC, medicinal product name: Foscan®), is one of the most potent clinically approved PS. However, its poor solubility in aqueous medium caused several complications of its administration. The present study is aimed at the development of drug-in-cyclodextrin-in-liposome (DCL) nanoparticles by coupling two independent delivery systems: cyclodextrin/mTHPC inclusion complexes and liposomal vesicles to improve the transport and penetration of mTHPC to the target tissue. The formation of inclusion complexes between cyclodextrins and mTHPC was studied in detail. Based on these data, single and double loaded mTHPC-DCLs have been prepared, optimized and characterized. It was demonstrated that mTHPC-DCLs are stable and almost all mTHPC is bound to β-CDs in the inner aqueous liposome lumen. The influence of DCLs on mTHPC accumulation, distribution and photodynamic efficiency was studied in human adenocarcinoma HT29 cellular monolayer and spheroid models. Using 3D multicellular HT29 tumor spheroids we demonstrated that trimethyl-β-CD-based DCL provides homogenous accumulation of mTHPC across tumor spheroid volume thus supposing optimal mTHPC distribution.

La thérapie cellulaire est au centre de la médecine régénérative, une nouvelle avenue thérapeutique en constante évolution depuis les 2 dernières décennies, particulièrement pour les maladies touchant les organes avec très faible potentiel de régénération. Parmi les nombreuses populations de cellules souches identifiées jusqu’à présent, les cellules souches mésenchymateuses (MSC) offrent plusieurs avantages, notamment en cardiopathie ischémique. Les MSC originalement isolées de la moelle osseuse (MO) sont à présent isolées de plusieurs autres organes dont le tissu adipeux (cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux ASC), un organe facile d’accès et disponible en grande quantité chez l’humain. Les évidences précliniques et cliniques des MSC et ASC pointent vers une efficacité thérapeutique qui demeure limitée et nécessite une optimisation pour atteindre le potentiel de guérison et de réparation myocardique post injure ischémique. Malgré un potentiel de différenciation in vitro et in vivo, l’effet thérapeutique des cellules souches est lié aux nombreux médiateurs constituant leur sécrétome. Ainsi, afin d’optimiser l’impact thérapeutique, plusieurs méthodes ont été utilisées pour enrichir le sécrétome. Une de ces méthodes est la culture des cellules souches sous forme 3-D. Nous avons donc testé le potentiel thérapeutique des ASC sous forme de monocouche (ML pour Monolayer) et sous forme de sphéroïdes (SB pour spheroid bodies) dans deux modèles animaux différents. Ceci a été fait en testant l’efficacité d’une transplantation à distance sous cutanée. En utilisant un modèle de péritonite, les ASC sous forme SB et ML ont démontré un effet antiinflammatoire en réduisant l’infiltration de cellules inflammatoires, plus spécifiquement les neutrophiles et les macrophages. Dans un modèle d’ischémie reperfusion (I/R) du myocarde chez le rat, les ASC sous forme ML et SB ont diminué la cicatrice du myocarde. Les deux formes injectées ont réduit la présence de macrophages dans le myocarde, augmenté les cellules progénitrices endogènes c-kit+ ainsi que la densité vasculaire. Les SB ont démontré un impact plus significatif sur certains paramètres évalués tels la densité vasculaire et le recrutement de cellules progénitrices endogènes c-kit+. En conclusion, ces deux études ont permis de démontrer un potentiel pro-guérison des cellules souches, par l’entremise d’un effet endocrinien anti-inflammatoire. / The therapeutic potential of regenerative medicine and cell-based strategies have been in constant evolution for the last 2 decades, especially for the repair and healing of organs with minimal regenerative capacity such as the heart. Mesenchymal stem cells (MSC) represent a population of stem cells with great advantages. First isolated from bone marrow, they can now be readily isolated from different organs including adipose tissue. Adipose derived stem cells (ASC) are easily accessible, which is of great interest for clinical application. Beside their differentiation potential, the main therapeutic impact attributed to MSC and ASC has been through their secreted mediators i.e. via a paracrine phenomenon. Different strategies have been used to enhance the therapeutic impact of ASC, one of which consists of enriching the latter’s secretome by producing 3-D structures such as spheroid bodies. Monolayer (ML) and spheroid bodies (SB) were both used in two different animal models through remote (subcutaneous) transplantation. First, on a rat peritonitis model that proved that subcutaneous injection of the two forms reduced inflammation through decreased neutrophil and macrophage infiltration. Second, ML and SB were remotely transplanted on a rat myocardial ischemia reperfusion (I/R) model. The two forms reduced infarct scar, reduced macrophages, increased endogenous progenitor c-kit+ cells and enhanced vascular density in the infarct and peri-infarct area. SBs showed better impact on vascularization and endogenous progenitor cells recruitment compared to ML. Briefly, our studies demonstrated the efficacy of a remote ASC transplantation through an endocrine-like effect against inflammation, collagen deposition and vascularization.

Cette thèse présente des travaux sur l’étude et la calibration de modèles d’équations aux dérivées partielles pour la croissance tumorale. La première partie porte sur l’analyse d’un modèle de croissance tumorale pour le cas de métastases au foie de tumeurs gastro-intestinales (GIST). Le modèle est un système d’équations aux dérivées partielles couplées et prend en compte plusieurs traitements dont un traitement anti-angiogénique. Le modèle permet de reproduire des données cliniques. La première partie de ce travail concerne la preuve d’existence/unicité de la solution du modèle. La seconde partie du travail porte sur l’étude du comportement asymptotique de la solution du modèle lorsqu’un paramètre du modèle, décrivant la capacité de la tumeur à évacuer la nécrose, converge vers 0. La seconde partie de la thèse concerne le développement d’un modèle de croissance pour des sphéroïdes tumoraux ainsi que sur la calibration de ce modèle à partir de données expérimentales in vitro. L’objectif est de développer un modèle permettant de reproduire quantitativement la distribution des cellules proliférantes à l’intérieur d’un sphéroïde en fonction de la concentration en nutriments. Le travail de modélisation et de calibration du modèle a été effectué à partir de données expérimentales permettant d’obtenir la répartition spatiale de cellules proliférantes dans un sphéroïde tumoral. / In this thesis, we present several works on the study and the calibration of partial differential equations models for tumor growth. The first part is devoted to the mathematical study of a model for tumor drug resistance in the case of gastro-intestinal tumor (GIST) metastases to the liver. The model we study consists in a coupled partial differential equations system and takes several treatments into account, such as a anti-angiogenic treatment. This model is able to reproduce clinical data. In a first part, we present the proof of the existence/uniqueness of the solution to this model. Then, in a second part, we study the asymptotic behavior of the solution when a parameter of this model, describing the capacity of the tumor to evacuate the necrosis, goes to 0. In the second part of this thesis, we present the development of model for tumor spheroids growth. We also present the model calibration thanks to in vitro experimental data. The main objective of this work is to reproduce quantitatively the proliferative cell distribution in a spheroid, as a function of the concentration of nutrients. The modeling and calibration of this model have been done thanks to experimental data consisting of proliferative cells distribution in a spheroid.

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

Le cancer du sein est une maladie complexe et difficile à caractériser. Parmi les différents sous-types moléculaires, les tumeurs du sein Triple-Négatives (TN) sont particulièrement agressives et de mauvais pronostic. Elles sont caractérisées par une absence d’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER), à la progestérone (PR), l’absence de surexpression du récepteur Human Epidermal growth factor 2 (HER2) et de fréquentes mutations sur les gènes BRCA1/2 (profil « BRCAness »). En absence de thérapies ciblées efficaces, de nombreux traitements ciblés notamment les inhibiteurs de poly-ADP-ribose polymérases (anti-PARPs) sont actuellement en cours de développement, en recherche préclinique et clinique. Basés sur le principe de létalité synthétique, les anti-PARPs ciblent les propriétés BRCAness des tumeurs TN. Dans ce contexte, ces travaux de recherche ont été orientés sur le développement d’outils diagnostics afin d’optimiser l’efficacité des anti-PARPs sur des tumeurs TN. Pour ce faire, dans un premier temps, des cultures cellulaires en 3D via la technique Liquid Overlay ainsi que des tests de cytotoxicités associés ont été développés, à partir des lignées cellulaires MDA-MB-231 et SUM1315 de phénotype TN. Ces deux modèles de sphéroïdes ont ensuite été optimisés/normalisés dans un milieu de culture synthétique intitulé OPTIPASS (BIOPASS). Dans un deuxième temps, l’efficacité d’un co-traitement combinant l’anti-PARP1 Olaparib à faibles et à fortes doses et la radiothérapie fractionnée (5x2 Gy) a été modélisée sur les deux lignées MDA-MB-231 et SUM1315, en conditions 2D et 3D. Ces expériences ont clairement mis en évidence un effet potentialisateur de l’Olaparib sur la radiothérapie (i) en présence de faibles doses de cet anti-PARP (5 µM ou inférieur) (ii) à long terme et (iii) en présence d’un fractionnement maximum (5x2 Gy). De plus, les lignées tumorales TN étudiées présentaient des différences de sensibilité vis-à-vis du co-traitement. Ainsi, une analyse transcriptomique in silico a mis en évidence des profils très différents de ces lignées hautement métastatiques et très agressives. Notamment, la lignée SUM1315 semblait présenter un engagement neuronal, suggérant son origine métastatique cérébrale. Ces résultats encourageants pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des métastases cérébrales de tumeurs mammaires TN, très fréquentes chez ce sous-type. Dans un troisième temps, afin de mieux caractériser le mode d’action de l’Olaparib sur ces modèles de sphéroïdes, un dérivé fluorescent de l’Olaparib, l’Ola-FL, a été synthétisé et caractérisé. L’analyse de la pénétration et de la distribution de l’Ola-FL au sein des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 a mis en évidence une distribution rapide et homogène du composé ainsi que sa persistance après 3h d’incubation, dans toute la profondeur des sphéroïdes et notamment dans les zones hypoxiques centrales. Enfin, l’analyse de la co-expression de deux pompes Multidrug Resistance (MDR) majeures, la MRP7 et la P-gp après le traitement des deux lignées TN avec l’Olaparib, a mis en évidence sur les cultures 2D, une expression de type relai de la MRP7 et la P-gp. Sur les sphéroïdes traités avec une faible dose d’Olaparib à long terme, une expression basale de la MRP7 et une surexpression de la P-gp ont été détectées, au sein des cellules résiduelles périphériques des sphéroïdes. Ces résultats mettent clairement en évidence l’implication des pompes d’efflux dans les mécanismes de résistances à l’Olaparib, dans ces tumeurs agressives. L’ensemble des résultats issus de la modélisation de l’action de l’Olaparib sur des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 laissent supposer sa plus grande efficacité à faible dose et à long-terme, notamment dans les zones hypoxiques des sphéroïdes, probablement aussi à l’origine de son effet potentialisateur avec la radiothérapie. / Breast cancer is a very complex and heterogeneous disease. Among the different molecular subtypes, Triple-Negative (TN) breast cancers are particularly aggressive and of poor prognosis. TN tumours are characterized by a lack of estrogen receptors expression (ER), progesterone receptors expression (PR), the absence of Human Epidermal growth factor receptor 2 overexpression (HER2) of the frequent mutations on BRCA1 / 2 genes ("BRCAness" phenotype). In the absence of effective targeted therapies, many targeted therapies including poly-ADP-ribose polymerase inhibitors (anti-PARPs) are currently under development in preclinical and clinical studies. Based on the synthetic lethality concept, the anti-PARPs specifically target the BRCAness properties of TN tumors. In this context, these works were focused on the development of diagnostic tools for the optimization of TN tumours treatment with anti-PARPs. For this, firstly, 3D cell cultures formed with the Liquid Overlay technique as well as associated cytotoxicity tests were developed, from the TN breast cancer cell lines MDA-MB-231 and SUM1315. These two spheroid models were then optimized and standardized in a synthetic culture medium called OPTIPASS (BIOPASS). Secondly, the efficacy of a co-treatment combining anti-PARP1 Olaparib at low and high doses and fractioned radiotherapy (5x2 Gy) was analyzed on the two cell lines MDA-MB-231 and SUM1315 cultured in 2D and 3D conditions. These experiments clearly demonstrated a potentiating effect of Olaparib on radiotherapy (i) in presence of low doses of this anti-PARP (5 μM or inferior) (ii) at long term and (iii) in presence of the maximum fractionation (5x2 Gy). In addition, these two TN cell lines showed a heterogeneous sensitivity to the co-treatment. Thus, an in silico transcriptomic analysis revealed very different profiles of these highly metastatic and highly aggressive cell lines. Notably, the SUM1315 cell line presented a neuronal commitment, suggesting its cerebral metastatic origin. These promising results could open up new perspectives for the treatment of TN tumours brain metastases, which are very common in this subtype. Thirdly, in order to better characterize the mode of action of Olaparib on these spheroid models, a fluorescent derivative of Olaparib, Ola-FL, was synthesized and characterized. The analysis of Ola-FL penetration and distribution in MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids showed a rapid and homogeneous distribution of the compound as well as its persistence after 3h of incubation, in all the depth of the spheroids and especially in the central hypoxic zones. Finally, the analysis of the co-expression of two major Multidrug Resistance (MDR) pumps, MRP7 and P-gp after the treatment of the two TN lines with Olaparib, revealed on 2D cultures, a relay type expression of the MRP7 and the P-gp. On spheroids treated with a low dose of Olaparib art long term (10 days), a basal expression of MRP7 and an overexpression of P-gp were detected in the peripheral residual cells of the spheroids. These results clearly highlighted the involvement of these efflux pumps in Olaparib resistance mechanisms, in these aggressive tumors. All the results resulting from the modeling of the action of Olaparib on MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids suggest its greater efficacy at low dose and at long-term, especially in the hypoxic zones of the spheroids. This parameter might be probably at the origin of its potentiating effect with radiotherapy.