Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten. / The definitive treatment of type 1 diabetes, namely transplantation of isolated pancreatic islets, is limited by rareness of donor organs. Generation of insulin producing cells from human pancreatic islet derived nestin+ precursors is well feasible and has recently been demonstrated (Zulewski et al, Diabetes 50:521, 2001). We therefore characterized a putative stem population of human islet-derived progenitor cells grown out of human pancreatic islets (hIZ). As we show here, these cells have a mesenchymal phenotype, express the filament protein nestin and feature a mean life span of 16 passages with continuous decrease of growth from passage 6 until growth arrest. This hampers the development of efficient differentiation strategies. We therefore tested the growth enhancing properties of the proliferation associated protein p8 in human nestin+ hMSC-TERT bone marrow derived adult stem cells, which share a similar phenotype as hIZ and have excellent differentiation potential not only into endocrine phenotypes. hMSC-TERT cells were transfected with CMV promoter driven p8-IRES-GFP or mock-IRES-GFP vectors. Transient transfection results in significantly increased numbers of GFP+ cells after 12 and 18 hours which remain elevated for up to 30 h. Loss of growth induction at later timepoints is caused by dilution of cellular plasmid content during mitosis. In contrast, stably transfected and selected subclones with p8 overexpression display durable significant augmentation of growth index (cell numbers) by 1.75 fold mock, respectively. This effect is not only due to an extensive increase in proliferation (BrdU+ cells, 2,7 fold mock) but also to a decrease in basal apoptosis (Caspase+ cells, -40% mock), as we could demonstrate. We characterized p8 as a potent molecular mediator of growth and expansion of mesenchymal stem cells such as hMSC-TERT and hIZ acting through both induction of cell proliferation and inhibition of apoptosis. These properties of p8 may be useful in the development of stem cell based tissue regeneration strategies by providing sufficient supply of homogeneous and fast-growing stem cell cultures for differentiation. In this way, the problem of limited availability of human donor material for definitive treatment of diabetes mellitus type 1 could be solved.

Knochenmarksstammzellen werden als mögliche Zellquelle zur Verbesserung kardialer Funktion nach Myokardinfarkt angesehen. Um die Rolle und das Potential verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt weiter zu untersuchen, wurde auf das Maus-Infarkt-Modell zurückgegriffen. Nach experimentellem Myokardinfarkt durch Ligation der vorderen absteigenden Koronararterie erfolgte entweder die intramyokardiale Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen oder einer mit Vorläufer- (Lin-) bzw. reifen (Lin+) Zellen angereicherten Knochenmarkszellsubpopulation. Obgleich mit keiner Zellpopulation entscheidend Einfluss auf Überlebensrate und Infarktgröße genommen werden konnte, zeigte sich eine signifikante Verbesserung des linksventrikulären Remodelings nach Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen, welche hingegen durch Behandlung mit Lin- oder Lin+ Zellen ausblieb. Gemessen wurde dies einerseits auf molekularer Ebene, wo der linksventrikuläre Hypertrophiemarker, bestehend aus betaMHC/alphaMHC-Ratio signifikant gesenkt werden konnte, andererseits auf echokardiographischer Ebene, wo sich eine signifikante Verminderung linksventrikulärer Dilatation nachweisen ließ. Da sich die untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich in vitro gemessener Zytokinexpressionslevel teilweise erheblich unterschieden, müssen die beobachteten Resultate im Zusammenhang mit stattgefundener parakrine Zytokinsekretion gesehen werden. / Bone marrow stem cells are considered as a promising cell source to improve cardiac function after myocardial infarction. To further investigate the role and potential of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodelling we employed the mouse-infarct-model. After induction of myocardial infarction through ligation of the left descending coronary artery, mice were treated either with intramyocardial injection of unfractionated bone marrow cells, progenitor-enriched (Lin-) or mature (Lin+) cells.Although none of the cell populations showed a pronounced influence on survival rate or infarct size, there was a significant amelioration of left ventricular remodelling after injection of unfractionated bone marrow cells, which could not be accomplished by treatment with Lin- or Lin+ cells. This effect was measured both on molecular basis, where the left ventricular hypertrophie marker, consisting of the betaMHC/alphaMHC-ratio was significantly decreased, and on echocardiographic basis, where a significant reduction of left ventricular dilatation was demonstrated. Considering the substantial differences in in-vitro measured cytokine-levels observed in the investigated cell populations, the results shown could potentially be attributed to paracrine secretion of cytokines.

Neben den omnipotenten embryonalen Stammzellen existieren im menschlichen Körper adulte mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese Zellen sind in mesenchymalen Geweben über den gesamten Organismus verteilt und sorgen für die Entwicklung und Erneuerung von mesenchymalen Geweben wie Knochen, Knorpel und Bändern. Daher gelten die MSZ im Gegensatz zu den omnipotenten embryonalen Stammzellen als multipotent. Diese verschiedenen MSZ stellen keine homogene Population dar, zeigen aber sowohl in vivo und auch in vitro ein ähnliches Differenzierungsverhalten. In der vorliegenden Arbeit wurde nun eine aus den Knochentrabekeln selbst isolierte MSZ-Population, so genannte bhMSZ, mit MSZ aus dem Knochenmark, mhMSZ genannt, mittels Array-Analyse miteinander verglichen. Die technische Evaluation des Array respektive der zugehörigen SAM-Analyse (significance analysis of microarrays) mittels konventioneller oder Real-Time PCR diente dazu, die Verlässlichkeit der Aussage der Hybridisierungsverfahren zu überprüfen. Dies wurde mit einem Set an ausgewählten Genen durchgeführt, die signifikant differentiell exprimiert waren, und die im Rahmen der Stammzellbiologie relevant erschienen. Die Analyse zeigte, dass die Übereinstimmung der Aussage im Array in über 80 % mit den Ergebnissen der RT-PCR kongruent war. Auf Grund starker interindividueller Schwankungen zeigte sich aber auch, dass die Anzahl der Spender 5 nicht unterschreiten sollte. Im Rahmen der Untersuchungen ergab sich, dass offenbar bei MSZ der Passage 0 eine Kontamination der MSZ mit Plasmazellen vorliegt. Weitere Versuche zeigten, dass erst das Passagieren der MSZ kontaminierende Plasmazellen weitgehend aus der Zellkultur entfernte. Aus diesem Grund wurde in einer weiteren Array Analyse das Transkriptom von MSZ aus Knochentrabekeln mit MSZ aus dem Knochenmark in Passage 1 verglichen. Es zeigten sich in einer stringenten SAM-Analyse keine Unterschiede im Transkriptom. Für klinische Anwendungen scheinen die bhMSZ daher auf Grund der aufwendigeren Isolierung und des dennoch eher geringen Zellgewinns nicht im gleichen Maß für klinische Anwendungen geeignet wie mhMSZ. / The human body contains besides omnipotent embryonal stem cells also adult mesenchymal stem cells (MSC). These cells are spread all over the organism in mesenchymal tissues and are responsible for the development and regeneration of mesenchymal tissues like bone, cartilage and ligaments. Therefore these cells are called multipotent in comparison to the omnipotent embryonal stem cells. The different types of MSC are not a homogeneous population, but show in vivo and in vitro a similar differentiation behavior. The aim of this work was to compare the population of MSC isolated from bone marrow stroma (bhMSC) with MSC isolated from bone fragments (bhMSC) via microarray analysis. The technical evaluation of this array was performed by conventional or real-time PCR to evaluate the reliability of the hybridization procedure. This was done with an assortment of genes, which were differentially expressed, and were estimated to be relevant for the biology of stem cells. The analysis showed 80% accordance between the results of the microarray analysis and the PCR. In addition, the results showed that the number of the analysed individuals shouldn’t be under 5, because of a high interindividual variability. Besides this the experiments showed, that MSC of passage 0 are obviously contaminated with plasma cells. Further tests showed that contaminating plasma cells were widely removed in cell cultures of MSC passage 1. Therefore an additional array analysis was performed comparing MSC isolated from bone marrow stroma in passage 1 with those isolated from bone fragments. No difference could be observed in terms of their transcriptomes obtained by stringent SAM analysis. For clinical purposes bhMSC seem to be less suited because of the more sophisticated isolation procedure and nevertheless the lower cell number yield.

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren. In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind. Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt. In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann. / Embryonic stem cells (ESCs) are characterized by their ability for continuous self-renewal maintaining the undifferentiated cell state and their capacity to generate all differentiated cell types of the three germ layers. Regulators of these characteristics include a protein interaction network of pluripotency-specific factors and epigenetic mechanisms that together control the transcription of pluripotency- and differentiation-associated genes. Among the interaction partners of the pluripotency-specific protein network in murine ESCs are Polycomb group (PcG) proteins. These proteins assemble in two complexes termed Polycomb group repressive complex 1 and 2 (PRC1 and PRC2). In the classical model, PRC1 and PRC2 act hierarchically together in catalyzing two characteristic histone modifications thereby contributing to the repression of PRC-specific target genes like differentiation-associated genes in ESCs. Recently, it has been shown that there are numerous PRC1 variants that differ in their protein composition. In this context, the family of Polycomb group RING finger (Pcgf) proteins (Pcgf1 – 6) defines distinct PRC1 variants (PRC1.1 – 1.6) that exhibit complex-specific genomic binding sites. Together, this indicates diverse mechanisms of PRC1 variants and Pcgf Paralog-specific functions that are not well understood. Pcgf Paralogs are known to play essential roles in various stem cell types and during iPS reprogramming. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) and Pcgf4 (Bmi1) function in diverse adult stem cells. Further, Pcgf4 plays a role in murine iPS Reprogramming. For Pcgf6 (Mblr), a pluripotency-associated function is assumed. Pcgf6 is the only Pcgf paralog with an elevated expression in murine ESCs and when ESCs differentiate Pcgf6 expression decreases. In addition, following Pcgf6 KD in ESCs the expression of Oct4, Sox2 and Nanog declines while mesodermal and testes-specific genes become de-repressed. Furthermore, Pcgf6 KD ESCs are more prone for hematopoietic lineage differentiation. The precise mechanisms by which Pcgf6 controls these processes in murine ESCs are not known. In this work, I investigated the function of Pcgf6 in murine iPS reprogramming. I assumed a role for Pcgf6 in iPS reprogramming because it is highly expressed in ESCs and it was recently shown that Pcgf4 plays a role in the reprogramming of somatic cells. The data of my work show that Pcgf6 expression is increased in iPS reprogramming and that Pcgf6 exhibits an ESC-like gene expression pattern in iPS cells. Furthermore, Pcgf6 was able to replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. In addition, OPKM-induced iPS cells showed pluripotency-specific characteristics. The overexpression of Pcgf6 together with the OSKM factors did not result in significantly increased reprogramming efficiencies indicating that Pcgf6 does not function as an enhancer-factor. However, Pcgf6 knockdown (KD) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in decreased efficiencies after iPS reprogramming. Additionally, the majority of AP+ colonies formed after OSKM reprogramming of Pcgf6 KD MEFs represented partially reprogrammed iPS cells, as they did not exhibit ESC-like morphologies and reduced expression levels of Oct4, Sox2 and Nanog. Together, the data of my work show that Pcgf6 is a new and essential factor in iPS reprogramming that can specifically replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc.

Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms. During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation. KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation. In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells. / Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung. Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten. KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert.

Stammzellbasierte Therapieverfahren versprechen neue Lösungen für bisher nur unzureichend behandelbare Erkrankungen. In der Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde ist die Herstellung von Knorpel im Rahmen des Tissue Engineering von besonderem Interesse. Die mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes (ASC) stellen eine vielversprechende Zellpopulation als Ausgangspunkt für die Erzeugung von Gewebe dar. Auf Grund der hohen Zahl an Zellteilungen, oxidativem und mechanischem Stress sowie enzymatischer Verdauung steigt im Rahmen der in vitro Expansion das Risiko für DNA-Schäden. Diese können wiederum der Ausgangspunkt für die maligne Transformation einer Zelle sein. Ziel unserer Studie war es, zu zeigen, ob die Expansion und mehrfache Passagierung zu einer zunehmenden genetischen Instabilität der ASC führt. Es wurden frische ASC aus Liposuktionsaspirat von 8 verschiedenen Patienten isoliert. Mit ASC der Passagen 1, 2, 3, 5 und 10 wurde zur Detektion von Schäden auf DNA-Ebene jeweils eine alkalische Einzelzellgelelektrophorese(Comet Assay) und ein Mikrokerntest durchgeführt. Zur Erfassung von Schäden auf Chromatidebene erfolgte darüber hinaus mit Zellen der selben Passage ein Chromosomenaberrationstest. Mit dem Comet Assay und dem Mikrokerntest konnte keine signifikante Progression der genetischen Instabilität mit zunehmender Passage nachgewiesen werden. Beim Chromosomenaberrationstest zeigte sich im Friedman-Test eine signifikante Zunahme an strukturellen Chromosomenaberrationen mit steigender Passage. Der Wilcoxon-Test hingegen erbrachte kein signifikantes Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Daten zeigen, dass eine zunehmende genetische Instabilität der ASC mit zunehmender Dauer der Expansion und steigender Passage nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Aus diesem Grund sollten vor einer Transplantation regelhaft Untersuchungen wie beispielsweise ein Chromosomenaberrationstest oder ein Screening auf typische malignitätsfördernde Mutationen erfolgen. / Stem-cell based therapies promise new solutions for diseases which are insufficiently treatable up to now. In Otorhinolaryngology, the in vitro production of cartilage for tissue engineering approaches is of particular interest. Mesenchymal adipose-derived stem cells (ASCs) are a promising cell population for the production of tissue. Due to a high number of cell divisions, oxidative and mechanical stress as well as enzymatic digestion there is an increasing risk of DNA-damage during in vitro expansion. This DNA-damage can lead to a malignant transformation of the ASCs. The aim of our study was to show whether prolonged in vitro expansion leads to an increased genetic instability of ASCs. Human ASCs were isolated from subcutaneous adipose tissue of different donors (n = 8) undergoing liposuction surgery for aesthetic reasons. To detect DNA-damage, an alkaline single-cell microgel electrophoresis (comet) assay and a micronucleus assay were performed with cells of passage 1,2,3,5 and 10. Moreover, to assess chromosomal damage, a chromosomal aberration test was carried out with cells of the same passage. With the comet assay and the micronucleus assay, no significant progress of DNA-damage could be demonstrated. However, the chromosomal aberration test showed a significant increase of structural chromosomal damage. The results of our study underline the fact that an increasing genetic instability of ASCs during prolonged in vitro expansion cannot be completely excluded. Consequently, tests monitoring malignant transformations or genetic instability should be implemented before transplantation of ASCs.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für weiterführende Studien ausgewählt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden. / The blood-brain barrier (BBB) presents one of the tightest and most important barriers between the blood circulation and the central nervous system (CNS). The BBB consists of specialized endothelial cells, which line the cerebral capillaries and are connected through very dense tight junctions (TJs). Together with pericytes, astrocytes, neurons, microglial cells and the extracellular matrix of the basal membrane of the brain capillaries, they form a dynamic and complex regulatory system, the so-called neurovascular unit (Hawkins and Davis 2005). The main functions of the BBB can be divided into three subgroups, the physical-, metabolic- and transport-barrier (Neuhaus and Noe 2010). The BBB mainly serves to maintain the homeostasis of the CNS and for protection against neurotoxical substances and pathogens, such as bacteria and viruses. Moreover, the BBB ensures the supply of neurons with nutrients and regulatory substances. Furthermore, it is responsible for the efflux of CNS metabolism waste products. For the development of drugs applied for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis or even brain tumors, the tightness of the BBB models towards substances and the high metabolic activity of the endothelial cells pose a problem. Numerous drugs cannot overcome the BBB in sufficient enough concentration to reach the target location or they are metabolized before transportation and thus become less effective. Moreover, defects of the BBB play a decisive role in the manipulation of the pathogenesis of numerous CNS diseases. Due to the high demand for test systems in basic and preclinical research of drug development and infection studies, a range of different BBB models have been developed. Besides the in silico, acellular in vitro and in vivo models, numerous cell-based BBB models have been developed. However, standardized models based on immortalized cell lines show only inhomogeneous TJ expression and possess low barrier integrity which is detected through transendothelial electrical resistance (TEER) below 150 · cm2 (Deli et al. 2005). In comparison, the TEER values in animal tests reached more than 1500 · cm2 at the BBB (Butt et al. 1990; Crone and Olesen 1982). The availability of human primary BBB cells is highly limited. Moreover, using human primary BBB cells is an extremely serious matter, not only in respect of ethical aspects. Human brain cells can, for instance, be isolated from biopsy or autopsy material obtained from patients suffering epilepsy or brain cancer. However, there is the risk that the isolated cells are altered due to disease, which may significantly change the features of the BBB models. An alternative to avoid such problems and to provide standardized human BBB models by the use of reproducible conditions, is the application of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In this context, it has been successful to differentiate hiPSCs in vitro – under established and reproducible methods – into endothelial cells of the BBB (hiPS-ECs), neural stem cells (hiPS-NSCs) as well as astrocytes (hiPS-A) (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013; Reinhardt et al. 2013) and to use them for model establishment. The endothelial cells were examined for the existence and the functionality of endothelial-specific markers as well as specific transporters by protein- and gene-based methods. Within this work, the croypreservation of hiPS-EC progenitors was established. This will allow an increase of the spatial and temporal flexibility while working with the stem cell based models as well as the establishment of standardized cell banks. Furthermore, multipotent NSCs, isolated from fetal brain biopsies (fNSCs), were used as a control population for hiPSC-NSCs and for BBB modelling. In order to imitate the in vivo BBB in the best possible way and to optimize model characteristics, a set of ten different BBB models based on primary cells, hiPSCs and fNSCs was analyzed. Model establishment was done by the use of transwell systems. By the systematically analysis of the influence of the different neurovascular unit cell types on barrier integrity and on endothelial cell gene expression, the quadruple culture with pericytes, astrocytes and hiPS-NSCs was identified demonstrating the most physiological properties. Due to the significant increase of TEER results up to 2500 · cm2 as well as the at least 1.5-fold increase in gene expression of BBB relevant transporter and TJ markers compared to the mono-cultures, this model was selected for further studies. The presence of a complex in vivo-like TJ network, based on occludin, claudin 1, 3, 4 and 5 was detected by quantitative reale time PCR, Western blot analyses as well as on ultrastructural level by freeze fracture electron microscopy and transmission electron microscopy. Beside the limitation of the paracellular permeability, proven by the low permeation of FITC dextran (4 kDa and 40 kDa), fluorescein and Lucifer yellow, the BBB represents also a barrier for transcellular transported substances. A model evaluation, to assess the models qualification to be used for drug screenings, was proven by transport studies based on BBB relevant reference substances. The classification of the test substances was made analog their permeation rates: diazepam and caffeine are classified as fast, ibuprofen, celecoxib and diclofenac as medium, and loratadine and rhodamine 123 as slow permeating substances. Within our tests, this ranking based on literature data could be confirmed by using the quadruple-culture models, only caffeine was transported with a significantly decreased permeation coefficient compared to the mono-cultures. Furthermore, the implementation of the hiPSC technology allows the generation of a large quantity of human somatic cell types form only one single stem cell line and their provision for specific applications. Within this work it was shown, that by the use of an in-house constructed stirred tank bio-reactor, providing defined culture conditions, a reproducible expansion of hiPSCs was enabled. On this basis, a high throughput drug screening might be possible. The data presented within this work demonstrate the establishment of a stem cell based in vitro quadruple-model of the human BBB with in vivo-like characteristics. All minimal requirements for human BBB modeling, including the reproducibility of the results, adequate characterization with regard on the permeability of reference components, expression of BBB transporters as well as the robust and physiological morphology are fulfilled. The established BBB model can be used in pharmaceutical drug development. In preclinical research adequate qualified models are asked for toxicity and transport studies with new developed substances in order to allow a better in vitro-in vivo correlation of the results. Moreover, the model can be used to develop mechanisms to selectively overcome the barrier.

Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen. Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein. Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen. Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen. Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten. Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden. Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern. / Tumor stem cells seem to be the engine for initiation and progression of breast cancer. By their potential for unlimited proliferation, dissemination and relapse they largely determine the prognosis and mortality of breast cancer patients. This thesis shows mechanisms breast cancer (stem) cells use to escape from an immune response by NK cells. Using flow cytometry analysis, we defined a subpopulation of CD44highCD24low cells corresponding to the tumor stem cell fraction of MCF-7 breast cancer cells. Compared to the native MCF-7 cell population we observed an enrichment of tumor stem cells in vitro after co-culture with activated NK cells from healthy human donors. Incubation of breast cancer cells with NK cell supernatant resulted in no significant change, which implies that the observed NK cell-mediated enrichment of the cancer stem cell population depends on direct cell-cell contact. One possibility is that these tumor stem cells could be enriched by selection, i.e. by preferential killing of their more differentiated counterparts. Alternatively, they could arise de novo via epithelial to mesenchymal transition (EMT). A selection process was supported by data showing reduced surface expression of NK cell ligands on tumor stem cells compared to non-stem cells. The investigated breast cancer cell lines (MCF-7, SKBR 3, BT 474 and MDA MB 231) showed a distinctly regulated pattern of activating NKG2D-ligands (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3) and DNAM 1-ligands (CD112, CD155) and of MHC1-molecules on tumor stem cells and non-stem cells. The comparatively lower expression of NK cell ligands suggests a reduced vulnerability of tumor stem cells towards NK cells. However, we also showed the induction of tumor stem cells from differentiated epithelial tumor cells via EMT. Tumor cells with the phenotype CD44highCD24low arose de novo from a stem cell depleted MCF-7 tumor cell population which was then co-incubated with NK cells. Downregulation of the epithelial cell adhesion molecule E-cadherin as well as upregulation of mesenchymal markers such as the structural protein vimentin, the EMT-inducing transcription factors Slug, Snail and Twist and the stem cell-typical transcription factors Oct4, KLF4 and cMyc on mRNA level indicate an EMT-triggered induction of tumor stem cells after co-culture of MCF-7 with NK cells. We also found that the direct contact between tumor cells and non-lytic NK cells is of vital importance for the induction of tumor stem cells. These cell-cell interactions appeared to depend on NKG2D and DNAM-1 and to include a consecutive stem cell induction via EMT. As the proportion of tumor stem cells after co-culture of native MCF-7 cells and NK cells was almost twice the number of stem cells arisen from an equally treated stem cell depleted fraction we can assume that an above-average survival of tumor stem cells due to selection stress can also contribute to immune escape. Regarding their clonogenicity we noticed no difference between pre-existent and induced tumor stem cells. Both fractions possessed the ability to generate new colonies of similar quantity. Thus, we showed that upon exposure to NK cells EMT-triggered induction considerably contributes to the enrichment of breast cancer stem cells. An additional process of stem cell selection seems to be realistic. Interactions of the NK cell receptors NKG2D and DNAM 1 and its ligands on tumor cells respectively seem to play a key role. The recognition that de-differentiation may represent a previously unrecognized immune escape mechanism of breast cancer cells could serve as a starting point for medical interventions, with the aim of preventing stem cell accumulation in breast cancer and thus improving the prognosis of breast cancer patients.

Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab. / Summary During mammalian ontogeny an organism develops from a totipotent zygot that is composed of more than 200 distinct cell types. The development and the maintanance of the organism is dependent on somatic stem cells. Transient stem cell types exist during early embryonic development, but homoestasis of the adult is maintained by resident somatic stem cells. The restriction in committent to the exclusive generation of cells of their own stem cell system was considered as a hallmark of adult stem cells. The objective of the present thesis was to investigate whether somatic stem cells are truly restricted to the generation of cells belonging to their own stem cell system only. To this end three somatic stem cell types, murine hematopoietic, human hematopoietic and murine neural stem cells were injected into murine blastocysts. The blastocysts provides the injected stem cells with a microenvironment permissive for the generation of all cell types of the adult organism. It could be shown using this method that progeny of murine and human hematopoietic and murine neural stem cells preferentially engrafted the hematopoietic tissues of the developing embryo. Furthermore, injection of human hematopoietic and murine neural stem cells gave rise to hematopoietic progenitors cells in fetal hematopoietic tissues, and generated cells with an erythroid gene expression pattern. Comparison of adult chimeric animals revealed that progeny of hematopoietic stem cells had engrafted hematopoietic and neural tissues to a similar extent, whereas progeny of neural stem cells was preferentially detected in neural tissues. This result indicates, that somatic stem cells can generate heterologous cells if exposed to the early embryonic environment. Furthermore, it demonstrates the distinct and different developmental potentials of hematopoietic and neural stem cells and and distinguishes them from the pluripotent differentiation potential of ES-cells.

Zugl.: Düsseldorf, Univ., Diss., 2006 u.d.T.: Friele, Minou B.: Brauchen wir eine internationale Regulierung der Embryonenforschung?