Univ., Diss. u.d.T.: Friele, Minou B.: Brauchen wir eine internationale Regulierung der Embryonenforschung?--Düsseldorf, 2006.

We introduce a novel dynamic model of stem cell and tissue organisation in murine intestinal crypts. Integrating the molecular, cellular and tissue level of description, this model links a broad spectrum of experimental observations encompassing spatially confined cell proliferation, directed cell migration, multiple cell lineage decisions and clonal competition. Using computational simulations we demonstrate that the model is capable of quantitatively describing and predicting the dynamic behaviour of the intestinal tissue during steady state as well as after cell damage and following selective gain or loss of gene function manipulations affecting Wnt- and Notch-signalling. Our simulation results suggest that reversibility and flexibility of cellular decisions are key elements of robust tissue organisation of the intestine. We predict that the tissue should be able to fully recover after complete elimination of cellular subpopulations including subpopulations deemed to be functional stem cells. This challenges current views of tissue stem cell organisation.

Here we describe some of the crucial steps to generate induced pluripotent stemcells (iPSCs) usingmRNA transfection. Our approach uses a V. virus-derived capping enzyme instead of a cap-analog, ensuring 100% proper cap orientation for in vitro transcribedmRNA. V. virus\' 2′-O-Methyltransferase enzymecreates a cap1 structure found in higher eukaryotes and has higher translation efficiency compared to other methods. Use of the polymeric transfection reagent polyethylenimine proved superior to other transfection methods. The mRNA created via this method did not trigger an intracellular immune response via human IFN-gamma (hIFN-γ) or alpha (hIFN-α) release, thus circumventing the use of suppressors. Resulting mRNA and protein were expressed at high levels for over 48 h, thus obviating daily transfections. Using this method, we demonstrated swift activation of pluripotency associated genes in human fibroblasts. Low oxygen conditions further facilitated colony formation. Differentiation into different germ layers was confirmed via teratoma assay. Reprogramming with non-synthetic mRNA holds great promise for safe generation of iPSCs of human origin. Using the protocols described herein we hope to make this method more accessible to other groups as a fast, inexpensive, and non-viral reprogramming approach.

Homeostasis of hematopoietic stem cells (HSC) in the mammalian bone marrow stem cell niche is regulated by signals of the local microenvironment. Besides juxtacrine, endocrine and metabolic cues, paracrine and autocrine signals are involved in controlling quiescence, proliferation and differentiation of HSC with strong implications on expansion and differentiation ex vivo as well as in vivo transplantation. Towards this aim, a cell culture analysis on a polymer microcavity carrier platform was combined with a partial least square analysis of a mechanistic model of cell proliferation. We could demonstrate the discrimination of specific autocrine and paracrine signals from soluble factors as stimulating and inhibitory effectors in hematopoietic stem and progenitor cell culture. From that we hypothesize autocrine signals to be predominantly involved in maintaining the quiescent state of HSC in single-cell niches and advocate our analysis platform as an unprecedented option for untangling convoluted signaling mechanisms in complex cell systems being it of juxtacrine, paracrine or autocrine origin.

Das Verfahren der Hochdosischemotherapie mit nachfolgender autologer Stammzelltransplantation ist eine etablierte, gut untersuchte Therapieoption in der Behandlung hämatoonkologischer Erkrankungen. Die sich dabei entwickelnde Thrombozytopenie stellt einen der therapielimitierenden Faktoren dar, wobei sich hier große interindividuelle Unterschiede zeigen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Einflussfaktoren auf die Regeneration der Thrombozytenzahlen nach Hochdosistherapie und autologer Transplantation zu untersuchen. Hierzu erfolgte eine retrospektive Untersuchung von 110 Patientendaten, die von 1994 bis 2003 an der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums behandelt wurden. Die Thrombozytenzahlen wurden vier Wochen, drei Monate und sechs Monate nach Transplantation dokumentiert, außerdem wurde die Dauer in Tagen bis zu dem Erreichen der beiden Thrombozytenschwellenwerte 10.000/µl und 20.000/µl untersucht. An potentiellen Einflussfaktoren gingen das Alter zum Zeitpunkt der Transplantation, der body mass index zum Zeitpunkt der Transplantation, das Geschlecht, das Vorhandensein einer vorausgegangenen Ganzkörperbestrahlung, das Vorhandensein einer Antibiotikagabe aufgrund einer transplantationsassoziierten Infektion, die Aplasiedauer, die Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, die Anzahl der transfundierten colony forming units (CFUs), die Anzahl der transfundierten blood forming units (BFUs), das Vorliegen eines Rezidivs und der Thrombozytenausgangswert vor Hochdosistherapie in die Analyse ein. An statistischen Testverfahren wurde der Mann-Whitney-U-Test, der Kruskal-Wallis-Test und der Korrelationskoeffizient nach Spearman verwendet, bei nachgewiesenem potentiellen Zusammenhang erfolgte eine Quantifizierung mittels multipler Regressionsanalysen. Anhand der beiden nichtparametrischen Testverfahren und der Bestimmung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman konnte gezeigt werden, dass für die Parameter „Ausgangswert der Thrombozyten vor Hochdosistherapie“, „Dauer der Aplasie“ und „Vorliegen einer Ganzkörperbestrahlung“ ein systematischer Zusammenhang zu den Thrombozytenwerten nach vier Wochen, drei Monaten bzw. sechs Monaten vorliegt. An den beiden Schwellenwerten „Dauer bis Thrombozytenzahl 10.000/µl“ und „Dauer bis Thrombozytenzahl 20.000/µl“ galt das für die Variablen „Dauer der Aplasie“, „Vorhandensein einer Antibiotikatherapie“ und „Geschlecht“. Für die restlichen Parameter konnte keine signifikante Korrelation zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden, was insbesondere für Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, CFUs bzw. BFUs überraschte und anhand klinischer Vorüberlegungen nicht zu erwarten war. Mit Hilfe der oben genannten Parameter, für die ein nichtzufälliger Zusammenhang zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden konnte, erfolgten zu den drei Messpunkten und den zwei Schwellenwerten separate multiple Regressionsanalysen. Im Ergebnis konnten fünf Gleichungen formuliert werden, die, nach Einsetzen der Prädiktoren „Dauer der Aplasie“, „Thrombozytenausgangswert vor Transplantation“ und „Geschlecht“ eine Prognose der Thrombozytenzahlen zu den entsprechenden Zeitpunkten und Zielwerten ermöglichen. Ein möglicher klinischer Einsatz dieser Ergebnisse wäre die Identifikation von Risiko- und Hochrisikogruppen im Vorfeld einer Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation anhand prognostizierter Thrombozytenwerte. Dies würde ein angepasstes therapeutisches und diagnostisches Vorgehen ermöglichen, wodurch die Sicherheit des Verfahrens und der Krankheitsverlauf verbessert werden könnten. / The protocol of high-dose chemotherapy with autologous stem cell transplantation is an approved and established option in the treatment of haematological malignancies. The developing thrombocytopenia is one of the limiting factors of this therapy, but there are large interindividual differences. The purpose of this study was to identify possible factors of influence for the recovery of the platelet count after high-dose therapy and autologous stem cell transplantation. In order to do this we did a retrospective study that analyses the data of 110 patients, who were treated by the department of medical clinic II of the University Hospital in Würzburg in the years 1994 to 2003. The platelet counts were documented four weeks, three months and six months after the autologous transplantation. Furthermore the duration of time taken for the platelet count of 10.000/µl and 20.000/µl was reviewed. The following parameters were used as potential predictors: age at the time of transplantation, body mass index at the time of transplantation, gender, previous total body irradiation, antibiotics given because of transplantation-associated infections, duration of aplasia, number of transfused CD34+-cells, number of transfused colony forming units (CFUs), number of transfused blood forming units (BFUs), relapse, and the platelet count before high-dose therapy. For the statistical evaluation the Mann-Whitney-U-Test, the Kruskal-Wallis-Test and Spearman´s rank correlation coefficient were used. The quantification of proved correlation was done by multiple regression analyses. The results of the two nonparametric tests and Spearman´s correlation coefficient showed that there was a systematic correlation for the parameters “platelet count before high-dose therapy”, “duration of aplasia” and “previous total body irradiation” to the platelet count after four weeks, three months and six months. There were also significant correlations to the two thresholds “duration until platelet count 10.000/µl” and “duration until platelet count 20.000/µl” for the variables “duration of aplasia”, “antibiotics because of associated infections” and “gender”. The remaining parameters were tested negative. This was surprising under clinical considerations, especially for the numbers of transfused CD34+-cells, CFUs and BFUs. The above mentioned significant, non-random parameters were used for the multiple regression analyses, one analysis for each of the three measurement points and the two thresholds. In the result there were five equations, which allow you to predict the platelet counts at the measurement points and thresholds. You only have to know and insert the duration of aplasia, the gender and the platelet count before high-dose therapy. A possible clinical application of predicted platelet counts could be the identification of risk and high risk groups before the application of high-dose therapy with autologous transplantation. Adjusted therapeutic and diagnostic procedures could improve the safety of the protocol with a possible positive effect on the course of the disease.

Hey1, Hey2 and HeyL are downstream effectors of the Notch signalling pathway. Hey genes play decisive roles during embryonic development for example in cardiovascular development. However, the precise transcriptional programmes and genes, which are affected by each single Hey gene, are still poorly understood. One drawback for the analysis of Hey1, Hey2 or HeyL single gene function is that these genes are co-expressed in many tissues and share a high degree of functional redundancy. Thus, it was necessary to establish a system, which is either devoid of Hey expression, or just comprises one single Hey gene family member. For this, Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- as well as Hey-triple- knock out (KO)-ES cells (embryonic stem cells) were generated in this work, because ES cells and their differentiation as EBs (embryoid bodies) represent a valuable tool for the in vitro analysis of embryonic developmental processes. After the establishment of Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells, it could be seen by ALP staining and pluripotency marker expression that loss of Hey expression did not affect ES cell pluripotency features. Thus, these ES cells represent bona fide ES cells and could be further used for the differentiation as EBs. Here, differences in gene expression between Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells (after the loss of Hey1) could be observed in realtime-RT-PCR analysis for the endodermal marker AFP as well as for neural and myogenic markers in d10 EBs. However, the establishment of inducible Hey1, Hey2 or HeyL ES cell lines will be essential to confirm these findings and to search for novel Hey target genes. To get further insight into the mode of Hey action, the analysis of Hey interaction partners is necessary. One such binding partner, the Bre protein, has previously been found in a yeast-two-hybrid screen. Bre has been described to be a member of two distinct complexes (i.e. the nuclear BRCA1-A complex with a function in DNA damage response and the cytoplasmic BRISC complex), to directly interact with the TNF-receptor and Fas and to interfere with apoptotic signalling. The Hey-Bre interaction could be further corroborated in this work; yet, it was not possible to narrow down the interaction site of Bre with Hey1. It rather seems that non-overlapping parts of the Bre protein may bind to Hey. This interaction may be direct– pointing to more than one interaction site inside the Bre protein – or via a common binding partner such as the endogenous Bre protein itself. Besides the interaction studies, functional assays were performed for a more detailed characterisation of Hey1 and Bre interaction. Here, it could be shown that Hey1 over-expression did not have any influence on Bre sub-cellular localisation. Interestingly, it could be demonstrated that Bre positively interfered with Hey1 repressive function in luciferase assays at three of four promoters analysed. Moreover, interaction with Bre seems to lead to a stabilisation of Hey1. As Bre has been described to modulate the E3-ligase activity intrinsic to the BRCC complex it was analysed whether Bre over-expression results in an ubiquitination of Hey1. Yet, this could not be observed in the present work. Furthermore, an interaction of Bre with ubiquitinated proteins could not be demonstrated in an ubiquitin binding assay. To obtain a better insight into Bre function, Bre LacZ gene trap-ES cells and animals were generated. However, realtime-RT-analyses revealed that these cells and mice did not show a loss of Bre expression on mRNA level indicating that insertion mutagenesis did not occur as expected. However, embryos derived from these mice could nevertheless be used for the detection of tissues with Bre expression by β-galactosidase staining. Bre deficiency on mRNA levels was only achieved after the deletion of the floxed exon 3 resulting in the generation of Bre del-mice. Bre del-mice were fertile and without any obvious phenotype and they were used for the generation of Bre del- and wt-MEFs (murine embryonic fibroblasts). Characterisation of these cells showed that proliferation was not affected after loss of Bre (neither under normal nor under stress conditions). However, loss of Bre notably resulted in a reduction in the BRCA1 DNA damage response, in a slightly increased sensitivity towards apoptosis induction by FasL treatment and in an increase in the K63-poly-ubiquitin content in Bre del-cytoplasmic fractions, probably linked to a change in the BRISC de-ubiquitinase activity. Even though these results have the same tendencies as observed in former studies, the effects in the present work are less striking. Further studies as well as intercrossing of Bre del- to Hey KO-animals will be necessary to further understand the functional relevance of Hey and Bre interaction. / Hey1, Hey2 und HeyL sind Zielgene des Notch Signalwegs und spielen eine entscheidende Rolle während der Embryonalentwicklung, z. B. bei der Bildung des kardiovaskulären Systems. Die genauen Effekte eines jeden einzelnen Hey Gens auf Transkriptionsprogramme und einzelne Gene sind allerdings noch relativ unbekannt. Einer der Gründe hierfür liegt vermutlich in der Koexpression von Hey-Proteinen in vielen Geweben bzw. in der daraus resultierenden funktionellen Redundanz. Daher sollte in dieser Arbeit ein System entwickelt werden, in dem entweder keines oder jeweils nur eines der Hey-Gene intakt ist. Hierzu wurden Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/- und Hey-triple-knock out (KO) ES-Zellen (embryonale Stammzellen) etabliert. ES-Zellen stellen ein hervorragendes Modellsystem für die Embryonalentwicklung dar, weil ihre in vitro Differenzierung als sog. „embryoid bodies“ (EBs) embryonale Entwicklungsprozesse widerspiegelt. Der Verlust der Hey-Genexpression hatte keinen Einfluss auf den Stammzellcharakter der etablierten Zellen, da sowohl die generierten Hey-triple-KO- als auch die Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/--ES-Zellen eine positive ALP-Färbung sowie eine hohe Expression von Pluripotenzmarkern zeigten. Daher konnten die Zellen im Folgenden als EBs differenziert und auf Genexpressionsunterschiede während der Differenzierung untersucht werden. Zwischen Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/-- (mit intakter Hey1-Expression) und Hey-triple- KO- ES Zellen konnten an EB Tag 10 mittels realtime-RT-PCR Unterschiede in der Genexpression für den endodermalen Marker AFP, sowie für neurale und myogene Marker festgestellt werden. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, aber auch, um neue Hey Zielgene ausfindig machen zu können, ist jedoch die Etablierung induzierbarer ES-Zellen (für Hey1, Hey2 bzw. HeyL) notwendig. Um einen tieferen Einblick in die Funktionsweise der Hey-Gene gewinnen zu können ist die Untersuchung von Hey Interaktionspartnern wichtig. Das Bre-Protein ist ein solcher Bindepartner und wurde zuvor in einem Yeast-two-hybrid Assay gefunden. Bre ist in zwei verschiedenen Komplexen beschrieben worden: dem nukleären BRCA1-A-Komplex, der eine Rolle bei der Detektion von DNA-Schäden spielt und dem cytoplasmatischen BRISC-Komplex. Es ist außerdem bekannt, dass Bre direkt mit dem TNF-Rezeptor und mit Fas interagiert und die apoptotische Antwort in der Zelle beeinflusst. Die Interaktion zwischen Bre und Hey1 konnte in dieser Arbeit zunächst bestätigt werden; in weiteren Ko-immunpräzipitations-Experimenten war es aber nicht möglich, den Bereich des Bre-Proteins zu bestimmen, der die Interaktion mit Hey1 vermittelt, da verschiedene nicht überlappende Bereiche des Bre-Proteins eine Interaktion mit Hey1 zeigten. Ob es sich hierbei um direkte Interaktionen handelte und Bre somit mehrere Bindestellen für Hey1 aufweist oder ob die Interaktion indirekt über einen gemeinsamen Bindepartner wie z.B. das endogene Bre-Protein selbst vermittelt wird, ist noch nicht geklärt. Für eine weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen den beiden Proteinen wurden funktionelle Versuche durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Hey1 keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation des Bre Proteins hat. Mit Hilfe von Luziferase Assays konnte aber interessanterweise nachgewiesen werden, dass Bre bei drei von vier untersuchten Promotern positiv auf die Repression durch Hey1 einwirkte. Außerdem scheint die Überexpression von Bre möglicherweise eine Stabilisierung des Hey1-Proteins zu bewirken. Da Bre eine Verstärkung der E3-Ligasefunktion des BRCC-Komplexes zugeschrieben wird, wurde außerdem untersucht, ob die Überexpression von Bre zu einer Ubiquitinylierung von Hey1 führt. Dies konnte allerdings nicht festgestellt werden. Desweiteren konnte in einem Ubiquitin-Bindeassay keine Interaktion von Bre mit anderen ubiquitinylierten Proteinen gezeigt werden. ...

Thesis (doctoral)--Humboldt-Universiẗat, Berlin, 2005. / Includes bibliographical references (p. 231-260) and index.

Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm&#176;t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. <br><br> Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden. / Compounds of the pharmaceutical and chemical industry need to be tested for their toxicological potential with regard to humans and environment following international guidelines. Tests for the prediction of the embryotoxic potential executed on living organisms are examples of these guidelines. In order to reduce the number of animal experiments necessary for the assessment of the toxicological profile of compounds the embryonic stem cell test (EST) was developed. Embryonic stem cells (ES-cells) of a cell line are used as the basis of the EST. ES-cells are cells which develop at the early embryonic development into cells of the germ layers. Out of these the many different specialized cell types of the complex organism can differentiate. With the EST this concentration of a test compound will be determined where a 50 % inhibition of the differentiation of ES-cells into cardiomyocytes can be detected. Additionally, the concentration of a test compound which is cytotoxic to 50 % of the ES-cells (IC50D3) and to 50 % of fibroblasts (IC503T3) will be determined. Therefore, general toxicity caused by the test compound on ES-cells and its differentiation can be distinguished from specific toxicity of the test compound. Determined parameters will be included into a biostatistical model for the subsequent predicition of the embryotoxic potential of test compounds. <br><br> A protocol was developed whereby the differentiation of ES-cells into endothelial cells is induced. Endothelial cells which make up the walls of blood vessels, such as arteries and veins, were detected and quantified at the RNA and the protein level applying molecular biological methods. Different cell culture methods, growth factors and growth factor concentrations were studied for their ability to induce the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Applying the developed differentiation protocol seven compounds were tested for their potential to inhibit the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Endothelial cells were quantified by the RNA-expression of two endothelial-specific genes. In comparison to the expression levels the IC50D3 and the IC503T3 were determined in order to assess the embryotoxic potential of the test compound. The results showed that an assessment of the embryotoxic potential of the seven test compounds into non-, weakly- and strongly embroytoxic was possible. It can be concluded that the improved in vitro embryotoxicity assay is sensitive and reproducible. With the use of different differentiation endpoints the power of predicitivity of this assay can be significantly increased and the number of animal experiments can be reduced. With the application of molecular biological markers this assay can be applied as a high througput screening and therefore the number of test compounds can be strongly increased.

Mesenchymale Stammzellen können sich durch den Einfluss verschiedener Transkriptionsfaktor zu Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten oder Myoblasten differenzieren. Während sie sich unter Runx2-Einfluss entlang der osteoblastären Linie differenzieren, entwickeln sie sich bei vorliegendem PPARγ entlang des adipogenen Differenzierungswegs. Das Gleichgewicht zwischen beiden Faktoren und ihr Zusammenspiel stellen einen wichtigen Bereich in der Osteoporoseforschung dar. In dieser Dissertation wurde durch Runx2-Suppression bzw. Runx2-Überexpression die Rolle dieses Faktors in pHOB und SCP1-Zellen erfasst und die Interaktion zwischen Runx2 und PPARγ untersucht. Der Runx2-Knockdown’ erfolgte mittels RNA-Interferenz, die Runx2-Überexpression durch ein Runx2 exprimierendes Plasmid. In RT-PCRs wurden mRNA-Messungen durchgeführt. Die Proteinbestimmung erfolgte im ‚Westernblot’. Der funktionelle Einfluss der Runx2-Überexpression auf die PPARγ-Transkription wurde durch Kotransfektion des an Luziferase gekoppelten PPARg-Promotorgens erfasst. Die funktionelle Aktivität des PPARg-Proteins wurde durch die Transfektion des an Luziferase gekoppelten PPRE-Gens gemessen. Promotoraktivität und Funktionalität der Proteine wurden in Luziferase-Reportergenassays erfasst. Unter basalen Kulturbedingungen differenzierten sich pHOB osteogen. Durch zweimalige siRunx2-Transfektion gelang auf mRNA-Ebene eine suffiziente Runx2-Suppression über 29 Tage auf durchschnittlich 10,1%. Neben einer Steigerung der PPARγ-mRNA nach sieben Tagen konnte darunter auch eine Suppression der osteogenen Differenzierungsmarker OC und AP beobachtet werden. Ein ‚Rescue’ der supprimierten Runx2-Genexpression konnte durch osteogene Stimulation nicht erreicht werden. In den Runx2-/PPARγ-Interaktionsversuchen wurden SCP1-Zellen adipogen stimuliert, um die PPARγ2-mRNA und PPARγ-Promotoraktivität zu erhöhen. Darunter konnte ebenfalls eine gesteigerte Funktionalität des PPARγ-Proteins beobachtet werden. Durch Runx2-Überexpression wurde in SCP1-Zellen die PPARγ-Promotoraktivität und somit der Beginn der mRNA-Synthese gehemmt. Die PPARγ2-mRNA hingegen blieb unbeeinflusst. Die zentrale Rolle des Runx2 in der osteogenen Differenzierung scheint durch den Einfluss auf die osteogenen Marker OC und AP in pHOB bestätigt zu werden. Auch der Einfluss auf die adipogene Differenzierung erfolgt über Runx2. Im Rahmen dieser Dissertation konnte erstmalig die Hemmung des PPARγ-Promotors durch Runx2 beschrieben werden. Hierdurch werden die PPARγ-Transkription und somit voraussichtlich die Interaktion zwischen Adipogenese und Osteogenese beeinflusst.

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