Living organisms portray diverse patterns of growth and developmental regulation. The entire process, beginning from a single cell to the formation of tissues and organ systems and the final culmination in a form that characterizes a fully grown organism is closely guarded by numerous molecular pathways. Like a master conductor, the genetic material of the cell which is stored in its DNA (deoxyribonucleic acid), determines the fate of each individual cell and demarcates its developmental direction. Although in an organism, this genetic material is normally identical in every cell, there are differences in the ways cells respond to them. For example, skin cells behave differently from muscle cells and their developmental processes are highly variable in space and time. It is now known that based on intrinsic or extrinsic environmental cues, the information passed on from DNA is converted into a functional protein product through an RNA (ribonucleic acid) intermediate. Thus, different genes fire at different times leading to diverse patterns of developmental regulation among cells. However, there exists a stark contrast between the size of the genome (DNA), the transcriptome (transcribed RNAs) and the proteome (functional protein products) inside a cell. While there are abundant RNA molecules that are transcribed from the DNA, only few give rise to proteins. The search for function of RNAs that do not code for proteins is a relatively new topic in molecular biology. With advancements in sequencing methodologies, there is a rapid surge in the discovery of such molecules but due to the nonavailability of systematic tools to study them, the functional characterization of these RNAs has been relatively slow. Even among the non coding RNAs, there exists small and long varieties of which the long non coding RNAs (lncRNAs) have more heterogenous functional attributes. The roles that these lncRNAs play in development is only recently emerging, especially in the field of embryonic stem (ES) cell biology. ES cells are of particular interest to researchers due to their properties of replicating indefinitely in culture and giving rise to all the germ layers that eventually constitute an organism. These unique abilities make them perfect models to study essential cellular developmental processes and also contribute to the understanding of the molecular pathways that ultimately lead to diseases like like other processes, is orchestrated by a host of different factors in which lncRNAs are slowly emerging as important players. Although there are thousands of lncRNAs identified, only a few have been implicated in pluripotency. I reasoned that there should be more such candidates and to study them one needs to develop a strategy to functionally investigate several lncRNAs simultaneously. Loss-of-function screens have been extremely successful for dissecting the functions of protein coding genes. Among the triggers for conducting such screens, endoribonuclease-prepared small interfering RNAs (esiRNAs) have been demonstrated as effective mRNA depletion agents with minimum silencing of non-intended targets. Since these RNA interference (RNAi) agents had not been comprehensively tested on lncRNAs, I used them for conducting a screen to discover lncRNAs involved in pluripotency. Using a combination of RNAi and localization strategies, I here report the discovery of a novel lncRNA called Panct1 which through interaction with other factors takes part in the ES cell pluripotency programme. In the process of characterization of Panct1, I have also identified and partially characterized a potential DNA binding protein called CXORF23 which might emerge as an important player in the determination of stem cell fate. These discoveries hint towards the presence of more such lncRNA protein interactions and further widen our understanding of stem cell biology.

Stem cell niches are specialized signalling microenvironments that allow maintenance of the stem cells. According to the traditional model of the stem cell niche, the niche signalling input is integrated by a cell towards a binary decision between stemness and differentiation. I have studied the regulation of somatic cyst stem cell (CyCS) proliferation in the testicular stem cell niche of Drosophila melanogaster by performing the DamID screen for targets of the transcriptional regulator Zfh1, a shared target of Jak/STAT and Hedgehog niche signalling. I have found that Zfh1 binds to the regulatory regions of kibra and salvador, tumour suppressors of the Hippo/Yorkie pathway, and downregulates them, restricting Yorkie activity to the Zfh1 positive CySCs. Clonal inactivation of the Hippo pathway is sufficient for CySC proliferation, but does not affect their differentiation ability. I therefore proposed a different stem cell niche model, whereby the niche signalling directly “micromanage” stem cell behavior, not involving the cell fate decision making.

Es werden in einer kumulativen Dissertationsschrift zwei wissenschaftliche Arbeiten zusammengefasst. Die erste Arbeit beschreibt die Etablierung der Kontrastmittelechokardiografie zur Charakterisierung des Herzinfarktmodells an der Ratte im zeitlichen Verlauf. Es wird der Ablauf der geometrischen Änderungen am linken Herz nach Herzinfarkt gezeigt. Zusätzlich wird die Methode mit anderen etablierten echokardiografischen Methoden verglichen. Hier wird die Messung der linksventrikulären Querschnittsfläche der Volumenbestimmung nach der modifizierten Simpson-Methode gegenübergestellt. Es wird gezeigt, dass die Flächenmessungen, bei Nichtverfügbarkeit der Kontrastmittelechokardiografie eine valide Methode zur Verlaufsbeobachtung im Modell darstellt. Die zweite Arbeit untersucht im Rattenversuch den Einfluss von mesenchymalen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut auf die Entwicklung des Herzversagens nach Herzinfarkt. Die Injektion der Zellen erfolgt direkt in das Herzmuskelgewebe am Rand des Infarktareals. Zusätzlich zur Phänotypisierung mittels Echokardiografie wurden hämodynamische Messungen, sowie immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen vorgenommen. Es konnte in einem Multigruppendesign gezeigt werden, dass im vorliegenden Versuch durch die Injektion von Vorläuferzellen kein Einfluss auf die geometrischen und biomechanischen Änderungen nach Herzinfarkt genommen werden konnte. Es konnten jedoch zusätzlich Differenzen zwischen den Versuchsgruppen in der Genexpression von Signalmolekülen der extrazellulären Matrix gezeigt werden, welche Spekulationen über den Einfluss der Zellen auf parakrine Mechanismen im Herzgewebe zulassen.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte einer frühzeitigen Zelltherapie im Langzeit in-vivo Infarktmodell studiert. Erstmals wurden dabei auch Veränderungen der kardialen -Adrenozeptoren untersucht und Zelltherapie mit einer reversiblen präinfarziösen Ischämie kombiniert. Initial wurden dafür bei 38 männlichen weißen Neuseeländer Kaninchen Knochenmarkspunktionen durchgeführt, MSC durch Kultur isoliert und 60 Minuten nach induziertem Infarkt und ohne Reperfusion in den Randbereich des Infarktgebietes injiziert. Zur Untersuchung möglicher Interaktionen zwischen Zelltherapie und Präinfarktgeschehen wurde bei einigen Tieren das Myokard durch eine kurzzeitige Präinfarktischämie präkonditioniert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass auch die frühzeitige Zellinjektion ohne Reperfusion mit signifikanten Effekten auf die Kontraktilität und spezifischen sympathoadrenergen Veränderungen verbunden ist.:Abkürzungsverzeichnis vii Literaturübersicht 1 Myokardinfarkt und postischämische Herzinsuffizienz 1 sympathoadrenerge Veränderungen bei Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 1 akuter Myokardinfarkt 1 Herzinsuffizienz 2 Veränderungen der -Adrenozeptoren bei Herzinsuffizienz 3 Stammzellen und Zelltherapien 4 Zelltherapien bei Myokardinfarkt 5 Knochenmark 5 hämatopoetische Stammzellen 5 mesenchymale Stammzellen 6 endotheliale Progenitorzellen 8 klinische Studien 8 Effekte adulter Stammzellen und anderer Zelltypen 10 Angiogenese 11 Zytoprotektion, Apoptosehemmung und antiinflammatorische Effekte 12 Unterstützung endogener Reperaturmechanismen 12 Stabilisierung der extrazellulären Matrix 13 Optimierung der Stammzelltherapien 13 Injektionszeitpunkt 14 Stammzellmigration 15 Ziel der Arbeit, Thesen und Fragestellung 17 Methoden 18 Versuchsaufbau 18 Tierhaltung 19 Tiermodell und Versuchsprotokoll 19 Knochenmarksgewinnung 19 Zellaufbereitung 19 Induktion des Myokardinfarktes und Zellapplikation 20 Sakrifizierung und Probenentnahme 21 Auswertung 22 transthorakale Echokardiografie 23 Durchführung 23 Radioligandenbindungsstudien 25 Rezeptortheorie 25 -Adrenozeptoren 25 Grundlagen der Radioligandenbindungsstudien 27 Auswertung der Radioligandenbindungsstudien 28 -Adrenozeptorbestimmung durch Radioligandenbindungsstudien 30 Durchführung 30 Radioligand 31 Probenvorbereitung 31 Proteinbestimmung 32 Bindungsstudien 32 Auswertung 34 Noradrenalinbestimmung durch HPLC 36 Flüssigkeitschromatografie und HPLC 36 Prinzipien der Auftrennung 36 Aufbau eines HPLC Systems 37 chromatografische Kenngrössen 39 Probenvorbereitung 42 Durchführung 42 Katecholaminextraktion 43 Chromatografie 43 Auswertung 44 Immunhistochemie 45 c-Kit 45 Durchführung 46 Gewebeproben 46 Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung 46 immunhistochemische Färbung 47 Auswertung der histologischen Schnitte 47 statistische Auswertung 48 Ergebnisse 49 allgemeine Daten 49 Echokardiografie 50 linksventrikuläre Funktion 50 Infarktausdehnung und Wandstärke im Infarktbereich 54 sympathoadrenerge Veränderungen 55 Radioligandenbindungsstudien 55 -Adrenozeptordichte im LV, S und RV 57 Noradrenalin Plasmakonzentration 64 c-Kit positive Zellen im Infarktbereich und infarktfernen Myokard 66 Diskussion 68 Ziel und Fragestellung 68 Tiermodell 68 Echokardiografie 70 Radioligandenbindungsstudien 73 Veränderungen der -Adrenozeptoren nach Myokardinfarkt 74 Therapiebedingte Veränderungen 76 plasmatisches Noradrenalin 79 Immunhistochemie 82 Zusammenfassung 84 Literaturverzeichnis I Anhang a Abbildungsverzeichnis a Tabellenverzeichnis b Tabellen c Materialien und Geräte f Tierversuche und Laborgeräte f Apperaturen und Geräte zur Durchführung der RLBS f HPLC System f statistische Auswertung und grafische Darstellung g Verbauchsmaterialien g allgemeine Laborchemikalien g Verbrauchsmateralien zur Durchführung der HPLC h Verbrauchsmateralien zur Durchführung der RLBS h Verbrauchsmateralien zur Durchführung der Immunhistochemie h Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit i Danksagung j Lebenslauf k Publikationsverzeichnis l

Hepatozyten sind von großer Bedeutung in Klinik und Forschung. Da sie derzeit nicht kultiviert werden können wird vielfach versucht sie aus Vorläuferzellen zu generieren. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von zwei Stammzelllinien in einem xenogenen Transplantationsmodell mit immundefizienten Mäusen untersucht. Verwendet wurden Stammzellen aus humanem Nabelschnurblut und vordifferenzierte humane Monozyten, sogenannte Neohepatozyten. Es wurden jeweils 750.000 dieser Zellen in die Leber von NOD/SCID-Mäusen transplantiert und die Lebern im Verlauf explantiert. Die Identifikation der transplantierten Zellen im Gewebeschnitt gelang durch den Membranfarbstoff CM-DiI. Zur genetischen Charakterisierung wurde eine in situ Hybridisierung mit human- bzw. mausspezifischen Gensonden etabliert. So konnten die transplantierten Zellen sicher in den Mauslebern detektiert werden. Im Weiteren wurde immunhistochemisch humanes Albumin in Mauslebern nachgewiesen. Humanes Albumin diente als Differenzierungsmarker und zeigt eine Entwicklung der transplantierten Zellen in Richtung Hepatozyten an. Interessanterweise wurden bei der Analyse beider Zelllinien zwei Typen Humanalbumin-positiver Zellen beobachtet: Typ I Zellen traten meist in Gruppen auf, waren kleiner als Hepatozyten und trugen einen dichten, dezentral gelegenen Kern. Sie lagen im Parenchym oder in kleineren Gefäßen und waren in der Lage, wie Hepatozyten, Glycogen und Eisen zu speichern. Typ II Zellen traten einzeln auf und glichen in ihrer Form exakt den Hepatozyten. Durch die Kombination von Immunhistochemie und in situ Hybridisierung konnten die Humanalbumin-positiven Zellen genetisch charakterisiert werden. Typ I Zellen trugen einen menschlichen Kern. Ihre Entstehung kann durch Teildifferenzierung der Stammzellen erklärt werden. Typ II Zellen wiesen einen Mauskern auf. Ein möglicher Entstehungsmechanismus ist der horizontale Gentransfer nach Zerfall der transplantierten Zellen im Zuge einer Immunreaktion. Der formale Nachweis eines solchen Phänomens steht noch aus.

Stressfaktoren begegnen uns sehr häufig in unserem tagtäglichen Leben und können sowohl positive als auch negative Effekte auf unser Wohlbefinden haben. Während akuter Stress motivierend oder auch leistungssteigernd wirken kann, wird chronischer Stress meist zur Belastung. Langanhaltender Stress wurde bereits mehrfach mit psychischen Erkrankungen wie Depressionen, aber auch systemischen Erkrankungen wie Diabetes in Verbindung gebracht. Der Körper reagiert auf Stress über eine Aktivierung des endokrinen Stresssystems, welches über das Gehirn gesteuert wird und gezielt die Ausschüttung von Stresshormonen kontrolliert. Diese Hormone ermöglichen beispielsweise den erhöhten Energiebedarf bei Stress und regulieren andererseits ihre eigene Aktivität über ein negatives Feedback. Die Stressantwort ist demnach ein essenzielles Netzwerk verschiedener Organe und bedarf einer genauen Regulierung. Es konnte gezeigt werden, dass chronischer Stress oder frühkindlicher Stress dieses System dauerhaft verändern kann, was eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer späteren Erkrankung zur Folge haben kann. Die zugrundeliegenden Ursachen hierfür sind bis heute nicht vollständig geklärt. Eine Theorie besagt, dass Stammzellen in endokrinen Drüsen einen Anteil an chronischen Veränderungen haben könnten. Es wurde bereits gezeigt, dass der Hypothalamus, die Hypophyse und die Nebennierenrinde Stammzellen aufweisen. Die Funktion dieser Stammzellen ist noch nicht vollständig aufgeklärt und insbesondere der Einfluss von Stress auf diese Zellen oder der Zellen auf die Stressantwort ist weitestgehend unbekannt. Die Stammzellen der Organe weisen unterschiedliche Merkmale auf und sind nicht direkt miteinander vergleichbar. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass sie durch einen Signalweg reguliert werden, den YAP/TAZ Signalweg, welcher zuvor bereits mit Stress und Belastungsstörungen in Verbindung gebracht wurde. Das Ziel dieser Studie war demnach, aufzuklären, ob dieser Signalweg in Hypophyse und Nebennierenrinde durch Stress beeinflusst wird und ob dies eine Regulation der Stammzellen in den jeweiligen Organen zur Folge hat. Die Regulierung der Stammzellpopulationen wurde zunächst in einem Stressmodell charakterisiert. Anschließend wurden molekulare Methoden, wie RT-qPCR, RNAscope mRNA in situ Hybridisierung, Western Blot und Immunofluoreszenz, für weitere Analysen herangezogen. Stammzellen des Nebennierencortex und der Hypophyse wurden zusätzlich in vitro kultiviert, um ihre Regulierung weiter zu analysieren. Es wurde zuerst der YAP/TAZ Signalweg im Detail in der Nebennierenrinde analysiert. Es konnte aufgezeigt werden, dass die Komponenten des Signalwegs zwar in der ganzen Nebennierenrinde exprimiert wurden, der Transkriptionsfaktor YAP hingegen hauptsächlich in den äußersten Zellschichten aktiv war, wo auch die Stammzellen lokalisiert sind. YAP und auch klassische Zielgene wie Ctgf wurden außerdem in den Zellen gefunden, welche in vorherigen Studien durch spezifische Marker als Vorläuferzellen oder Stammzellen definiert wurden. Ein anschließend durchgeführtes Stressexperiment zeigte auf, dass insbesondere Ctgf vermehrt in der Stammzellnische exprimiert wurde. Die Vorläuferzellen in der Nebennierenrinde werden normalerweise hauptsächlich durch den WNT Signalweg reguliert, welcher durch Stress inhibiert wurde. Da dies in vorherigen Studien als wichtiger Schritt zur Neubildung von Zellen aus den Vorläuferzellen aufgezeigt wurde, wurden zusätzlich Nebennieren von Glucocorticoid-behandelten Mäusen analysiert, welche eine Nebennierenrindenatrophie und verringerte Zelldifferenzierung aufzeigten. Diese zeigten eine dem Stress gegensätzliche Aktivität der beiden Signalwege auf. In einem Zellkulturmodell konnte aufgezeigt werden, dass die Regulation der beiden Signalwege während des Differenzierungsprozesses in vitro die Regulation der Signalwege während der Stressantwort in vivo widerspiegelten. Dasselbe Stressprotokoll wurde dann herangezogen, um die Regulation des YAP/TAZ Signalweges in der Adenohypophyse zu analysieren. Die Stammzellpopulation in der Hypophyse wird generell durch den Marker SOX2(+) definiert und wird unter anderen durch den YAP/TAZ Signalweg reguliert. Wiederholter Stress führte zu einer stark erhöhten Genexpression klassischer YAP/TAZ Zielgene, Ctgf und Cyr61. Beide wurden in den SOX2(+) Zellen der Adenohypophyse exprimiert, was einen potenziellen Einfluss von Stress auf SOX2(+) Zellen suggerierte. Die Daten ließen aber vermuten, dass diese Zellen keine erhöhte Proliferations- oder Differenzierungsrate aufwiesen. Vielmehr zeigten in vitro Studien auf, dass SOX2(+) Zellen CTGF ausschütteten, um potenziell über parakrine Signalwege benachbarte Zellen zu beeinflussen. Weitere Untersuchungen legten dar, dass Glucocorticoide die Ctgf Expression und Ausschüttung des Signalpeptids in den SOX2(+) Zellen vermehrt anregten. Diese Ergebnisse deuten also darauf hin, dass das negative Feedback von der Nebenniere in Stress auch Stammzellen in der Hypophyse beeinflussen könnte, welche wiederum eine Rolle in der Regulation der hormonproduzierenden Zellen über parakrine Signalwege haben könnten. Zusammenfassend demonstriert die vorliegende Arbeit, dass Stress einen Einfluss auf Signalwege in der endokrinen Stressachse haben kann, welche Vorläuferzellpopulationen in verschiedenen Organen beeinflussen können. Dies kann verschiedene Konsequenzen für das jeweilige Organ haben und Vorläuferzellen könnten so die Stressantwort im Allgemeinen beeinflussen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass ein weitreichenderes Verständnis der Regulation von Stammzellen in Stress helfen könnte, die zugrundeliegenden Ursachen der Krankheitsentstehung in Folge von chronischem oder frühkindlichem Stress zu verstehen.

Kurzreferat Unter mismatch repair-Defizienz (MMR-D) akkumulieren Mutationen durch die Fehlfunktion eines betroffenen MMR-Gens in Abhängigkeit von der Zeit und können zum Auftreten von kolorektalen Karzinomen (CRC) führen. Diese Mutationen sind beispielsweise unter MSH2-Defizienz als Mikrosatelliteninstabilität (MSI) in nicht codierenden Genomabschnitten im intestinalen Gewebe detektierbar. Die Analyse der Entwicklung der MSI im intestinalen Gewebe unter MMR-D ist im Menschen schwierig und ethisch nicht vertretbar. Eine Option der Analyse stellen Organoidkulturen, als Miniaturausgabe des intestinalen Gewebes ex vivo, dar. Ziel der Arbeit ist es, die Häufigkeit von Mutationen in Mikrosatelliten von Organoiden unter Msh2-Defizienz aus normalem Darm, Tumorvorläuferzellen und Tumoren in Abhängigkeit vom Alter der Maus, der Dauer und den Bedingungen der Organoidkultur zu quantifizieren. Dazu wurde der Mikrosatellitenstatus einzelner Organoide mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster korreliert.   Folgende Fragen sollten beantwortet werden: Ab welchem Mausalter tritt MSI auf? Ist sie altersabhängig? Korreliert sie mit dem dazugehörigen Wachstumsmuster? Sind Tumorvorläuferzellen (Adenome) in makroskopisch normalem Gewebe vorhanden? Haben Kultivierungsdauer und -faktoren Einfluss auf die MSI und das Wachstumsmuster der Organoide? Material und Methodik Altersidentische Msh2+/+-, Msh2+/--, und Msh2-/-- Mäuse und daraus generierte Organoide wurde als Triplets generell parallel analysiert. Die Organoidkultivierung erfolgte durch Isolierung von Darmkrypten aus makroskopischem Normal- und Tumorgewebe. Das Wachstum wurde mittels life imaging aller 8 h über 144 h für jedes Organoid aufgezeichnet. Wachstumskurven wurden errechnet und das Wachstumsmuster eines Organoids wurde zu jedem Zeitpunkt klassifiziert. Die Organoide wurden nach dem life imaging gepickt und mithilfe der Mikrosatellitenmarker A27, A33, GA29 in einer Multiplex-PCR auf Alterationen analysiert. Hieraus konnte ein MSI Score, ein ∆bp Score und dazugehörige heatmaps, die die qualitativen Änderungen der Marker visuell widerspiegeln, ermittelt werden. Ergebnisse MSI ist in ISC-Organoiden von Msh2-/--Mäusen vor dem Auftreten solider Tumoren in einem Alter von 12 Monaten nachweisbar und steigt über die Lebenszeit an. Bereits in einem Alter von 5 Monaten ist der maximale MSI Score, der lediglich die Anzahl veränderter Mikrosatelliten aufzeigt, erreicht. Der ∆bp Score zeigt, dass die Längenveränderungen im Bereich der Mikrosatelliten weiter kontinuierlich zunimmt und ein mit fortschreitendem Alter progressiver Nukleotidverlust auftritt. Die Wachstumsraten und -muster der Organoide von Msh2-/--Mäusen werden mit zunehmendem Alter heterogen. Bis zu einem Mausalter von 8 Monaten zeigen die Organoide aus dem Normalgewebe der Mäuse ein homogenes, verzweigtes Wachstum. Im Alter von 12 Monaten wachsen jedoch etwa 10 % der Organoide initial zystisch, ähnlich Organoiden aus Tumorgewebe. Dieses inhomogene Wachstumsmuster ist unabhängig vom ermittelten MSI Score. Tumorvorläuferzellen akkumulieren in normalem Epithel von Msh2-/--Mäusen weit vor dem Auftreten solider Tumoren. Organoide, die ohne den Zusatz von Noggin und R-Spondin aus enzymatisch verdauten Normalgewebe anwachsen, stammen von Tumorvorläuferzellen ab. Sie können aus 8 und 12 Monate alten Msh2-/--, jedoch nicht Msh2+/-- und Msh2+/+-Mäusen isoliert werden, und weisen ein zystisches, tumorähnliches Wachstum auf. Die Wachstumsrate sowie der ∆bp Score der Organoide ist im Vergleich zu Organoiden aus Normalgewebe erhöht. Alterationen in ISC nehmen unter Langzeitkultivierung zu und akkumulieren in vitro schneller als in vivo. Organoide 8 Monate alter Mäuse wurden für weitere 18 Wochen in vitro kultiviert. Es konnte gezeigt werden, dass nach dieser Zeit im Vergleich zu 12 Monate alten Organoiden vermehrt zystisch-ähnliches Wachstum auftritt. Der ∆bp Score steigt in vítro schneller als in vivo. Acetylsalicylsäure (ASS) vermindert das Auftreten und die Länge von zystisch-ähnlichem Wachstum, verändert jedoch nicht den ∆bp Score. Nach Langzeitkultur mit ASS über 18 weitere Wochen wachsen Organoide 8 Monate alter Mäuse aller drei Genotypen seltener zystisch-ähnlich. ASS vermindert die Anwachsrate von Msh2-/--Organoiden. Der ∆bp Score ändert sich unter Substitution von ASS nicht. Fazit Organoidkulturen MMR-defizienter Mäuse geben Einblick in die gewebsspezifische Akkumulation von Mutationen in Abhängigkeit vom Alter der Tiere und den Kultivierungsbedingungen der Organoide. Sie lösen dabei ethische und gesetzliche Probleme im Umgang mit fetalen Stammzellen und stehen durch die Darstellung physiologischer und pathologischer Mechanismen, beispielsweise bei zystischer Fibrose, oralen Plattenepithelkarzinomen oder CRC im Mittelpunkt von Betrachtungen verschiedener medizinischer Fachrichtungen. Durch diese Arbeit wurden Methoden zur Quantifizierung genetischer Alterationen in ISC-Organoiden unter Msh2-Defizienz etabliert sowie Kultivierungsbedingungen zur Beeinflussung einer in vitro-Langzeitkultivierung von ISC-Organoiden charakterisiert, die als Grundlagen zur weiteren Forschung im Hinblick auf die Behandlung von HNPCC-Patienten als auch anderen Erkrankungen dienen können.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einführung 1.1. Häufigkeit und Einteilung von kolorektalen Karzinomen 1.1.1. Genetik des HNPCC 1.1.2. Diagnosestellung und Klinik des HNPCC 1.1.3. Acetylsalicylsäure als mögliches Präventivum bei HNPCC 1.2. Mausmodelle zur Darstellung der in vivo-Situation 1.3. Organoidkultur aus intestinalen Stammzellen 2. Aufgabenstellung 3. Materialien und Methodik 3.1. Generierung der Zielmäuse 3.2. Organoidkultivierung 3.3. Analyse der Mikrosatelliteninstabilität 3.4. Analyse des Wachstumsverhaltens der Organoide 4. Ergebnisse 4.1. Korrelation der MSI von Organoiden aus Normalgewebe mit dem Alter und dem Genotyp der Mäuse 4.2. Korrelation des Wachstumsmusters der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.3. Korrelation der Wachstumsgeschwindigkeit der Organoide aus Normalgewebe mit dem bp Score 4.4. Nachweis von Tumorvorläuferzellen in makroskopischem Normalgewebe 4.5. Vergleich der MSI zwischen in vitro- und in vivo-gealterten Organoiden aus Normalgewebe 4.6. Auswirkung von ASS als zusätzlicher Kultivierungsfaktor auf die MSI von in vitro-gealterten Organoiden 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Publikation - Different in vivo and in vitro transformation of intestinal stem cells in mismatch repair deficiency Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Selbstständigkeitserklärung Lebenslauf Publikationen/Vortragsthemen Danksagung

The adrenal glands are two major endocrine organs responsible for multiple physiological processes, including the stress response, modulating the immune system and metabolism. The adrenal is composed of an outer cortex and an inner medulla with distinct developmental origin and function. While tissue-specific stem/progenitor populations of the adrenal cortex have been widely identified and characterised, the presence of a functional stem/progenitor population in the medulla is unclear. Establishing cell hierarchy of the adrenal medulla essential to understand normal homeostasis, disease pathogenesis and establishing regenerative medicine strategies, therefore the identification of a stem/progenitor population would provide an important starting point for further basic and translational studies. Cell composition of the adrenal medulla includes three main cell types: chromaffin cells, which secrete catecholamines, neurons, which stimulate catecholamine production, and a third cell type with an unspecified “support” function called sustentacular cells. Using transcriptomics and genetic approaches in mouse, I established that a population of sustentacular cells express the stem/progenitor marker SOX2. These cells are present throughout life and have a developmental origin congruent with the rest of the gland. Through genetic lineage-tracing using the Sox2CreERT2 strain, I demonstrate that SOX2+ cells are an expanding population, capable of giving rise to the catecholamine-producing chromaffin cells, consistent with a stem cell role in vivo. I further demonstrate the self-renewal potential of SOX2+ cells through in vitro isolation and expansion, using a Sox2eGFP mouse line. Analysis of SOX2+ cells in physiological organ challenge suggests potential involvement of these cells in the response to perturbation of normal homeostasis. Through analysis of FFPE sections of human adrenals, I confirm the presence of SOX2+ cells in the normal adult organ, as well as in pheochromocytomas. Taken together, these data support the identification of a previously undescribed stem cell population in the mammalian adrenal medulla and confirm its functional relevance.

Wir haben im Hippocampus von transgenen Mäusen, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines Promotors für Nestin exprimieren, mutmaßliche Neuronale Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass Nestin-GFP exprimierende Vorläuferzellen in der subgranularen Zone des adulten Gyrus Dentatus sich in zwei Subpopulationen entsprechend ihrer morphologischen Eigenschaften einteilen lassen. Eine kleine, morphologisch unterscheidbare Population von Vorläuferzellen mit neuronalen Eigenschaften erhielt GABAergen, aber keinen glutamatergen Input, dies widerspiegelt die Situation während der Entwicklung des Gehirns. Außerdem haben wir ecto-nucleotidase NTPDase2 und functionelle P2X Rezeptoren in hippocampalen Vorläuferzellen identifiziert. Wir haben auch das Verhalten Nestin exprimierender Zellen bis zu 8 Wochen nach 30 minütiger Occlusion der mittleren cerebralen Arterie (MCAo)/reperfusion und im murinen experimentellen Glioblastom Modell untersucht. Neben den bereits publizierten Ergebnissen, die ich auch in meiner Doktorarbeit vorgestellt habe, habe ich die elektrophysiologischen Eigenschaften der Nestin-GFP-exprimierenden Zellen in der Amygdala und im CA 1 des Hippocampus untersucht. / Using transgenic mice that express green fluorescent protein (GFP) under control of the nestin promoter, the putative precursor cells were identified. We have previously shown that nestin-GFP expressing precursor cells in the adult subgranular zone of hippocampal dentate gyrus could be divided into two distinct subpopulations based on morphological criteria. A small, morphological distinct population of precursor cells with neuronal properties received GABAergic, but not glutamatergic input similar as in brain development. We identified ecto-nucleotidase NTPDase2 and functional P2X receptors at hippocampal progenitor cells. We also studied the fate of nestin-GFP-expressing cells up to 8 weeks after 30 mins occlusion of the middle cerebral artery (MCAo)/reperfusion and in murine experimental glioblastoma model. Except for the published results which was included in this PhD dissertation, I also studied the electrophysiology properties of nestin-GFP-expression cells in amygdala and in Ca1 of hippocampus.

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