A goal in human embryonic stem cell (hESC) research is the faithful differentiation to given cell types such as neural lineages. During embryonic development, a basement membrane surrounds the neural plate that forms a tight, apico-basolaterally polarized epithelium before closing to form a neural tube with a single lumen. Here we show that the three-dimensional epithelial cyst culture of hESCs in Matrigel combined with neural induction results in a quantitative conversion into neuroepithelial cysts containing a single lumen. Cells attain a defined neuroepithelial identity by 5 days. The neuroepithelial cysts naturally generate retinal epithelium, in part due to IGF-1/insulin signaling. We demonstrate the utility of this epithelial culture approach by achieving a quantitative production of retinal pigment epithelial (RPE) cells from hESCs within 30 days. Direct transplantation of this RPE into a rat model of retinal degeneration without any selection or expansion of the cells results in the formation of a donor-derived RPE monolayer that rescues photoreceptor cells. The cyst method for neuroepithelial differentiation of pluripotent stem cells is not only of importance for RPE generation but will also be relevant to the production of other neuronal cell types and for reconstituting complex patterning events from three-dimensional neuroepithelia.

The discovery of resetting human somatic cells via introduction of four transcription factors into an embryonic stem cell-like state that enables the generation of any cell type of the human body has revolutionized the field of medical science. The generation of patient-derived iPSCs and the subsequent differentiation into the cells of interest has been, nowadays, widely used as model system for various inherited diseases. The aim of this thesis was to generate iPSCs and to subsequently derive NPCs which can be differentiated into neurons in order to model the two most common forms of the NCLs: LINCL which is caused by mutations within the TPP1 gene, encoding a lysosomal enzyme, and JNCL which is caused by mutations within the CLN3 gene, affecting a lysosomal transmembrane protein. It was shown that patient-derived fibroblasts can be successfully reprogrammed into iPSCs by using retroviral vectors that introduced the four transcription factors POU5F1, SOX2, KLF4 and MYC. The generated iPSCs were subsequently differentiated into expandable NPCs and finally into mature neurons. Phenotype analysis during the different stages, namely pluripotent iPSCs, multipotent NPCs and finally differentiated neurons, revealed a genotype-specific progression of the disease. The earliest events were observed in organelle disruption such as mitochondria, Golgi and ER which preceded the accumulation of subunit c of the mitochondrial ATPase complex that was only apparent in neurons. However, none of these events led to neurodegeneration in vitro. The established disease models recapitulate phenotypes reported in other NCL disease models such as mouse, dog and sheep model systems. More importantly, the hallmark of the NCLs, accumulation of subunit c in neurons, could be reproduced during the course of disease modeling which demonstrates the suitability of the established system. Moreover, the derived expandable NPC populations can be used for further applications in drug screenings. Their robust phenotypes such as low levels of TPP1 activity in LINCL patient-derived NPCs or cytoplasmic vacuoles, containing storage material, observed in CLN3 mutant NPCs, should serve as possible phenotypic read-outs.

All multicellular organisms constantly need to replace aged or damaged cells. This vital task of tissue homeostasis is fulfilled by stem cells. The balance between self-renewal and differentiation of the stem cell is crucial for this task and tightly regulated by a signaling microenvironment termed the niche. A widely used model for studying stem cell niche biology is the Drosophila testis, where two stem cell populations, the germline stem cells (GSCs) and the somatic cyst stem cells (CySCs), reside in a niche located at the apical tip. A lot is known about the signals regulating GSC maintenance in the testicular niche. It is, however, unknown how the spatial regulation of these signals defines the range of the niche. Here I show, that Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is specifically activated at the interface of niche and stem cells. This local activation is achieved by coupling the transport of adhesion and signaling molecules in the niche cells and directing their transport to contact sites of niche and stem cells. Localized niche signaling at junctions underlies the so called stem-cell-niche synapse hypothesis proposed for the mammalian hematopoietic stem cell niche. I have shown that disrupting the localized transport causes premature differentiation and stem cell loss. BMP signaling between niche and GSCs therefore provides the first description of a stem-cell-niche synapse and will yield valuable insights into mammalian stem cell biology. The CySCs reside in the niche of the testis together with the GSCs. To understand how the niche maintains both stem cell types in a concerted way, it is essential to know the pathways regulating both stem cell types. Here I show that Hedgehog (Hh) signaling is a key stem cell factor of CySCs, while only indirectly affecting GSCs. Loss of Hh signaling in CySCs results in premature differentiation and consequent loss of the cells. Overactivation of the pathway leads to an increased proliferation and an expansion of the cyst stem cell compartment. As Hh signaling is also a regulator of the somatic cells in the mammalian testis and the Drosophila ovary this may reflect a higher degree of homology between these systems than previously expected.

Neural stem (progenitor) cells (NPCs) from fetal tissue are an ideal transplantable cell source. They divide rapidly, are able to generate cells of all three neural lineages and do not divide uncontrolled once transplanted into a host organism. To obtain large quantities of cells for transplantation strategies and to eliminate primary cell contaminations, long periods of in vitro cultivation are necessary. Mouse NPCs are a crucial tool for further investigations of neural stem cells because they make the employment of transgenic animals in vivo and cells in vitro possible. So far only short-term expanded fetal mouse NPCs have been shown to generate dopaminergic neurons and it is not clear whether this was due to differentiation or a result of increased survival of primary dopaminergic neurons. The aims of the thesis were to characterize mouse fetal NPCs, to establish the long-term expansion of fetal mouse NPCs and the generation of dopaminergic neurons in long-term expanded fetal mouse NPCs, to investigate the signaling mechanisms involved in the differentiation of mouse fetal NPCs towards the dopaminergic phenotype and to compare short and long-term expanded NPCs. Long-term expanded fetal mesencephalic NPCs could be grown under suspension and adherent culture conditions and showed self- renewing capacity as well as markers typical for NPCs. They could be differentiated into the three major cell types of the nervous system, but suspension NPCs had a larger potential to generate neurons than adherently grown NPCs. Signaling cascades involved in this process were p38 and Erk1/2 mediated. Long-term expanded NPCs did not have the potential to generate neuronal sub-types. Importantly, they did not generate dopaminergic neurons. Mouse fetal NPCs from three different developmental stages (E10, E12, and E14) were employed but were not able to differentiate into dopaminergic neurons using factors known to stimulate in vitro dopaminergic specification. When cultivated in vitro for short periods, fetal mesencephalic NPCs were able to generate dopaminergic neurons. By eliminating all primary Th- positive neurons, FACS-sorting of NPCs proved a de novo generation of dopaminergic neurons, because after cultivation and differentiation of Th- depleted cell solutions dopaminergic neurons were present in the culture. However, these newly generated neurons failed to incorporate BrdU, making a generation without cell division from precursors probable. The precursor population of short cultures differed from long-term expanded cultures suggesting an ‘aging’ effect of in vitro conditions. IL-1 was a potent inducer of the dopaminergic neuronal phenotype in short-term expanded in vitro cultures and was expressed in vitro as well as in vivo at E14. Several important conclusions concerning fetal mouse stem cell behavior could be drawn from the results of this work: Firstly, the results showed for the first time that in fetal mouse mesencephalic NPCs dopaminergic neurons differentiate from precursors without cell division, therefore consuming those progenitors. Therein fetal mouse NPCs differ significantly from rat and human NPCs or respond differently to the same in vitro conditions that need to be optimized for fetal mouse NPCs. Secondly, less committed precursors find appropriate conditions to proliferate but not to generate the more committed DA precursors that are able to generate dopaminergic neurons. The hallmarks of stem cells, self-renewal and multipotentiality, seem to be part of a delicate balance, that, when unsettled, goes in favor of one side without the possibility of returning to the previous status. Further research should focus on two coherent issues: the isolation of more pure populations of progenitors and the more precise characterization of progenitor populations to find out which in vitro conditions need to be provided to keep the balance between proliferation and differentiation potential. The knowledge gained about stem cells this way would help establish cell sources for transplantation strategies. / Stammzellen sind ein wichtiges Werkzeug für regenerative Therapien im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson’schen Erkrankung. Ein besonderer Vorteil von Stammzellen gegenüber dem bereits zur Transplantation verwendeten Primärgewebe, ist ihre Fähigkeit zur fortlaufenden Zellteilung, so dass ausreichende Mengen zur Transplantation zur Verfügung stehen. Der Vorteil von fetalen neuralen Stammzellen (fNSZ) ist ihre genomische Stabilität, die dazu führt, dass bei Transplantationen keine Tumore entstehen. Dennoch ist der Großteil ihrer Eigenschaften und Potentiale noch unbekannt und die optimalen Wachstumsbedingungen für eine lange in vitro Kultur und optimale Differenzierung in dopaminerge Neuronen müssen erforscht werden, um bessere Transplantate herzustellen. Insbesondere Stammzellen der Maus sind für die Forschung von immenser Wichtigkeit, da sie die Arbeit mit transgenen Tieren ermöglichen. Die Zielsetzungen dieser Arbeit waren die Charakterisierung der fNSZ der Maus, die Langzeitexpansion und die anschließende Differenzierung in dopaminerge Neurone. Die Signalkaskaden der frühen Differenzierung und die Unterschiede von kurz- und langzeitkultivierten Stammzellen wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass fNSZ der Maus nach Langzeitkultivierung in alle Zelltypen des zentralen Nervensystems, also Neuronen und Glia differenzieren und die dabei aktivierten Signalkaskaden p38 und Erk1/2 vermittelt sind. Das Differenzierungspotential zu neuronalen Subtypen (also auch zu dopaminergen Nervenzellen) verloren diese fetalen Stammzellen unter Kulturbedingungen schnell. Das steht im Gegensatz zu fetalen Stammzellen aus Ratte oder dem Menschen, die auch nach langer Kultivierung ihr dopaminerge Potential erhalten. Nur nach Kurzzeitkultivierung waren dopaminerge Neurone nachzuweisen, die jedoch nicht durch Zellteilung aus Vorläuferzellen hervorgegangen waren. Die Eliminierung aller primären Neurone aus der Mittelhirnisolation durch FACS-sorting von Th-Gfp transgenen Mäusen bewies die de novo Generation der dopaminergen Neurone aus Vorläuferzellen ohne Zellteilung während der Kultivierung der Stammzellen. Diese Ergebnisse zeigten, dass in fetalen mesenzephalen NSZ der Maus dopaminerge Neurone von spezialisierten Vorläuferzellen differenzieren, wodurch diese der Kultur verloren gehen. Weniger spezialisierte Vorläuferzellen finden Bedingungen, die ihre Kultivierung ermöglichen, sind aber nicht in der Lage, spezifischere Vorläuferzellen zu bilden. Die Markenzeichen von Stammzellen, Selbsterneuerung (durch Zellteilung) und das Potential, die Zelltypen des Nervensystems zu generieren, scheinen fein balancierte Zustände zu sein, die bei einer Störung nicht wiederherzustellen sind. Die Ergebnisse dieses Projektes sind von großer Bedeutung für die Forschung zur Zellersatztherapie der Parkinson’schen Erkrankung, deren ultimatives Ziel es ist, eine sichere und verlässlich expandierbare Zellquelle zu etablieren, die fähig ist, in dopaminerge Neurone zu differenzieren. Solche Stammzellen würden Bemühungen um Transplantationsstrategien für neurodegenerative Erkrankungen unterstützen und vorantreiben.

Während Korrosionsbeständigkeit bisher ein wichtiges Kriterium bei der Materialentwicklung von metallischen Implantaten war, erlangen korrodierbare Metalle wie zumeist Magnesium aber auch Eisen zunehmend Bedeutung in der gegenwärtigen Forschung. Magnesium ist ein osteokonduktives Material und stimuliert die Knochenneubildung. Nachteil ist jedoch die geringe Korrosionsbeständigkeit, sodass Magnesium in der Regel in vivo schneller abgebaut wird, als neuer Knochen gebildet werden kann. Verglichen mit Magnesium ist die Korrosion von elementarem Eisen in vivo langsam und zeigt keine lokale oder systemische Zytotoxizität. Während die meisten Forschungsarbeiten Eisen als degradierbares Implantatmaterial mit dem Ziel der kardiovaskulären Anwendung untersuchen, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit Eisenschäumen, die u.a. zur Heilung überkritisch großer und belasteter Knochendefekte eingesetzt werden sollen. Die Herstellung der Eisenschäume (Fe) erfolgt durch Pulvermetallurgieprozesse an den Fraunhofer-Instituten IKTS und IFAM in Dresden. Polyurethanschäume werden mit einer Carbonyleisensuspension mit 3,8 % Fe3P beschichtet, getrocknet, erhitzt und anschließend der verbleibende Eisenschaum gesintert. Die Bioaktivierung der Eisenschäume mit verschiedenen Calciumphosphatphasen erfolgt durch die InnoTERE GmbH. Hierfür werden die Eisenschäume phosphatiert und mit Brushit (Fe-B) beschichtet. Durch anschließendes Kochen bei 95 – 100 °C in 0,1 M NaOH für 24 h kann eine Hydroxylapatitschicht (Fe-HA) erhalten werden. Eine weitere Methode der Bioaktivierung stellt die Befüllung mit Calciumphosphat-Zementen dar. Dabei handelt es sich um einen von InnoTERE entwickelten Ein-Pasten-Calciumphosphat-Zement (1P PCP) und um einen magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Zement (MgCPC). Die Eisenschäume werden mittels physikalisch-chemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden im Hinblick auf Degradierbarkeit und Biokompatibilität in vitro untersucht und charakterisiert. Wesentliche Ziele der vorliegenden Arbeit sind neben der Charakterisierung des Korrosionsverhaltens, vor allem die Analyse der Reaktionen knochentypischer Zellen auf Beschichtungen sowie Korrosionsprodukte der metallischen Grundstruktur. Für die zellbiologischen Untersuchungen dienen die Osteoblastenzelllinie SaOs-2 sowie humane mesenchymale Stammzellen (hMSC). Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der Beschichtung bzw. Füllung mit verschiedenen Calciumphosphatphasen die Eisenfreisetzung und damit das Korrosionsverhalten von Eisenschäumen variiert werden kann. Die höchsten Korrosionsraten sind bei unmodifizierten Eisenschäumen zu beobachten. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit erfolgt eine verminderte Eisenfreisetzung. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. die Füllung mit Magnesium-Calciumphosphat Zement wird die Freisetzung von Korrosionsprodukten nahezu vollständig unterbunden. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. HA wird neben dem Korrosionsverhalten auch die Bioaktivität der Proben beeinflusst. Während die unmodifizierten Fe in beiden untersuchten Zellkulturmedien sowie Fe-B in McCoys keinen Einfluss auf den Calcium- und Phosphatgehalt haben, ist bei Fe-B in DMEM über den gesamten Untersuchungszeitraum eine konstante Calcium- und Phosphatfreisetzung zu beobachten. Die bioaktiven Fe-HA zeigen den umgekehrten Effekt und entziehen dem Medium Calcium und Phosphat – in DMEM Calcium stärker als in McCoys und in McCoys Phosphat stärker als in DMEM. Für das erfolgreiche Einwachsen von Implantaten bzw. die Heilung von Knochendefekten sollten Zellen, die am Knochenauf- und -umbau beteiligt sind, durch das Einbringen des Implantats nicht negativ beeinflusst werden. Ein Schlüsselereignis stellt dabei die Adhäsion dar. Die beste Adhäsion ist für die beide getestete Zelltypen auf Fe-B zu beobachten. Für Fe-HA werden die zweitbesten Adhäsionseffizienzen erzielt. Während für die Osteoblasten dabei das Zellkulturmedium keinen Einfluss hat, ist für die Stammzellen im Vergleich zu den SaOs-2 Zellen allerdings nur eine halb so gute Adhäsion zu beobachten. Die mit MgCPC bzw. mit 1P CPC gefüllten Schäume dagegen zeigen eine sehr schlechte Adhäsion sowohl von Osteoblasten als auch von Stammzellen. Für Fe-B+1MgCPC kann jedoch durch eine Erhöhung der Inkubationszeit von 4 h auf 24 h der Anteil an adhärenten Zellen deutlich gesteigert werden. Entsprechend des Korrosionsverhaltens adhärieren auf den unmodifizierten Eisenschäumen die Zellen am schlechtesten. Darüber hinaus können sowohl SaOs-2 als auch hMSCs auf den CPP-beschichteten Fe nicht nur adhärieren, sondern auch proliferieren. Die eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisenden SaOs-2 zeigen sowohl auf Fe-B als auch auf Fe-HA eine sehr gute Proliferation. Die langsamer proliferierenden Stammzellen dagegen zeigen ein etwas anderes Zellverhalten. Während auf Fe-B ebenfalls eine gute Proliferation zu beobachten ist, nimmt die Zellzahl auf Fe-HA zu Beginn der Inkubation zunächst ab. Mit der Zeit sinken Eisenfreisetzung und Calciumbindung, sodass ab Tag 14 auch hier eine Zunahme der Zellzahl zu beobachten ist. Die Perfusionskultur stellt ein Kultursystem dar, das den in vivo Bedingungen näher ist, als eine statische Kultivierung in Zellkulturwellplatten, sodass die Proliferation von SaOs-2 und hMSCs auf Fe-HA signifikant verbessert werden kann. Während für die unmodifzierten Fe bereits bei den SaOs-2 Zellen weder statisch noch dynamisch eine Zellzahlzunahme zu beobachten ist, kann für Fe-B+MgCPC die Proliferation durch die Perfusion verbessert werden. Für Fe-HA kann durch die Verwendung in vivo naher Zellkulturbedingungen die Proliferation beider Zelltypen entscheidend verbessert werden. Für die Fe-B zeigen die Zellen bereits in der statischen Kultur eine gute Proliferation, die durch die Perfusion nicht wesentlich gesteigert werden kann. Die Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungsverhalten zeigen sowohl bei indirekter Inkubation in Fe-B und Fe-HA Extrakten als auch im direkten Materialkontakt auf den CPP-bioaktivierten Fe, dass die untersuchten hMSCs in der Lage sind osteogen zu differenzieren und mineralisieren. Die Genexpressionsergebnisse bestätigen die Beobachtungen der biochemischen Analyse. Im Fall der alkalischen Phosphatase (ALP) wird der Effekt bei den Fe-HA Extrakten sogar noch deutlicher. Sowohl im Basis- als auch im Differenzierungsmedium zeigen die Zellen eine erhöhte ALP-Genaktivität. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit kann auf den Fe-HA eine zeitigere Aktivierung der osteoblastären Differenzierung im Vergleich zur Plastikoberfläche beobachtet werden. Durch die Perfusionskultur ist aufgrund des Zusammenspiels von Stofftransport und Scherkräften eine gesteigerte Differenzierung der hMSCs auf den mit CPP beschichteten Fe zu beobachten – auf Fe-HA stärker als auf Fe-B. Durch die korrosionsbedingte Eisenfreisetzung reagieren die hMSCs mit erhöhter Genexpression des Eisenspeicherproteins Ferritin bei gleichzeitig sinkender Genexpression für den Transferrinrezeptor CD71. Reaktive Sauerstoffspezies und der damit verbundene oxidative Stress bewirken eine erhöhte Genexpression von Enzymen der oxidativen Stressabwehr. Es handelt sich dabei um die im Zytoplasma vorkommende Superoxiddismutase SOD1 und die in den Mitochondrien lokalisierte SOD2 als primäre Enzyme und um die Glutathion-Reduktase als sekundäres Enzym. Die Genregulierung von Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Synthetase wird ebenfalls teilweise durch die Anwesenheit von Fe beeinflusst. Fazit Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eisenschäume korrodieren in Abhängigkeit ihrer CPP-Modifizierung mit unterschiedlicher Intensität sowie Geschwindigkeit und beeinflussen so das Zellverhalten von hMSC und Osteoblasten. Die Eisenfreisetzung, die für die unmodifizierten Schäume am höchsten ist, wirkt sich negativ auf Adhäsion und Proliferation aus. Sowohl statisch als auch dynamisch ist eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten. Ohne Modifikation sind die Eisenschäume daher für eine Anwendung als Knochenersatzmaterial in vivo eher ungeeignet. Im Gegensatz dazu stellen die mit Brushit und mit Hydroxylapatit beschichteten Fe-Schäume interessante Knochenersatzmaterialien dar. Es konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer Calciumbindungs- bzw. -freisetzungskapazität die am Knochenaufbau beteiligten Zellen und deren Differenzierungsverhalten in Richtung Osteoblasten positiv beeinflussen können. Die mit mit MgCPC und mit Einpastenzement gefüllten Eisenschäume konnten nur ansatzweise untersucht werden. Eine endgültige Einschätzung zur Eignung für eine in vivo Anwendung ist daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Dennoch sind sie vor allem im lasttragenden Bereich aufgrund guter mechanischer Eigenschaften innovative Knochenersatzmaterialien.

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Während der letzten Jahre zeigten einige Studien, dass die Behandlung mit Knochenmark- Stammzellen (KMSZ) eine vielversprechende neue Therapieoption für den geschädigten Herzmuskel darstellen könnte. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob es unter Behandlung mit Stammzellen zu einer zellulären Antwort in angezüchteten Kardiomyozyten (KMZ) kommt. Dafür wurden subkonfluente Kulturen aus Herzmuskelzellen von neonatalen Ratten für drei Tage mit Vybrant CM-DiI-markierten, sternalen humanen Knochenmarkstammzellen co-kultiviert. Im Anschluss wurden immunohistochemische Färbungen sowie eine quantitative Analyse mittels Western Blot für das Protoonkogen c-Myc durchgeführt. Des Weiteren wurde die Dichte der Beta-Adrenozeptoren unter Anwendung einer Histoautoradiographie mittels [125I]- iodocyanopindolol-Bindung analysiert. Die Auswertung der Immunohistochemie und der Western Blots zeigte eine signifikante Erhöhung der Expression von c-Myc in den Kardiomyozyten, welche in naher Umgebung der Stammzellen lagen. Dieser Effekt war direkt abhängig von der Entfernung der KMZ zur SZ. Die Histoautoradiographie zeigte eine signifikant höhere Beta-Rezeptor-Dichte in Kardiomyozyten in direkter Nähe zur Stammzelle. Mit steigender Entfernung von der Stammzelle verringerte sich die Rezeptordichte. Somit konnte gezeigt werden, dass eine kleine Anzahl von Knochenmark-Stammzellen ausreicht, um eine große Zahl von Kardiomyozyten zu beeinflussen, indem eine intrazelluläre Signalkaskade über c-Myc aktiviert und die Anzahl der Beta-Adrenozeptoren erhöht wird.

Prominin-1 (alias CD133) has received considerable interest because of its expression by several stem and progenitor cells originating from various sources, including the neural and hematopoietic systems. As a cell surface marker, prominin-1 is now used for somatic stem cell isolation. Its expression in cancer stem cells has broadened its clinical value, as it might be useful to outline new prospects for more effective cancer therapies by targeting tumor-initiating cells. Cell biological studies of this molecule have demonstrated that it is specifically concentrated in various membrane structures that protrude from the planar areas of the plasmalemma. Prominin-1 binds to the plasma membrane cholesterol and is associated with a particular membrane microdomain in a cholesterol-dependent manner. Although its physiological function is not yet determined, it is becoming clear that this cell surface protein, as a unique marker of both plasma membrane protrusions and membrane microdomains, might reveal new aspects of the cell biology of rare stem and cancer stem cells. The aim of this review is to outline the recent discoveries regarding the dynamic reorganization of the plasma membrane of rare CD133+ hematopoietic progenitor cells during cell migration and division. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

The bone marrow (BM) niche provides hematopoietic stem (HSC) and progenitor cells with many exogenous cues that tightly regulate homeostasis. These cues orchestrate cellular decisions, which are difficult to dissect and analyze in vivo. This thesis introduces a novel in vitro platform that permits systematic studies of BM-relevant factors that regulate homeostasis. Specifically, the role of 3D patterned adhesion ligands and soluble cytokines were studied in a combinatorial fashion. Analysis of human HSC differentiation and proliferation at both population and single cell level showed synergistic and antagonistic effects of adhesion- and cytokine-related signals. Those effects were dependent on the cytokine concentration and the distribution and number of adhesion ligands. The aim of this thesis was to model the in vivo bone marrow with its porous 3D structure and different sized niche compartments using a microcavity culture carrier. The developed culture system presented extracellular matrix (ECM) adhesion ligands to the HSCs in various defined dimensions ranging from single- to multi-cell capacity. The 3D open well geometry of the microcavity carriers also allowed HSCs to freely explore different scenarios including homing, migration, adhesion, or suspension. Furthermore, the developed setup offered straightforward accessibility to analytical methods like cytometry and quantitative microscopy. Single cell analysis of adherent HSCs showed decreased DNA synthesis and higher levels of stem cell marker expression within single cell microcavities under low cytokine conditions . This effect was reflected in a decline of proliferation and differentiation with decreasing microcavity size. When the cytokine concentration was increased2 beyond physiological levels the inhibitory effect on proliferation and differentiation due to single-cell-microcavity adherence was diminished. This result highlighted the fine balance between adhesion related and soluble cues regulating HSC fate. Within small microcavities more adhesion related receptors were engaged due to the 3D character of the culture carrier compared to multi-cell wells or conventional 2D cell culture plates. This study demonstrated that adhesion-related signal activation leads to reduced proliferation and differentiation. This geometry-based effect could be reversed by increased cytokine supplementation in the culture media. For plane substrates, HSCs attachment to fibronectin or heparin initiated early cell cycle entry compared to non-adherent cells during the initial 24h. Cytokine supplemented media favored integrin activation that induced fast adhesion, ultimately leading to early cell cycle activation. However, after prolonged cell culture the system balanced itself with a lower cycling rate of adherent versus non-adherent HSCs. Furthermore, HSCs within the 3-dimensionality of the microcavities cycled less than 2D adherent cells. These findings additionally supported the above stated idea of limited HSC proliferation as a consequence of more adhesion-related signals overwriting cytokine driven expansion. To complement the various in vitro studies, an in vivo repopulation study was performed. Cultured HSCs derived from single cell microcavities outperformed freshly isolated HSCs in a competitive repopulation assay, indicating that carefully engineered substrates are capable of preserving stem cell potential. Overall the reported findings provide a promising in vitro culture strategy that allows the stem cell field to gain a better understanding of the impact of distinct exogenous signals on human HSCs, which discloses new concepts for the wide scientific community working towards tissue engineering and regenerative medicine. / Die Homöostase der Hämatopoietischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSC) in der Knochenmark Nische wird von einer Vielzahl exogener Faktoren gezielt reguliert. Diese Faktoren orchestrieren intrazelluläre Vorgänge, deren in vivo Analyse kompliziert ist. Die vorliegende These widmet sich einem neuen biotechnologischen Ansatz, der systematische Studien von Knochenmark-relevanten Faktoren ermöglicht. Im Speziellen wurde die Rolle 3D-präsentierter Zell Adhäsionsliganden in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen löslicher Zytokine untersucht. Die Auswertung der Proliferation und Differenzierung von humanen HSC auf Einzelzell- und Populationsebene offenbarte die synergistischen und antagonistischen Effekte von Adhäsions- und Zytokinsignalen in ihrer Abhängigkeit von der Verteilung und der Anzahl von Adhäsionsliganden sowie der Zytokinkonzentration. Um die poröse Struktur des Knochenmarks in vivo-ähnlich darzustellen, wurde eine Zellkultur Plattform mit Mikrokavitäten verschiedenster Dimensionen von Multi- bis Einzelzellgröße entwickelt und mit Molekülen der extrazellulären Matrix beschichtet. Die Vorteile dieser Plattform liegen in der offenen 3D-Geometrie dieses mikrokavitäten Kultursystems, die den Zellen ermöglichte verschiedene Wachstumsbedingungen bezüglich Homing, Migration, Adhäsion oder Suspension frei zu erkunden. Das leicht zugängliche Setup eignete sich zudem hervorragend für die zytometrische Analyse der Zellen oder die quantitative Mikroskopie. Die Einzelzellanalyse adhärenter HSC ergab eine Reduktion von DNA Synthese und eine höhere Expression von Stammzelloberflächenfaktoren innerhalb der Einzelzell-Mikrokavitäten bei niedrigen Zytokinkonzentrationen . Dieser Effekt spiegelte sich auch auf Populationsebene in verminderter Proliferation und Differenzierung mit abnehmender Größe der Mikrokavitäten wider. Wurde die Zytokinkonzentration jedoch weit über physiologische Bedingungen erhöht, verminderte sich der Effekt (reduzierte DNA Synthese und höhere Stammzellfaktorexpression) beschrieben für die Einzelzellmikrokavitäten. Dieses Ergebnis verdeutlicht die empfindliche intrazelluläre Balance, vermittelt durch Adhäsionsignale und löslichen Faktoren, die das Verhalten von HSCs regulieren. Aufgrund des 3D-Charakters des Zellkulturträgers wurden innerhalb kleiner Mikrokavitäten mehr Adhäsionsrezeptoren ringsum die Zelle aktiviert. Dieser Vorteil gegenüber den Multizellkavitäten oder der herkömmlichen 2D–Zellkultur ermöglichte eine hohe Anzahl adhäsionsvermittelter Signale mit entsprechend höherer Proliferations-inhibitorischer Wirkung. Je höher die Konzentration der Zytokine war, desto stärker erfolgte die Stimulation der Proliferation und Differenzierung. Auf 2D Substraten, initiierte Adhäsion zu Fibronektin und Heparin innerhalb der ersten 24h einen frühen Zell-Zyklus-Start im Gegensatz zu nicht adhärenten Zellen. Die Zytokine im Zellmedium förderten die Integrin Aktivierung, was zu einer schnellen Zelladhäsion führte. Die Adhäsionsrezeptoren wiederum kooperieren mit Zytokinrezeptoren im Zellinneren und begünstigten damit einen zeitigeren Zell-Zyklus- Start. Allerdings stellte sich danach ein Gleichgewicht im Kultursystem ein, wobei weniger adhärente Zellen als nicht-adhärente Zellen den Zellzyklus durchliefen. Des Weiteren war die Zellzyklusrate innerhalb von 3D Mikrokavitäten niedriger verglichen mit herkömmlichen 2D Substraten. Diese Ergebnisse bestätigen ferner obenstehende These, dass Zytokin-induzierte Zellexpansion durch erhöhte Zelladhäsions-vermittelte Signale überschrieben wird. Um die in vitro Studien zu komplettieren wurde ein in vivo Repopulationsversuch durchgeführt. HSC kultiviert auf Einzel-Zell-Mikrokavitäten übertrafen frisch isolierte Konkurrenz-Zellen in einem kompetitiven Repopulationsversuch. Dieses erste Ergebnis zeigt, dass sich der Zellgröße entsprechende Biomaterialien für die erfolgreiche Stammzell-Kultur eignen. Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten eine vielversprechende in vitro Zellkulturstrategie, die ein besseres Verständnis der Einflüsse von exogenen Signalen auf HSC erlaubt und damit eine Grundlage für neue Erkenntnisse in Richtung erfolgreicheres Tissue Engineering und klinische Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin bildet.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.