Die mechanischen Eigenschaften von Zellen charakterisieren und beeinflussen deren Zustand. Die vorliegende Arbeit zielt auf ein besseres Verständnis der biomechanischen Eigenschaften von Zellen ab. Der Fokus lag dabei auf der Biegesteifigkeit von Zellmembranen und der Deformierbarkeit der Zellen. Es werden drei Studien vorgestellt in der diese Materialparameter untersucht wurden. Die erste Studie befasst sich mit der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften. Hierbei wurden acht verschieden Zelllienien bei jeweils fünf Temperaturen rheologisch vermessen. Zur Messung wurde der sog. \"optical stretcher\" verwendet der gleichzeitig die Zellen deformieren und aufheizen kann. Die Versuche zeigen, dass eine Zeit-Temperatur superposition dabei nicht für alle Zelltypen funktioniert. In der zweiten Studie wurden die Membransteifigkeit von Gewebeproben von Brust- und Gebärmutterhalskrebspatienten untersucht. Als Kontrollsystem wurde gutartiges Gewebe aus dem Umfeld des Tumors verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellmembranen von Tumorzellen weicher waren als von gesundem Vergleichsgewebe. Die Änderung der Membrankomposition wurde dabei als mögliche Ursache massenspektroskopisch Untersucht und verschieden Ursachen der weichen Membrane diskutiert. Für die dritte Studie wurde der chemische Wirkstoff Soraphen A eingesetzt um die Membransteifigkeit von zwei Zelllienien zu erhöhen. Dies zeigte eine Verringerung von Zellbeweglichkeit und Invasivität.

Die mechanischen Eigenschaften von Zellen charakterisieren und beeinflussen deren Zustand. Die vorliegende Arbeit zielt auf ein besseres Verständnis der biomechanischen Eigenschaften von Zellen ab. Der Fokus lag dabei auf der Biegesteifigkeit von Zellmembranen und der Deformierbarkeit der Zellen. Es werden drei Studien vorgestellt in der diese Materialparameter untersucht wurden. Die erste Studie befasst sich mit der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften. Hierbei wurden acht verschieden Zelllienien bei jeweils fünf Temperaturen rheologisch vermessen. Zur Messung wurde der sog. \"optical stretcher\" verwendet der gleichzeitig die Zellen deformieren und aufheizen kann. Die Versuche zeigen, dass eine Zeit-Temperatur superposition dabei nicht für alle Zelltypen funktioniert. In der zweiten Studie wurden die Membransteifigkeit von Gewebeproben von Brust- und Gebärmutterhalskrebspatienten untersucht. Als Kontrollsystem wurde gutartiges Gewebe aus dem Umfeld des Tumors verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellmembranen von Tumorzellen weicher waren als von gesundem Vergleichsgewebe. Die Änderung der Membrankomposition wurde dabei als mögliche Ursache massenspektroskopisch Untersucht und verschieden Ursachen der weichen Membrane diskutiert. Für die dritte Studie wurde der chemische Wirkstoff Soraphen A eingesetzt um die Membransteifigkeit von zwei Zelllienien zu erhöhen. Dies zeigte eine Verringerung von Zellbeweglichkeit und Invasivität.

A theoretical explanation of the existence of lipid rafts in cell membranes remains a topic of lively debate. Large, micrometer sized rafts are readily observed in artificial membranes and can be explained using thermodynamic models for phase separation and coarsening. In live cells such domains are not observed and various models are proposed to describe why the systems do not coarsen. We review these attempts critically and show within a phase field approach that membrane bound proteins have the potential to explain the different behaviour observed in vitro and in vivo. Large scale simulations are performed to compute scaling laws and size distribution functions under the influence of membrane bound proteins and to observe a significant slow down of the domain coarsening at longer times and a breakdown of the self-similarity of the size-distribution function. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Prominin-1 (alias CD133) has received considerable interest because of its expression by several stem and progenitor cells originating from various sources, including the neural and hematopoietic systems. As a cell surface marker, prominin-1 is now used for somatic stem cell isolation. Its expression in cancer stem cells has broadened its clinical value, as it might be useful to outline new prospects for more effective cancer therapies by targeting tumor-initiating cells. Cell biological studies of this molecule have demonstrated that it is specifically concentrated in various membrane structures that protrude from the planar areas of the plasmalemma. Prominin-1 binds to the plasma membrane cholesterol and is associated with a particular membrane microdomain in a cholesterol-dependent manner. Although its physiological function is not yet determined, it is becoming clear that this cell surface protein, as a unique marker of both plasma membrane protrusions and membrane microdomains, might reveal new aspects of the cell biology of rare stem and cancer stem cells. The aim of this review is to outline the recent discoveries regarding the dynamic reorganization of the plasma membrane of rare CD133+ hematopoietic progenitor cells during cell migration and division. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Over millions of years evolution has optimized the properties of materials via natural selection for many specific purposes. Indeed, natural materials have unique properties which come very close to perfection. Cells, for instance, are able to carry out intricate sequences of chemical reactions that are difficult or impossible to carry out ex vivo, cell membranes are the most complex selective and responsive semipermeable membranes that exist, and animal shells exhibit a clever nanostructure that renders them hard and tough at the same time. In short, materials scientists can learn a lot from nature’s materials. The perfection and performance of nature’s materials not only spark fascination, but also trigger the question as to why certain structures or surfaces exhibit outstanding properties and inspire research towards new materials. While the materials of living nature impressively serve dedicated purposes, they are formed under restricted conditions. For instance, they have to be designed to function under a narrowly defined set of physiological conditions, and can only be composed of building blocks an organism has available. Without these restrictions, material scientists can design entirely new materials or surfaces.

Prominin-1 (alias CD133) has received considerable interest because of its expression by several stem and progenitor cells originating from various sources, including the neural and hematopoietic systems. As a cell surface marker, prominin-1 is now used for somatic stem cell isolation. Its expression in cancer stem cells has broadened its clinical value, as it might be useful to outline new prospects for more effective cancer therapies by targeting tumor-initiating cells. Cell biological studies of this molecule have demonstrated that it is specifically concentrated in various membrane structures that protrude from the planar areas of the plasmalemma. Prominin-1 binds to the plasma membrane cholesterol and is associated with a particular membrane microdomain in a cholesterol-dependent manner. Although its physiological function is not yet determined, it is becoming clear that this cell surface protein, as a unique marker of both plasma membrane protrusions and membrane microdomains, might reveal new aspects of the cell biology of rare stem and cancer stem cells. The aim of this review is to outline the recent discoveries regarding the dynamic reorganization of the plasma membrane of rare CD133+ hematopoietic progenitor cells during cell migration and division. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

A theoretical explanation of the existence of lipid rafts in cell membranes remains a topic of lively debate. Large, micrometer sized rafts are readily observed in artificial membranes and can be explained using thermodynamic models for phase separation and coarsening. In live cells such domains are not observed and various models are proposed to describe why the systems do not coarsen. We review these attempts critically and show within a phase field approach that membrane bound proteins have the potential to explain the different behaviour observed in vitro and in vivo. Large scale simulations are performed to compute scaling laws and size distribution functions under the influence of membrane bound proteins and to observe a significant slow down of the domain coarsening at longer times and a breakdown of the self-similarity of the size-distribution function. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.

Wie in anderen Zellen sind auch bei Säugerspermien spezifische Lipide und Proteine der Zellmembran aufgrund ihrer heterogenen lateralen Verteilung in speziellen Domänen angereichert, die in unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Dimensionen existieren und der Zelle funktionale Variabilität ermöglichen. Aufgrund der fehlenden aktiven Proteinbiosynthese bietet dies den Spermien eine Möglichkeit, auf unterschiedliche Anforderungen zu reagieren. In der vorliegenden Arbeit wurden daher sogenannte detergenzresistente Membrandomänen (DRMs) aus Eberspermien unterschiedlicher Reifestadien präpariert und untersucht. Dabei stieg bereits in den Dichtegradienten mit zunehmender Reife die Dichte, bei der die opaleszenten Banden auftraten. Eine Analyse dieser mittels 31P-NMR zeigte mit zunehmender Reife eine Anreicherung an Glycerophosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol bei den Glycerophospholipiden, der Gehalt an Sphingomyelin hingegen nahm während der Nebenhodenreifung und auch nach der Ejakulation ab. Diese Veränderungen könnten auf eine Destabilisierung von Membrandomänen hindeuten, um eine Zusammenlagerung zu größeren Domänenclustern zu erleichtern, möglicherweise in Vorbereitung auf Kapazitation und Akrosomenreaktion. Zunächst werden die destabilisierten Membrandomänen jedoch durch die Anlagerung von Seminalplasmaproteinen geschützt, was vermutlich für das verringerte Lipid- zu Proteinverhältnis der DRMs bei Ejakulatspermien sorgt. Aufgrund der generellen Kälteempfindlichkeit von Eberspermien findet ihre Lagerung üblicherweise bei 16°C statt. Dies ist aus mikrobiologischer Sicht nachteilig gegenüber einer kälteren Lagerungstemperatur. Eine Untersuchung der Spermien von 64 Ebern zeigte jedoch bei 10% der Ejakulate eine individuum-spezifische Resistenz gegenüber der Lagerung bei 4°C. Die DRMs der kälteresistenten Spermien hatten einen erhöhten Anteil an langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie 31P-NMR und MALDI-TOF MS Analysen zeigten. / The lateral distribution of lipids and proteins in the plasma membrane is heterogeneous. Therefore specific lipids and proteins in membranes of mammalian spermatozoa are enriched in special domains of varying size and different time scales enabling the cell’s membrane functional variability. Being transcriptional inactive this is especially relevant for spermatozoa in responding to multiple challenges on their way to fertilization. Therefore so called detergent resistant membrane domains (DRMs) from boar spermatozoa of different developmental stages were investigated. Already in the sucrose density gradients differences were visible, so the opalescent bands of more maturated sperm had a higher density. An analysis of these bands by 31P-NMR showed an enrichment of glycerophosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol during maturation and a decrease of sphingomyelin during maturation in the epididymis and even after ejaculation. This suggests destabilization of DRMs and hence of putative membrane domains. This could enable clustering to bigger membrane domain platforms in preparation for capacitation and acrosome reaction. First, however, seminal fluid proteins cover the spermatozoa protecting the membrane with the destabilized membrane domains. This could have led to the detected decrease of the lipid to protein ratio in DRMs of ejaculated sperm. Boar spermatozoa are sensitive to storage at cold temperatures and are therefore usually stored at 16°C, which is especially disadvantageous with regard to growing of bacteria. A screening of sperm from 64 boars showed a ratio of 10% individuals with cold resistant sperm which could be stored at 4°C without quality loss. The DRMs of cold resistant sperm had a higher proportion of longchained, polyunsaturated fatty acids, as shown by analysis with 31P-NMR und MALDI-TOF MS.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.