Der globale Prävalenzanstieg allergischer Erkrankungen wird mit der westlichen Ernährung und einem sich ändernden Fettsäurespektrum assoziiert. Die omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) wurde bereits bei verschiedenen chronisch-entzündlichen Erkrankungen erfolgreich therapeutisch eingesetzt. Die dabei zugrunde liegenden Wirkmechanismen sind jedoch nicht vollständig geklärt. Deshalb wurde hier der molekulare Mechanismus der DHA-vermittelten Hemmung der IgE-Produktion in humanen B-Zellen sowie der verminderten Differenzierung IgE-produzierender Plasmazellen in vitro untersucht. Analysen der beteiligten Signaltransduktionswege offenbarten eine Reduktion der IL-4-abhängigen STAT6-Phosphorylierung und der CD40-vermittelten NFkappaB-Translokation, was zu einer Inhibition des IgE-Klassenwechsels auf dem Niveau des epsilon-Keimbahntranskriptes sowie der Aktivierungsinduzierten Desaminase führte. Weiterhin wurde in einer randomisierten, kontrollierten Doppelblindstudie die Supplementierung mit hochdosierter DHA bei Patienten mit atopischem Ekzem hinsichtlich klinischer und immunologischer Parameter geprüft. Dabei führte DHA zu einer Reduktion des Schweregrades der Erkrankung und zu einer verminderten IgE-Produktion anti-CD40/IL 4-stimulierter Blutzellen ohne Beeinflussung des Serum-IgE-Spiegels. Schließlich wurden die lokalen Prozesse nach DHA-Verabreichung in einem Mausmodell für proteininduzierte Dermatitis analysiert. Dabei war die Reduktion der klinischen Ekzemausprägung mit der verminderten Zahl dermaler CD8+ T-Zellen verbunden. Andere histologische Parameter und das Serum-IgE blieben jedoch unbeeinflusst. Durch die Fähigkeit von DHA, in den IgE-Klassenwechsel in B-Zellen einzugreifen, stellt die Supplementierung mit DHA somit eine mögliche präventive Maßnahme gegen allergische Erkrankungen dar. Ebenso ist DHA in der Lage, den Schweregrad des atopischen Ekzems durch die positive Beeinflussung lokaler inflammatorischer Prozesse signifikant zu verbessern. / The prevalence of allergic diseases has increased worldwide. Westernised diet with its changing polyunsaturated fatty acid (PUFA) proportions is considered to contribute to this development. The omega-3 PUFA Docosahexaenoic acid (DHA) has been reported to be antiinflammatory, but its way of action is not completely understood. Initially, the molecular mechanisms of DHA impact on IgE production in human B cells were examined in vitro. Thereby, DHA inhibited IgE production and the differentiation of IgE secreting cells. This was mediated through direct inhibition of the immunoglobulin isotype switching process by decreasing epsilon germline transcript and activation induced desaminase transcription. Analysis of involved signalling pathways revealed an inhibition of IL-4 driven STAT6 phosphorylation and a reduced NFkappaB translocation into nucleus upon CD40 ligation. Next, in a randomised, double bind, controlled clinical study the efficacy of high-dose DHA supplementation in atopic eczema was determined by investigating the impact on clinical and immunological parameters. In the DHA, but not in control group a clinical improvement of atopic eczema and a reduction of CD40/IL-4 mediated IgE synthesis of peripheral blood cells were observed whereas serum IgE levels remained unchanged. Finally, in a mouse model the impact of oral DHA application on allergen induced dermatitis as well as the underlying local mechanisms were investigated. Thereby, the DHA mediated reduction of clinical skin score was associated with decreased dermal CD8+ T cell numbers, whereas other histological parameters or serum IgE values were not affected. In summary the results indicate that dietary DHA may be effective in prevention of allergic diseases by interference with the IgE switching process and improve the clinical outcome of atopic eczema by its positive impact on local inflammatory processes.

Les zones littorales à macrophytes ont un rôle fonctionnel important dans les hydrosystèmes fluviaux. Outre leur forte productivité, ces milieux se caractérisent également par une forte biodiversité. Cependant, les liens pouvant exister entre hétérogénéité spatiale, biodiversité et flux de matière restent encore peu connus. En milieu aquatique, les microcrustacés représentent un maillon clef entre les microorganismes eucaryotes, qui sont les principaux producteurs d’acide gras polyinsaturés (AGPI), et le compartiment piscicole. Dans ce travail de thèse, nous avons donc cherché à savoir comment la diversité des cladocères rencontrée dans une zone littorale à macrophytes pouvait affecter le transfert des AGPI dans les réseaux trophiques. L’approche vers laquelle s’est orienté ce travail combine à la fois des études menées en milieu contrôlé, permettant des expériences de nutrition, ainsi que des études menées en milieu naturel. Cette double approche permet de faciliter l’interprétation des résultats issus des analyses lipidiques, isotopiques et isotopiques de composés spécifiques. Nos résultats montrent ainsi qu’il n’existe pas de variabilité dans les capacités d’accumulation et de bioconversion des AGPI chez les cladocères coexistant dans une zone littorale à macrophytes. D’après ces résultats, il semble donc que le principal facteur influençant la variabilité des transferts d’AGPI vers le compartiment piscicole soit la stratégie alimentaire et le compartiment trophique exploité par les différentes espèces de microcrustacés. En effet, outre le seston, notre étude montre que certaines espèces de cladocères rencontrées en zone littorale sont capables d’exploiter l’épiphyton et le neuston. Les analyses lipidiques mettent de plus en évidence, que la diversité des compartiments trophiques exploités s’accompagne d’une variabilité d’apports en AGPI. Dans notre étude, l’épiphyton est ainsi significativement plus concentré en AGPI que le seston. A l’interface air-eau, le neuston se caractérise de plus, par une forte accumulation de matière organique d’origine allochtone qui, dans le cas d’une pluie de pollen, représente une source de carbone et d’AGPI non négligeable pour certaines espèces de microcrustacés. Dans les zones littorales à macrophytes, la complémentarité des espèces de cladocères entraine donc une utilisation plus complète des ressources. La diversité des compartiments trophiques, associée à la diversité des microcrustacés, permet donc probablement une optimisation du transfert des AGPI vers les niveaux trophiques supérieurs. / Areas with littoral macrophytes play an important functional role in freshwater systems. In addition to the high productivity recorded in such areas, they also shelter a high diversity of organisms. However, possible links between spatial heterogeneity, biodiversity and energy pathways are still poorly known. As they constitute the major link between microorganisms and species higher in the food web, microcrustaceans play a key role in the transfer of polyunsaturated fatty acids (PUFA) to organisms at higher trophic levels. In this study, we wanted to assess if microcrustaceans diversity encountered in macrophytes littoral zones would lead to a variability of PUFA transfer in the food web. This work combined controlled conditions experiment and studies run in natural environments in order to help the interpretation of results from lipid analysis, isotopic analysis and fatty acid isotope analysis. Our results indicate that there are no differences of PUFA concentrations between cladocerans from a macrophyte littoral zone when they were exposed to the same pool of dietary PUFA. Hence, in heterogeneous feeding habitats such as macrophytes zones where these cladocerans often co-exist, foraging behavior of cladoceran species more than differences of metabolism may be crucial for determining PUFA transfer to upper trophic levels. In addition to seston, our study shows indeed that some cladoceran species are able to forage on the epiphytic and neustonic compartments. Lipid analyses highlight moreover that the diversity of trophic compartments lead to a variability of PUFA inputs to primary consumers. In our study, the epiphytic compartment is indeed significantly more concentrated in PUFA than seston. At the air-water interface, neuston is moreover characterized by important allochthonous organic matter accumulation. During a pollen rain, this organic matter represents an important source of carbon and PUFA for some microcrustacean species. In macrophytes littoral zones, cladocerans complementarity leads to a more complete use of PUFA sources. The association of trophic compartment diversity and microcrustacean diversity probably allows an optimization of PUFA transfer to higher trophic levels.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.

Snow algae as typical extremophiles are good model organisms for study of adaptation for life on the boundary of physiological possibilities. So far, it is not clear, how these microorganisms ensure on the molecular level the optimization of photosynthetic processes in conditions around 0 řC, often with very high light intensity. The aim of this work was to find out light and temperature growth optima of two less studied strains and to assess the composition of fatty acids in selected psychrophilic and psychrotrophic strains from the genera Chloromonas and Chlamydomonas (Chlamydomonadales, Chlorophyta) from culture collections UTEX and CCCryo and collections in Europe including the Czech Republic and Slovakia. Using crossed gradients method, this thesis describes optimal temperature and light conditions of two strains of snow algae isolated from sites in the Krkonoše Mountains that are characterized by different ecological conditions. The strain Chloromonas reticulata Luční originates from alpine zone and according to its growth characteristics, it can be classified as psychrotrophic alga requiring high light. The second tested strain was Chloromonas pichinchae Meandry from forest environment, which is also characterized as psychrotrophic, In contrast to previous strain, it grows in a wide range of...

no / Bioactive lipid mediators derived from polyunsaturated fatty acids (PUFA) and exhibit a range of tissue and cell-specific activities in many physiological and pathological processes. Electrospray tandem mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC/ESI-MS/MS) is a sensitive, versatile analytical methodology for the qualitative and quantitative analysis of lipid mediators. Here we present an LC/ESI-MS/MS assay for the simultaneous analysis of twenty mono- and poly-hydroxy fatty acid derivatives of linoleic, arachidonic, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids. The assay was linear over the concentration range 1-100 pg/¿L, whilst the limits of detection and quantitation were 10-20 and 20-50 pg respectively. The recovery of the extraction methodology varied from 76-122% depending on the metabolite. This system is useful for profiling a range of biochemically-related potent mediators including the newly discovered resolvins and protectins, and their precursor hydroxy-eicosapentaenoic and hydroxy-docosahexaenoic acids, and, consequently, advance our understanding of the role of PUFA in health and disease. / Wellcome Trust, British Heart Foundation

This thesis focuses on the effects of n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA) on development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in experiment, on prevalence of this condition in patients with type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome and also on non-invasive diagnostics. The aim was to study the effect of n-3 PUFA on NAFLD development in an experimental model and based on analysis of a group of patients with type 2 diabetes and metabolic syndrome to assess the prevalence of this condition. Lastly we aimed to evaluate non-invasive diagnostic methods of liver fibrosis and NASH. We demonstrated beneficial effects of n-3 PUFA administration on NAFLD development in a C57/Bl6 mice high fat methionin-cholin defficient dietary model of NAFLD. n-3 PUFA administration led to biochemical improvement, decrease of lipid accumulation in the liver as well as improvement of histology. These effects are determined by complex modulation of lipid metabolism, mainly due to decrease in availability of fatty acids for triglyceride synthesis in the liver, changes of adipokine levels and amelioration of proinflammatory status in the liver. In a group of type 2 diabetics we found NAFLD prevalence of almost 80%, 14% of these patients had also signs of liver fibrosis or cirrhosis. Non-invasive methods...

This thesis focuses on the effects of n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFA) on development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in experiment, on prevalence of this condition in patients with type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome and also on non-invasive diagnostics. The aim was to study the effect of n-3 PUFA on NAFLD development in an experimental model and based on analysis of a group of patients with type 2 diabetes and metabolic syndrome to assess the prevalence of this condition. Lastly we aimed to evaluate non-invasive diagnostic methods of liver fibrosis and NASH. We demonstrated beneficial effects of n-3 PUFA administration on NAFLD development in a C57/Bl6 mice high fat methionin-cholin defficient dietary model of NAFLD. n-3 PUFA administration led to biochemical improvement, decrease of lipid accumulation in the liver as well as improvement of histology. These effects are determined by complex modulation of lipid metabolism, mainly due to decrease in availability of fatty acids for triglyceride synthesis in the liver, changes of adipokine levels and amelioration of proinflammatory status in the liver. In a group of type 2 diabetics we found NAFLD prevalence of almost 80%, 14% of these patients had also signs of liver fibrosis or cirrhosis. Non-invasive methods...

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) have been used with some success in the treatment of canine atopic dermatitis (CAD). Correspondent in vitro studies revealed that PUFA play a crucial role in the exocytosis of mast cells. n3 PUFA such as α-linolenic acid (LNA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), as well as the n6 PUFA linoleic acid (LA) have been shown to arrest the secretion of inflammatory mediators. Contrary, the n-6 PUFA arachidonic acid (AA) has been proven to promote the production of mast cell inflammatory mediators. However, we are still lacking a complete picture of the mode of action. The goal of this work was to further characterize the modulatory effects of PUFA supplementation on the plasma membrane lipid composition of mast cells. Furthermore the consequences of a membrane modulation of mast cells by PUFA on the localization and activity on of the membrane bound enzyme phospholipases D (PLD) were investigated. Canine mastocytoma cells (C2) were supplemented with one of the following PUFA: LNA, EPA, DHA, LA or AA. To investigate the influence of PUFA on the lipid composition of membrane microdomains, lipid rafts were separated from non-raft plasma membranes of mast cells for the first time using a detergent-free isolation technique. Results show that PUFA are significantly increased in rafts as well as in non-rafts microdomains (Publication 1). The incorporation of PUFA into the membrane goes along with an increase of the unsaturation status and the fluidity of the membrane. This rise in membrane fluidity may result in a reorganization of membrane signaling molecules and enzymes such as the PLD. To define the impact of a PUFA supplementation on PLD trafficking, C2 were transfected with green fluorescent protein (GFP) fusion plasmids encoding PLD1 or PLD2. Since the transfection ability of the suspension cell line C2 is limited, a special transfection protocol was established, suitable for non-adherent cell lines. Transfection succeeded using chicken egg white as coating material for the cell culture plates. The transfection efficiency rose to 50% versus 5% in uncoated plates. In addition to the obvious increase in the transfection efficiency, the new technique is simple and economic and might be suitable for a wide range of suspension cell lines (Publication 2). Using this optimized protocol the influence of PUFA on the trafficking of PLD isoforms was studied. LNA, EPA, DHA and LA but not AA prevented the stimulation-induced translocation of PLD1 to the plasma membrane. Since the translocation of PLD1 is important for mast cell exocytosis, LNA, EPA, DHA and LA do have an inhibiting effect on the stimulation-induced release of pro-inflammatory mediators. All PUFA tested boosted the total PLD activity. In order to rule out, which PLD isoform was affected by the PUFA, the mast cells were supplemented with DHA or AA in the presence of specific PLD isoform inhibitors. DHA completely abolished the inhibitiory effect of the PLD1 inhibitor but had no effect on the inhibitory effect of PLD2 inhibitor. On the other hand, AA suppressed the inhibitory effect of both PLD1 and PLD2 inhibitor (Publication 3). Taking together, the studies provide a mechanistic base for the role of PUFA in the exocytosis processes of mast cells. PUFA of the n3 and the n6 families impact the lipid composition of membrane microdomains, which in turn lead to a modulation of the physiochemical properties of the membrane. LNA, EPA, DHA and LA suppress the release of inflammatory mediators through their inhibitory action on the stimulation-induced translocation of the PLD1. Contrariwise, AA permits the stimulation-induced migration of PLD1 to the plasma membrane and increases the activity of both PLD isoforms. Therefore, LNA, EPA, DHA and LA but not AA inhibit the release of mast cell inflammatory mediators upon stimulation. / Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) können mit einigem Erfolg zur Behandlung der caninen atopischen Dermatitis (CAD) eingesetzt werden. In vitro-Studien zeigten, dass PUFA eine entscheidende Rolle in der Exozytose von Mastzellen spielen. N-3-PUFA wie α-Linolensäure (LNA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA) sowie die n-6-PUFA Linolsäure (LA) können die Sekretion von Entzündungsmediatoren vermindern. Arachidonsäure (AA) als n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure hingegen fördert die Entzündungsmediatoren-Freisetzung aus den Mastzellen. Eine vollständige Aufklärung der Wirkungsweise fehlt aber weiterhin. Das Ziel dieser Arbeit war eine weitergehende Charakterisierung der modulierenden Effekte einer PUFA-Supplementierung auf die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran von Mastzellen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen von PUFA auf die Lokalisation und Aktivität des Membran-gebundenen Enzyms Phospholipase D (PLD) untersucht. Canine Mastozytom-Zellen (C2) wurden mit einer der folgenden PUFA kultiviert: LNA, EPA, DHA, LA oder AA. Um den Einfluss von PUFA auf die Lipidzusammensetzung der Membran-Mikrodomänen zu untersuchen, konnten sowohl Lipid Raft als auch Nicht-Raft Plasmamembran-Anteile von Mastzellen zum ersten Mal mittels einer Detergenzien-freien Isolationsmethode getrennt werden. Hervorzuheben ist, dass PUFA signifikant vermehrt in Raft- sowie in Nicht-Raft Membranmikrodomänen eingelagert werden (Publikation 1). Die Integration von PUFA in die Membran geht mit einer Steigerung der Doppelbindungsanzahl und der Fluidität der Membran einher. Diese Erhöhung der Membranfluidität kann zu einer Reorganisation von membranären Signalmolekülen und Enzymen wie der PLD führen. Um die Auswirkungen einer PUFA-Supplementierung auf den intrazellulären Transport der PLD in C2 zu bestimmen, wurden die Zellen mit PLD1- oder PLD2-codierenden grün fluoreszierenden Protein-(GFP-)Fusionsplasmiden transfiziert. Da die Transfektionsfähigkeit der Suspensions-Zelllinie C2 begrenzt ist, wurde ein für nicht-adhärente Zelllinien geeignetes Transfektionsprotokoll etabliert. Mit Hühnereiweiß als Beschichtungsmaterial für die Zellkultur-Platten stieg die Transfektionseffizienz auf 50% im Vergleich zu 5% bei unbeschichteten Platten. Neben der deutlichen Erhöhung der Transfektionseffizienz ist die neu etablierte Technik einfach durchzuführen sowie wirtschaftlich und kann für eine Vielzahl von Suspension-Zelllinien geeignet sein (Publikation 2). Unter Verwendung dieses optimierten Protokolls wurde der Einfluss von PUFA auf die Translokation der PLD-Isoformen untersucht. LNA, EPA, DHA und LA, nicht aber AA verhindern die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1 an die Plasmamembran. Die Translokation der PLD1 ist wichtig für die Mastzell-Exozytose. LNA, EPA, DHA und LA haben hier eine hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren. Alle getesteten PUFA verstärken die Gesamt-PLD-Aktivität. Um zu unterscheiden, welche PLD-Isoform durch PUFA beeinflusst ist, wurden die Mastzellen mit DHA oder AA in Gegenwart von PLD-Isoform-Inhibitoren supplementiert. DHA hebt die inhibitorische Wirkung des PLD1-Inhibitors vollständig auf, zeigte aber keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung des PLD2-Inhibitors. Andererseits unterdrückt AA die hemmende Wirkung des PLD1- als auch des PLD2-Inhibitors (Publikation 3). Zusammenfassend bietet die Studie eine mechanistische Basis für die Rolle von PUFA bei Exozytose-Prozessen von Mastzellen. PUFA der n-3- und n-6-Familie beeinflussen die Lipidzusammensetzung von membranären Mikrodomänen, was wiederum zu einer Modulation der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Membran führt. LNA, EPA, DHA und LA verhindern die Freisetzung von Entzündungsmediatoren durch ihre hemmende Wirkung auf die stimulationsinduzierte Translokation der PLD1. Umgekehrt erlaubt AA eine stimulationsinduzierte Migration der PLD1 zur Plasmamembran und steigert die Aktivität der beiden Isoformen der PLD. Somit hemmen LNA, EPA, DHA und LA, aber nicht AA die Freisetzung von Mastzell-Entzündungsmediatoren nach Stimulation.