Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rampasio_RaquelRodrigues_M.pdf: 2052024 bytes, checksum: 07f4cd2fcba87af264e6efceab06d527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade / Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

O sabugo de milho, devido a sua estrutura lignocelulósica, pode servir como fonte de biomassa renovável na produção de açúcares solúveis que podem ser convertidos em produtos de elevados valores agregados, como etanol e outros. A hidrólise ácida é o método mais utilizado na obtenção de hidrolisado hemicelulósico de materiais lignocelulósicos ricos em açúcares fermentescíveis, sendo o açúcar xilose em maior concentração. A levedura fermentadora de xilose Scheffersomyces stipitis está entre os poucos organismos que utilizam a xilose e a glicose e exibem um sistema regulatório de transição entre o processo respiratório e o fermentativo. Este trabalho teve como objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia de obtenção de bioetanol por S. stipitis CBS 6054, a partir da fração hemicelulósica do sabugo de milho, avaliando a formulação nutricional do meio de fermentação. Como fonte de nitrogênio alternativa foi escolhida o farelo de soja. O hidrolisado hemicelulósico de sabugo de milho (HHSM), obtido por hidrólise ácida, foi concentrado a vácuo e tratado pela elevação e abaixamento de pH. O hidrolisado de farelo de soja foi obtido por hidrólise enzimática (Alcalase, 600C, 100 rpm, 3h). Para avaliar a solubilidade do hidrolisado de farelo de soja em HHSM (pH de 4,0 a 7,0) empregou-se planejamento fatorial 22 completo com análise de superfície de resposta (RSM). A suplementação do HHSM com a proteína de farelo de soja solubilizada em associação ou não com outros nutrientes (ureia e sulfato de amônio) na obtenção de bioetanol por S. stipitis foi avaliada por meio de um planejamento fatorial 23 completo com RSM. A fermentação foi realizada em frascos de Erlenmeyer (125 mL) contendo 50 mL de meio sob agitação de 150 rpm e 30 °C. A concentração de inoculo foi de 1,5 g/L de células. Os resultados mostraram que a hidrólise ácida favoreceu a remoção da fração hemicelulósica (88,05%) com pouca alteração na celulose (10,06%) e da lignina (27,07%) com relação ao material in natura, proporcionando um hidrolisado hemicelulósico rico em xilose (28,30 g/L) com baixas concentrações de compostos fenólicos e furanos. O tratamento do HHSM reduziu seu teor proteico em relação ao hidrolisado concentrado (74,76%) e hidrolisado original (28,53%). O farelo de soja foi de boa qualidade apresentando solubilidade da proteína em KOH igual a 82,99% e índice de urease igual a 0,00. A hidrólise enzimática de farelo de soja hidrolisou 50,45% mais proteína do que a extração aquosa de proteína de farelo de soja, obtendo-se 45 g/L de proteína solubilizada. Na quantificação de proteína pelo método de Lowry foi necessário levar em consideração a presença de espécies interferentes do HHSM. A máxima solubilização da proteína de soja (9,02 g/L) em HHSM foi obtida maximizando a concentração de hidrolisado de farelo de soja (5,0 g/L). O pH, nos níveis estudados, não influenciou a solubilização da proteína de soja em HHSM. Pela RMS, o valor máximo para o fator de conversão de açúcares em etanol (0,20 g/g) pode ser alcançado empregando-se hidrolisado de farelo de soja em seu nível superior (5,0 g/L) e uréia (3 g/L) e sulfato de amônio (3,0 g/L) em seus pontos centrais. A fonte de proteína de farelo de soja solubilizada em HHSM tem potencial como fonte de nitrogênio alternativa na produção de bioetanol por Scheffersomyces stipitis. / The corn cob, due to its lignocellulosic structure, can be used as a biomass renewable source for soluble sugars can be converted into high value-added products, such as ethanol and others. Acid hydrolysis is the mostly used method to obtain hemicellulosic hydrolysate from lignocellulosic materials, leading to the obtaining of the xylose sugar at the highest concentration, from their hemicellulosic fraction. The xylose fermenting yeast Scheffersomyces stipitis is among the few organisms that utilize both xylose and glucose regulatory systems and exhibits a transition between the respiratory and fermentative processes. This work aims to contribute to the development of a technology to obtain bioethanol by Scheffersomyces stipitis CBS 6054, from the corn cob hemicellulosic fraction, evaluating the nutritional formulation of the fermentation medium. As an alternative of nitrogen source, it was chosen soybean bran. The corn cob hemicellulosic hydrolysate (HHSM) was obtained by acid hydrolysis, vacuum evaporated and treated by pH variation. Hydrolysate of soybean bran was obtained by enzymatic hydrolysis (Alcalase, 60°C, 100 rpm, 3h). The solubility evaluation of the hydrolysate of soybean bran in HHSM (pH 4.0 to 7.0) was performed by 22 full factorial design using response surface methodology (RSM). The supplementation of HHSM with solubilized soybean bran protein associated or not with other nutrients (urea and ammonium sulphate) to obtain bioethanol employed a 23 full factorial design using RSM. The fermentation was carried out in Erlenmeyer flasks (125 mL) containing 50mL of medium stirred at 150rpm and 30 °C. The inoculum concentration was 1.5 g/L of cells. The results showed that the acid hydrolysis favored removal of the hemicellulosic fraction (88.05%) with little change in cellulose (10.06%) and lignin (27.07%) compared to the in natura material, providing a hemicellulosic hydrolysate rich in xylose (28.30 g/L) with low concentrations of phenolics compounds and furans. Treatment of HHSM reduced protein content in the vaccum evaporated hydrolysate (74.76%) and original hydrolysate (28.53%). Soybean bran had good quality as shown by the protein solubility of KOH of 82.99 % and by urease index of 0.00. The soybean bran enzymatic hydrolysis produced 50.45% more protein than aqueous soybean bran protein extraction, yielding 45 g/L of solubilized protein. In the determination of protein content by the Lowry method was necessary to take into account the presence of interfering species of the HHSM. The maximum soybean bran protein solubility (9.01 g/L) was obtained maximizing the concentration of hydrolysate of soybean bran (5.0 g /L) in HHSM. In the range studied in this work, the pH did not influence the solubility of soybean bran protein in HHSM. For the response surface methodology, the maximum value for the ethanol yield (0.20 g/g.) can be achieved employing hydrolysate of soybean bran in its upper level (5.0 g/L) and urea (3 g/L) and ammonium sulfate (3 g/L) in their center points. The source of soybean bran protein solubilized in HHSM has potential as an alternative nitrogen source for bioethanol production by Scheffersomyces stipitis.

No presente trabalho foram estudados a necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para bioconversão a etanol pela levedura Pichia stipitis, e os efeitos da agitação e da razão Vfrasco/Vmeio, em frascos agitados, sobre os parâmetros fermentativos deste processo. Os estudos da suplementação do hidrolisado para produção de etanol por bioconversão pela levedura Pichia stipitis avaliou a adição dos nutrientes: uréia ( 0 a 2,3 g/L) MgSO4.7H2O (0 a 1,0 g/L) e extrato de levedura (0 a 3,0 g/L). Este estudo mostrou que apenas a adição 3 g/L de extrato de levedura foi necessária para que o processo alcançasse bons resultados de conversão (YP/S = 0,29 g/g) e produtividade em etanol (QP = 0,24 g/L.h) não necessitando portanto da adição dos demais nutrientes. Comparado com o meio suplementado com todos os nutrientes, a suplementação com apenas 3 g/L de extrato de levedura, levou a um aumento de 14% na produtividade do processo. A avaliação da oxigenação em frascos agitados mostrou que a aeração foi um fator capaz de influenciar fortemente os parâmetros de fermentação (YP/S e QP). A condição de maior aeração favoreceu a produção de células e a condição de menor aeração favoreceu a conversão em etanol, porém com baixa produtividade, sendo a produtividade em etanol favorecida por condições intermediárias de aeração, correspondente a agitação de 200 rpm e a razão Vfrasco/Vmeio de 2,5, onde foram alcançadas conversão em produto (YP/S) e produtividade em etanol (QP) de 0,36 g/g e 0,39 g/L.h, respectivamente, o que representa um aumento de cerca de 63% a produtividade e 24% a conversão em etanol, quando comparado com as condições de aeração utilizadas anteriormente. A cinética de fermentação de Pichia stipitis no hidrolisado empregando as condições de suplementação nutricional e aeração otimizadas mostrou que a máxima concentração de etanol alcançada para o hidrolisado suplementado foi cerca de 23,6 g/L após 48 horas, consumindo neste tempo 86 % dos açúcares presentes no meio. Comportamento semelhante foi observado para o meio sintético, onde, no mesmo tempo, a máxima concentração de etanol foi de 24,4 g/L, porém com completo consumo dos açúcares. / The present work studied the necessity of nutritional supplementation of rice straw hemicellulosic hydrolysate for ethanol bioconversion by Pichia stipitis, and the aeration (effects of agitation and Vflask/Vmedium ratio) in agitated flasks, on the fermentative parameters of the process. The studies on the hydrolysate supplementation for ethanol production by Pichia stipitis yeast bioconversion evaluated the nutrients addition: urea (0 to 2.3 g/L), MgSO47H2O (0 to 10 g/L) and yeast extract (0 to 3.0 g/L). This study showed that only the addition of 3g/L yeast extract was enough to obtain good results for ethanol conversion (YP/S = 0.29 g/g) and productivity (QP = 0.24 g/L.h). By comparing to the medium supplemented with all the nutrients, the supplementation with only 3 g/L yeast extract increased 14% the process productivity. The evaluation of the oxygenation in agitated flasks showed that the aeration highly influenced the fermentative parameters (YP/S and QP). The condition of higher aeration favored the cells production and the condition of lower aeration favored the ethanol conversion, but with low productivity. The ethanol productivity was favored by intermediary conditions of aeration, correspondent to 200 rpm agitation and 2.5 Vflask/Vmedium ratio, thus obtaining 0.36 g/g product conversion (YP/S) and 0.39 g/L.h ethanol productivity (QP). This means an increase of approximately 63% productivity and 24% ethanol conversion, when compared to the aeration conditions previously used. The kinetics of Pichia stipitis fermentation in the hydrolysate using the optimized conditions of nutritional supplementation and aeration rate showed that the maximum ethanol concentration for the supplemented hydrolysate was about 23.6 g/L after 48h, consuming 86% sugars present in the medium. Similar behavior was observed for the synthetic medium where, with the same time, the maximum ethanol concentration was 24.4 g/L, but with the complete sugars consumption.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de fermentação com diferentes fontes de nitrogênio e avaliar estratégias de aclimatação da levedura Pichia stipitis ao hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz visando melhorar a produção de etanol. Em uma primeira etapa do trabalho foram realizados estudos em meio semissintético para avaliar o efeito das fontes de nitrogênio arginina, ácido glutâmico, uréia e fosfato de amônio sobre a produção de etanol por P. stipitis. Os resultados em meio semissintético demonstraram que o meio composto por ácido glutâmico, fosfato de amônio e extrato de levedura nas concentrações de 3 g/L proporcionou os melhores resultados de conversão (YP/S = 0,36 g/g) e produtividade (QP = 0,71 g/L.h). O estudo de suplementação nutricional do hidrolisado mostrou que o crescimento de P. stipitis foi inibido pela suplementação com ácido glutâmico, e que a presença de extrato de levedura e fosfato de amônio não apresentou qualquer efeito sobre a produção de etanol, sendo o hidrolisado hemicelulósico capaz de suprir a necessidade nutricional da levedura, dispensando a sua suplementação para o uso como meio de fermentação. Na etapa de aclimatação da levedura P. stipitis ao hidrolisado, foram avaliadas cinco estratégias (A, B, C, D e E), baseadas em transferências sucessivas de células para meios com concentrações crescentes de hidrolisado, 45, 60 e 75 % (v/v). Durante a estratégia de aclimatação A foi possível isolar uma colônia (A75-2) capaz de fermentar em hidrolisado contendo 70 g/L de xilose, alcançando valores dos parâmetros YP/S (0,35 g/g) e QP (0,23 g/L.h), 10 e 28 % superiores, respectivamente, aos obtidos pela cepa original. Os resultados das estratégias B e C mostraram que mesmo empregando um maior número de transferências, assim como a utilização de elevadas concentrações celulares, não foram capazes de contribuir com o processo de aclimatação. Na avaliação das estratégias D e E, verificou-se que o emprego de condições de maiores níveis de fornecimento de oxigênio durante as etapas de transferências sucessivas propiciaram condições mais adequadas para que a levedura superasse os efeitos de inibição ocasionados pelos compostos tóxicos presentes no hidrolisado. A estratégia E, realizada sob condição de maior aeração, apresentou os melhores resultados dentre as estratégias de aclimatação avaliadas, sendo obtida uma produção de 27 g/L de etanol após 72 horas. Além disso, esta estratégia foi a única em que a levedura foi capaz de manter os valores de YP/S (0,33 g/g) e QP (0,35 g/L.h) durante todas as transferências, indicando uma maior aclimatação ao hidrolisado. Na fermentação em biorreator, o emprego de inóculo proveniente de cultivo sucessivo de células, quando comparado à fermentação realizada sem cultivo sucessivo, proporcionou um aumento de 7 e 50% sobre os valores de YP/S e QP, respectivamente. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que estratégias de aclimatação da levedura P. stipitis em hidrolisado não destoxificado são métodos eficazes para a superação de inúmeros problemas relativos às condições de stress fisiológico e inibição do metabolismo microbiano. Porém, a resposta fisiológica da levedura P. stipitis é dependente do número de transferências, concentração celular e oxigenação do meio. / In this work, different acclimatization strategies employing the yeast Pichia stipitis on rice straw hemicellulosic hydrolysate with high xylose concentration were evaluated. Initially, the effects of nitrogen sources supplementation in the semisynthetic and hydrolysate medium on P.stipitis fermentation were studied. The results showed that in semisynthetic medium the addition of glutamic acid, ammonium phosphate and yeast extract at concentrations of 3 g/L provided the best conversion (YP/S = 0.36 g/g) and productivity (QP = 0.71 g/L.h). On the other hand, the hydrolysate supplementation with yeast extract and ammonium phosphate did not show effect on the fermentative parameters, whereas glutamic acid supplementation inhibited completely the cellular growth. These results show that the hemicellulosic hydrolysate can be used as a fermentation medium without any nutritional supplementation. To overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present on rice straw hemicellulosic hydrolysate, five acclimatization strategies (A, B, C, D and E) were performed by sequentially transferring of the cells in hydrolysate containing increasing concentrations (45, 60 and 75% (v/v). During the strategy A was possible isolate a colony (A75-2) with ability to ferment the hydrolysate containing xylose at 70 g/L (YP/S = 0.35 g/g and QP =0.23 g/L.h), which corresponded to increase of 10 and 28%, respectively, as compared to the values obtained by the original strain. Employing a greater number of transfers, as well as the use of high cell concentrations (strategies B and C) was not possible improve to the acclimatization process. Regarding the strategy E, which employed higher levels of oxygen supply during periods of successive transfers, showed the most appropriate for the yeast overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present in the hydrolysate. With this strategy the best results (27 g/L ethanol after 72 hours) among all assessed, were observed. Moreover, this approach was the only in which the yeast was able to keep the values of YP/S (0.33 g/g) and QP (0.35 g/L.h) for all transfers, indicating greater acclimatization to hydrolysate. By using this strategy in bioreactor fermentation, it was obtained an increase of 7 and 50% on the values of YP/S and QP, respectively, in relation the reference fermentation (without successive transfer). It is possible conclude that acclimatization strategies of the yeast P. stipitis in no detoxified hydrolysate are effective methods to overcome numerous problems concerning the physiological stress and inhibition of microbial metabolism. However, the physiological response of yeast is dependent on the transfers number, cell concentration and oxygenation level of the medium.

Este trabalho avaliou a extração de xilose da palha de cana-de-açúcar sob diferentes condições de hidrólise por ácido sulfúrico diluído visando à obtenção de um hidrolisado hemicelulósico rico em xilose e ainda a fermentabilidade deste para a bioconversão a etanol por Pichia stipitis Y-7124. Inicialmente caracterizou-se a palha de cana e a fração hemicelulósica representou 30,79% da massa seca da palha, enquanto que a celulose representou 40,84% e a lignina 25,80%. Verificou-se ainda que 26,57% da palha corresponde à xilose, representando 86,27% de sua fração hemicelulósica. As hidrólises ácidas foram realizadas de acordo com um planejamento experimental fatorial fracionado 24-1 visando-se à resposta concentração de xilose (g/L) no hidrolisado hemicelulósico. Levou-se em consideração os fatores: tempo, temperatura, concentração da solução ácida e a relação sólido:líquido. A melhor resposta para a concentração de xilose foi encontrada nas condições do ponto central, com a média da concentração igual a 31,70 g/L. A análise de variância foi realizada para um screening do planejamento e observou-se que apenas os fatores concentração da solução ácida e temperatura foram significativos ao nível de 95% de confiança. Em seguida realizou-se ensaios para otimização da hidrólise ácida considerando os fatores temperatura e concentração da solução ácida. As condições de ótimo encontradas foram 130 ºC e a solução de ácido sulfúrico em 2,9% m/v, empregadas com uma relação sólido:líquido igual a 1:4 (g/mL) por 30 minutos de reação. Estas condições de ótimo permitiram a obtenção de um hidrolisado hemicelulósico com concentração igual a 56,5 g/L de xilose, correspondendo à extração de 85,1% da xilose da palha. Posteriormente, ensaios de fermentação foram conduzidos com o hidrolisado hemicelulósico obtido, visando à produção de etanol por P. stipitis em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 100 mL de meio hidrolisado para avaliar a fermentabilidade do hidrolisado obtido bem como a necessidade de suplementação nutricional e utilizou-se um planejamento experimental fatorial 23 de face centrada para verificar a influência dos fatores: concentração de ureia, concentração de MgSO4*7H2O e concentração de extrato de levedura. Os ensaios foram conduzidos a 200 rpm e 30 ºC. Verificou-se que o extrato de levedura (5 g/L) exerceu maior influência sobre o processo fermentativo e que o MgSO4*7H2O (0,5 g/L) não apresentou significância estatística. A melhor condição na fermentação para produção de etanol por P. stipitis encontrada foi empregando-se extrato de levedura (5 g/L), ureia (5 g/L) e MgSO4*7H2O (1,0 g/L), em que se obteve um fator de rendimento em etanol YP/S igual a 0,38 g/g e produtividade volumétrica igual a 0,41 g/L.h, em 60 horas de fermentação. / This work evaluated the sugar cane straw xylose extration under different diluted sulfuric acid hydrolysis conditions aiming at the attainment of hemicellulosic hydrolysate rich in xylose and their fermentability for ethanol bioconversion by Pichia stipitis Y 7124. Previous assays for chemical characterization of the sugar cane straw has been carried. The hemicellulosic fraction represented 30.79% of the dry straw mass, whereas the cellulose represented 40.84% and the lignin represented 25,80%. It was verified despite 26,57% of the straw corresponded to xylose, representing 86,27% of its hemicellulosic fraction. The acid hydrolysis was carried out using an experimental design 24-1 aiming at it the xylose concentration (g/L) response on the hemicellulosic hydrolysate regarding the factors: time, temperature, acid solution concentration and the ratio solid:liquid. The best result for the xylose concentration has been found on the center point conditions, with concentration of 31,70 g/L. The analysis of variance was carried out to one screening of the design and it was observed that only the parameters temperature and acid solution concentration has been significant at 95% reliable level. After that acid hydrolysis assays has been carried regarding the factors temperature and acid solution concentration aiming the acid hydrolysis optimization. The optimum point conditions were 130 ºC and the sulfuric acid solution of 2,9% m/v, carried with the ratio solid:liquid of 1:4 (g/mL) at 30 minutes of reaction. Later, fermentation assays was carried out with the hemicellulosic hydrolysate obtained in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of hydrolysate to evaluate the hydrolysate fermentability obtained as well tha needless of nutritional supplementation and for it used an experimental design 23 of face centered to verify the influence of the factors: urea concentration, MgSO4*7H2O concentration and yeast extract concentration. Assays has been carried at 30 ºC and 200 rpm. It was verified that the yeast extract (5 g/L) exerts greater influence on the fermentation and the MgSO4*7H2O (0,5 g/L) did not present statistic significance. The best conditions were achieved using yeast extract (5 g/L), urea (5 g/L) and MgSO4*7H2O (0,5 g/L). with ethanol yield and volumetric productivity of 0,38 g/g and 0,41 g/L.h, respectively, after 60 hours of fermentation.

Atualmente, a bioprodução de etanol a partir de materiais lignocelulósicos como o bagaço de cana é de grande interesse nacional e cientifico. Para utilização destes materiais em processos biotecnológicos procedeu-se sua hidrólise em função de sua constituição complexa em celulose, hemicelulose e lignina. Após hidrólise ácida branda obteve-se um hidrolisado hemicelulósico rico em xilose e outros açúcares juntamente com compostos tóxicos a atividade microbiana como ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos. Este trabalho avaliou a necessidade da suplementação nutricional bem como a concentração inicial de xilose e células no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar sobre os parâmetros fermentativos de sua bioconversão a etanol pela levedura Pichia stipitis UFMG-IMH 43.2. Os ensaios foram realizados de acordo com um planejamento fatorial completo 23 com face centrada tendo como resposta o fator de conversão de açúcares em etanol (YP/S). Na suplementação do hidrolisado avaliou-se a adição dos seguintes nutrientes: MgSO4 (0 a 1,0 g/L), extrato de levedura (0 a 5,0 g/L) e uréia (0 a 5,0 g/L). Neste estudo observou-se que o extrato de levedura (5,0 g/L) exerceu maior influência sobre o processo fermentativo alcançando máximos valores de YP/S (0,13 g/L) e produtividade volumétrica em etanol (0,07 g/L.h) não necessitando da adição dos demais nutrientes. Ao se avaliar a concentração inicial de xilose (30; 52,5; 75 g/L) bem como a concentração celular inicial (0,5; 1,0; 2,0 g/L) no hidrolisado observou-se uma melhoria significativa no valor de YP/S (0,19 g/g) utilizando máxima concentração celular inicial (2 g/L) associada com menor concentração de xilose inicial (30 g/L). Estes resultados indicaram que a levedura Pichia stipitis UFMG-IMH 43.2 favoreceu a conversão em etanol YP/S (0,19 g/g), mostrando que a levedura teve melhor comportamento a baixas concentrações de xilose. Este estudo demonstrou que a levedura P. stipitis UFMG-IMH 43.2 mostrou-se como uma alternativa viável para a produção de bioetanol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. / Currently, ethanol bioproduction from lignocellulosic materials such as sugarcane bagasse is of great national and scientific interest. For utilization of these materials in biotechnological processes according mild acid hydrolysis is required to complex constitution of cellulose, hemicellulose and lignin. After mild acid hydrolysis, a hemicellulosic hydrolyzate rich in xylose and other sugars together with toxic compounds to microbial activity as acetic acid, furfural, hydroxymethylfurfural and phenolics was obtained. The studies on the hydrolysate supplementation evaluated the nutrients addition: MgSO4 (0 to 1.0 g/L), yeast extract (0 to 5.0 g/L) and urea (0 to 5.0 g/L) and effects of initial xylose and cell concentration for ethanol production by Pichia stipitis UFMG-IMH 43.2 yeast were evaluated. The experiments were performed according to factorial design central composite face centered 23 using YP/S as response factor. This study showed that only the addition of 5.0 g/L yeast extract was enough to obtained YP/S equal to 0.13 g/L and productivity of 0.07 g/L-h. The evaluation of initial xylose concentration (30; 52,5; 75 g/L) and initial cell concentration (0,5; 1,0; 2;0 g/L) showed a significant influence on fermentation parameter YP/S. The best conditions were achieved using initial cell concentration of 2.0 g/L and initial xylose concentration of 30 g/L with YP/S equal to 0.19 g/g, showing that this yeast strain had better performance at low xylose concentrations. This study demonstrated that P. stipitis UFMG-IMH 43.2 yeast was a promising alternative for bioethanol production from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da suplementação do meio de fermentação com diferentes fontes de nitrogênio e avaliar estratégias de aclimatação da levedura Pichia stipitis ao hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz visando melhorar a produção de etanol. Em uma primeira etapa do trabalho foram realizados estudos em meio semissintético para avaliar o efeito das fontes de nitrogênio arginina, ácido glutâmico, uréia e fosfato de amônio sobre a produção de etanol por P. stipitis. Os resultados em meio semissintético demonstraram que o meio composto por ácido glutâmico, fosfato de amônio e extrato de levedura nas concentrações de 3 g/L proporcionou os melhores resultados de conversão (YP/S = 0,36 g/g) e produtividade (QP = 0,71 g/L.h). O estudo de suplementação nutricional do hidrolisado mostrou que o crescimento de P. stipitis foi inibido pela suplementação com ácido glutâmico, e que a presença de extrato de levedura e fosfato de amônio não apresentou qualquer efeito sobre a produção de etanol, sendo o hidrolisado hemicelulósico capaz de suprir a necessidade nutricional da levedura, dispensando a sua suplementação para o uso como meio de fermentação. Na etapa de aclimatação da levedura P. stipitis ao hidrolisado, foram avaliadas cinco estratégias (A, B, C, D e E), baseadas em transferências sucessivas de células para meios com concentrações crescentes de hidrolisado, 45, 60 e 75 % (v/v). Durante a estratégia de aclimatação A foi possível isolar uma colônia (A75-2) capaz de fermentar em hidrolisado contendo 70 g/L de xilose, alcançando valores dos parâmetros YP/S (0,35 g/g) e QP (0,23 g/L.h), 10 e 28 % superiores, respectivamente, aos obtidos pela cepa original. Os resultados das estratégias B e C mostraram que mesmo empregando um maior número de transferências, assim como a utilização de elevadas concentrações celulares, não foram capazes de contribuir com o processo de aclimatação. Na avaliação das estratégias D e E, verificou-se que o emprego de condições de maiores níveis de fornecimento de oxigênio durante as etapas de transferências sucessivas propiciaram condições mais adequadas para que a levedura superasse os efeitos de inibição ocasionados pelos compostos tóxicos presentes no hidrolisado. A estratégia E, realizada sob condição de maior aeração, apresentou os melhores resultados dentre as estratégias de aclimatação avaliadas, sendo obtida uma produção de 27 g/L de etanol após 72 horas. Além disso, esta estratégia foi a única em que a levedura foi capaz de manter os valores de YP/S (0,33 g/g) e QP (0,35 g/L.h) durante todas as transferências, indicando uma maior aclimatação ao hidrolisado. Na fermentação em biorreator, o emprego de inóculo proveniente de cultivo sucessivo de células, quando comparado à fermentação realizada sem cultivo sucessivo, proporcionou um aumento de 7 e 50% sobre os valores de YP/S e QP, respectivamente. Com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que estratégias de aclimatação da levedura P. stipitis em hidrolisado não destoxificado são métodos eficazes para a superação de inúmeros problemas relativos às condições de stress fisiológico e inibição do metabolismo microbiano. Porém, a resposta fisiológica da levedura P. stipitis é dependente do número de transferências, concentração celular e oxigenação do meio. / In this work, different acclimatization strategies employing the yeast Pichia stipitis on rice straw hemicellulosic hydrolysate with high xylose concentration were evaluated. Initially, the effects of nitrogen sources supplementation in the semisynthetic and hydrolysate medium on P.stipitis fermentation were studied. The results showed that in semisynthetic medium the addition of glutamic acid, ammonium phosphate and yeast extract at concentrations of 3 g/L provided the best conversion (YP/S = 0.36 g/g) and productivity (QP = 0.71 g/L.h). On the other hand, the hydrolysate supplementation with yeast extract and ammonium phosphate did not show effect on the fermentative parameters, whereas glutamic acid supplementation inhibited completely the cellular growth. These results show that the hemicellulosic hydrolysate can be used as a fermentation medium without any nutritional supplementation. To overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present on rice straw hemicellulosic hydrolysate, five acclimatization strategies (A, B, C, D and E) were performed by sequentially transferring of the cells in hydrolysate containing increasing concentrations (45, 60 and 75% (v/v). During the strategy A was possible isolate a colony (A75-2) with ability to ferment the hydrolysate containing xylose at 70 g/L (YP/S = 0.35 g/g and QP =0.23 g/L.h), which corresponded to increase of 10 and 28%, respectively, as compared to the values obtained by the original strain. Employing a greater number of transfers, as well as the use of high cell concentrations (strategies B and C) was not possible improve to the acclimatization process. Regarding the strategy E, which employed higher levels of oxygen supply during periods of successive transfers, showed the most appropriate for the yeast overcome the effects of inhibition caused by toxic compounds present in the hydrolysate. With this strategy the best results (27 g/L ethanol after 72 hours) among all assessed, were observed. Moreover, this approach was the only in which the yeast was able to keep the values of YP/S (0.33 g/g) and QP (0.35 g/L.h) for all transfers, indicating greater acclimatization to hydrolysate. By using this strategy in bioreactor fermentation, it was obtained an increase of 7 and 50% on the values of YP/S and QP, respectively, in relation the reference fermentation (without successive transfer). It is possible conclude that acclimatization strategies of the yeast P. stipitis in no detoxified hydrolysate are effective methods to overcome numerous problems concerning the physiological stress and inhibition of microbial metabolism. However, the physiological response of yeast is dependent on the transfers number, cell concentration and oxygenation level of the medium.

No presente trabalho foram estudados a necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para bioconversão a etanol pela levedura Pichia stipitis, e os efeitos da agitação e da razão Vfrasco/Vmeio, em frascos agitados, sobre os parâmetros fermentativos deste processo. Os estudos da suplementação do hidrolisado para produção de etanol por bioconversão pela levedura Pichia stipitis avaliou a adição dos nutrientes: uréia ( 0 a 2,3 g/L) MgSO4.7H2O (0 a 1,0 g/L) e extrato de levedura (0 a 3,0 g/L). Este estudo mostrou que apenas a adição 3 g/L de extrato de levedura foi necessária para que o processo alcançasse bons resultados de conversão (YP/S = 0,29 g/g) e produtividade em etanol (QP = 0,24 g/L.h) não necessitando portanto da adição dos demais nutrientes. Comparado com o meio suplementado com todos os nutrientes, a suplementação com apenas 3 g/L de extrato de levedura, levou a um aumento de 14% na produtividade do processo. A avaliação da oxigenação em frascos agitados mostrou que a aeração foi um fator capaz de influenciar fortemente os parâmetros de fermentação (YP/S e QP). A condição de maior aeração favoreceu a produção de células e a condição de menor aeração favoreceu a conversão em etanol, porém com baixa produtividade, sendo a produtividade em etanol favorecida por condições intermediárias de aeração, correspondente a agitação de 200 rpm e a razão Vfrasco/Vmeio de 2,5, onde foram alcançadas conversão em produto (YP/S) e produtividade em etanol (QP) de 0,36 g/g e 0,39 g/L.h, respectivamente, o que representa um aumento de cerca de 63% a produtividade e 24% a conversão em etanol, quando comparado com as condições de aeração utilizadas anteriormente. A cinética de fermentação de Pichia stipitis no hidrolisado empregando as condições de suplementação nutricional e aeração otimizadas mostrou que a máxima concentração de etanol alcançada para o hidrolisado suplementado foi cerca de 23,6 g/L após 48 horas, consumindo neste tempo 86 % dos açúcares presentes no meio. Comportamento semelhante foi observado para o meio sintético, onde, no mesmo tempo, a máxima concentração de etanol foi de 24,4 g/L, porém com completo consumo dos açúcares. / The present work studied the necessity of nutritional supplementation of rice straw hemicellulosic hydrolysate for ethanol bioconversion by Pichia stipitis, and the aeration (effects of agitation and Vflask/Vmedium ratio) in agitated flasks, on the fermentative parameters of the process. The studies on the hydrolysate supplementation for ethanol production by Pichia stipitis yeast bioconversion evaluated the nutrients addition: urea (0 to 2.3 g/L), MgSO47H2O (0 to 10 g/L) and yeast extract (0 to 3.0 g/L). This study showed that only the addition of 3g/L yeast extract was enough to obtain good results for ethanol conversion (YP/S = 0.29 g/g) and productivity (QP = 0.24 g/L.h). By comparing to the medium supplemented with all the nutrients, the supplementation with only 3 g/L yeast extract increased 14% the process productivity. The evaluation of the oxygenation in agitated flasks showed that the aeration highly influenced the fermentative parameters (YP/S and QP). The condition of higher aeration favored the cells production and the condition of lower aeration favored the ethanol conversion, but with low productivity. The ethanol productivity was favored by intermediary conditions of aeration, correspondent to 200 rpm agitation and 2.5 Vflask/Vmedium ratio, thus obtaining 0.36 g/g product conversion (YP/S) and 0.39 g/L.h ethanol productivity (QP). This means an increase of approximately 63% productivity and 24% ethanol conversion, when compared to the aeration conditions previously used. The kinetics of Pichia stipitis fermentation in the hydrolysate using the optimized conditions of nutritional supplementation and aeration rate showed that the maximum ethanol concentration for the supplemented hydrolysate was about 23.6 g/L after 48h, consuming 86% sugars present in the medium. Similar behavior was observed for the synthetic medium where, with the same time, the maximum ethanol concentration was 24.4 g/L, but with the complete sugars consumption.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle_ Camargo.pdf: 2743019 bytes, checksum: bb99b3949e2803b846be4f0bae327172 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / Ethanol is considered a promising alternative to fossil fuels and causes less environmental impact, which implies an increase in the consumption of biofuel. To meet this demand, research has been conducted with alternative raw materials to complement the production of first generation ethanol. In Brazil, sweet sorghum is being studied for the expansion of sugarcane industry due to its rapid growth and the possibility of cultivating it during the season-cropping of sugarcane. However, during processing of sweet sorghum for ethanol production, generation of bagasse occurs, a material composed primarily of cellulose and hemicellulose, which can be considered a potential source of feedstock for bioprocesses. Therefore, the purpose of this study was the use of the sugars from the hemicellulose and the cellulosic fractions of the sweet sorghum bagasse, for the production of second generation ethanol by pentoses and hexoses fermentation yeasts, respectively. After chemical characterization of sorghum bagasse of six cultivars, they were subjected to mild acid hydrolysis with variations in temperature (111; 115 °C and 121), time (40, 50, and 60 min) and concentration of sulfuric acid (075; 1.25 and 1.75% w/v) using a central composite design (DCC) and response surface to find the condition that is conducive to high concentrations of sugars and less toxic compounds in the hemicellulosic hydrolysate. After the hydrolysate was concentrated and detoxified, it was submitted to fermentation by the yeast Schefferosomyces stipitis in a bioreactor at 30 °C, with kLa 4.9 h-1, pH 5.5 and volume of 4.5 liters. The solid biomass (cellulignin) that resulted from the acid treatment was submitted to evaluation of the percentage of cellulose, hemicellulose and lignin and then to studies with variation in the concentration of NaOH (1; 2.5 to 4%) and time (20, 40 and 60 min). After the treatment with the best condition of removal of lignin, cellulosic biomass was subjected to enzymatic hydrolysis with variation in the concentration of cellulase NS22086 (15, 20 and 25 FPU/g) and β-glucosidase NS22118 (1/3 to 2/3) and temperature of 38; 41 to 44 °C, in order to obtain the best saccharification rates and high glucose concentrations. The production of ethanol from the cellulosic fraction was then carried out with Kluyveromyces marxianus, during simultaneous saccharification and fermentation (SSF) at three different temperatures (38, 41 and 44 °C) for fermentation. The chemical composition between different varieties studied was similar and varied from 22-26% of lignin, from 30-32% of hemicellulose and 32-37% of cellulose. In the study of the hydrolysis conditions of hemicellulose, it was found that the acid concentration was the most important factor, and the condition that resulted in the highest concentration of sugars (14.22 g/L xylose and 2.42 g/L glucose) was 1.75% H2SO4, 40 minutes and 121 °C. This same condition showed low quantities of toxic compounds (1.34 g/L of acetic acid, 0.90 g/L of phenol; 124.54 mg/L of hydroxymethylfurfural and 978 mg/L furfural). The production of ethanol by S. stiptis in the hemicellulosic hydrolysate resulted in a concentration of 22 g/L ethanol, Yp/s of 0.40 g/g; Yx/s 0.28 g/g and Qp of 0.34 g/L.h-1. For the study of cellulignin delignification it was found that 2.5% NaOH for 60 minutes was the best condition for the removal of lignin (68%). During the enzymatic hydrolysis of the cellulosic portion, it was verified that the increase of cellulase from15 to 25 FPU/g resulted in higher concentration of glucose. In addition, the increase of β-glucosidase also resulted in the largest amount of glucose in a shorter time. The temperature also increased and accelerated the process of saccharification of cellulose. The simultaneous saccharification fermentation with K. marxianus was shown to be affected by the temperature studied, and the maximum ethanol concentration was reached (9.41 g/L) after 72 hours at 41 °C. With these results, it was possible to consider that the bagasse of sweet sorghum is a promising material in the field of second generation ethanol production both from hemicellulose and cellulose. / O etanol é considerado uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis, o que implica no aumento do consumo deste biocombustível. Para suprir essa demanda, pesquisas têm sido realizadas com matérias primas alternativas para complementar a produção de etanol de primeira geração. No Brasil, o sorgo sacarino está sendo estudado para ampliação do setor sucroenergético por ter crescimento rápido e possibilidade de cultivo na entressafra da cana-de-açúcar. Porém, durante o processamento do sorgo sacarino ocorre a geração do bagaço como material excedente, que é constituído principalmente por celulose e hemicelulose, e que pode ser considerado matéria-prima em potencial para bioprocessos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar o aproveitamento dos açúcares das frações hemicelulósica e celulósica do bagaço de sorgo sacarino para produção de etanol de segunda geração por leveduras fermentadoras de pentoses e hexoses, respectivamente. Após a caracterização química do bagaço de sorgo, este foi avaliado através de estudo de delineamento composto central (DCC) e superfície de resposta à hidrólise ácida branda com variações na temperatura (111; 115 e 121 °C), tempo (40; 50 e 60 min) e concentração de ácido sulfúrico (0,75; 1,25 e 1,75% m/v) a fim de encontrar a condição que propiciasse altas concentrações de açúcares e menores de compostos tóxicos no hidrolisado hemicelulósico. Após o hidrolisado ser concentrado e destoxificado, seguiu para fermentação pela levedura Schefferosomyces stipitis em biorreator a 30 °C, com kLa de 4,9 h-1, pH 5,5 e volume de 4,5 litros. A biomassa sólida (celulignina) resultante do tratamento ácido foi submetida à avaliação da porcentagem de celulose, hemicelulose e lignina e seguiu para estudo da deslignificação com variação na concentração de NaOH (1; 2,5 e 4%) e tempo (20, 40 e 60 min). Após tratamento com a melhor condição de remoção da lignina, a biomassa foi submetida à hidrólise enzimática com variação na concentração de celulase NS22086 (15; 20 e 25 FPU/g) e de β-glicosidase NS22118 (1/3 a 2/3) e temperatura (38; 41 e 44 °C), a fim de obter as melhores taxas de sacarificação e altas concentrações de glicose. A produção de etanol a partir da fração celulósica foi então realizada com Kluyveromyces marxianus durante sacarificação simultânea à fermentação (SSF) em três diferentes temperaturas (38; 41 e 44 °C) de incubação. A composição química do bagaço variou entre 22-26% de lignina, 30-32% de hemicelulose e 32-37% de celulose. A concentração de ácido sulfúrico foi o fator que teve maior influência na formação de açúcares e hidrólise da hemicelulose e a condição que resultou na maior concentração de açúcares (14,22 g/L de xilose e 2,42 g/L de glicose) foi 1,75% de H2SO4, 40 minutos a 121 °C. Essa mesma condição apresentou baixas quantidades de compostos tóxicos (1,34 g/L de ácido acético, 0,90 g/L de fenólicos; 124,54 mg/L de hidroximetilfurfural e 978 mg/L de furfural). A produção de etanol por S. stiptis no hidrolisado hemicelulósico resultou em uma concentração de 22 g/L de etanol, Yp/s de 0,40 g/g; Yx/s de 0,28 g/g e Qp de 0,34 g/L.h-1. No estudo de deslignificação da celulignina foi verificado que 2,5% de NaOH, 121 0C por 60 minutos foi a melhor condição na remoção de lignina (68%). Durante a hidrólise enzimática da porção celulósica foi verificado que o aumento da concentração da celulase de 15 para 25 FPU/g resultou na maior concentração de glicose. Além disso, o aumento da β-glicosidase diminui o tempo de hidrólise e o aumento da temperatura favoreceu o processo de sacarificação da celulose. A sacarificação simultânea à fermentação com K. marxianus demonstrou ser afetada pela temperatura estudada e a máxima concentração de etanol foi alcançada (9,41 g/L) com 72 horas a 41 °C. Com esses resultados, é possível considerar que o bagaço do sorgo sacarino é uma matéria prima promissora na produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:46:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lillian Leonel.pdf: 1330884 bytes, checksum: 72d7ed478436a2a5c72fa3f74e8d44d4 (MD5) Previous issue date: 2014-03-18 / To supply the increasing demand for bioethanol it is necessary to search for new sources of renewable raw materials and emerging technologies. Most studies have been directed to the cellulose, since this fraction is more abundant in biomass and its hydrolysis leads to glucose, a more easily metabolizable sugar for the commercially available yeasts. Considering that the hemicellulose represents 20-30% of plant biomass and is easily removable, either by acid or enzymatic hydrolysis, the use of this fraction by pentose-fermenting yeasts as Scheffersomyces (Pichia) stipitis has been promising. However, the process of hydrolysis of lignocellulosic biomass to the release of fermentable sugars, specifically the acid hydrolysis, generates toxic compounds that impair the microbial metabolism and ethanol production. Thus, it is important to know the different effects of the major inhibitors present in hemicellulosic hydrolysates in the metabolism of S. stipitis ATCC 58376. For this purpose the culture was performed in synthetic medium supplemented with different concentrations of the inhibitors furfural, HMF, acetic acid, syringic acid and vanillin, following the Plackett and Burman factorial design with 12 assays (7 assays more compared to the number of independent variables) and 4 assays at the central point, totalizing 16 assays. The assays were conducted under agitation of 200 rpm at 30 °C and pH 5.25 for 96 hours. The analysis of the kinetic profiles obtained showed that the consumption of sugars, cell growth and ethanol production by S. stipitis were adversely affected by the addition of inhibitor compounds in synthetic medium promoting the inhibition of cell growth and ethanol production, as well as the delay in the consumption of sugars (xylose and glucose) according to the concentrations of the inhibitors tested. However, the acetic acid concentration of 2.0 g / L favored S. stipitis metabolism in the assays 09 (furfural 0.025 g.L-1; HMF: 0.01 g.L-1; acetic acid: 2.0 g.L-1, vanillin: 0.09 g.L-1 and syringic acid: 0.75 g.L-1), 10 (furfural: 0.75 g.L-1 HMF: 0,01 g.L-1; vanillin: 0.09 g.L-1 and syringic acid: 0.75 g.L-1) and 02 (furfural: 0.75 g.L-1; HMF: 0.03 g.L-1; acetic acid 2.0 g.L-1; vanillin: 0.09 g.L-1 and syringic acid: 0.025 g L-1), with peak concentrations of ethanol obtained in 72 hours of 14.3 g.L-1, 12.43 g.L-1 and 10.75 g.L-1, respectively, higher than the control assay (10.05 g.L-1), that lacked inhibitors. In assays with 6.0 g.L-1 of acetic acid, the metabolism of the yeast was completely inhibited. Statistical analysis for cell growth response showed that only acetic acid was significant (p < 0.10), being the most potent inhibitor. The others inhibitors also showed negative effect, except for syringic acid, which had a positive effect at 72 and 96 hours, but were not statistically significant. For the response ethanol production, among the factors evaluated, only the effect of furfural was not significant (p> 0.10). The most potent inhibitors were acetic acid and HMF, while vanillin and syringic acid promoted a positive effect on ethanol production. These results contribute to the choice of an appropriate method of detoxification for hemicellulosic hydrolyzate, which aims for a greater removal of the compounds that actually affect the metabolism of S. stipitis ATCC 58376 / Para suprir a demanda crescente de bioetanol há necessidade de buscar novas fontes de matérias-primas renováveis e tecnologias emergentes. A maior parte dos estudos tem sido direcionada à celulose, visto que esta fração é mais abundante na biomassa e sua hidrólise resulta em glicose, açúcar mais facilmente metabolizável por leveduras comercialmente disponíveis. Considerando que a hemicelulose representa 20-30% da biomassa vegetal e é facilmente extraível, seja por hidrólise ácida ou enzimática, a utilização desta fração por leveduras fermentadoras de pentoses, como Scheffersomyces (Pichia) stipitis, tem se mostrado promissora. No entanto, o processo de hidrólise da biomassa lignocelulósica para liberação dos açúcares fermentescíveis, em específico a hidrólise ácida, gera compostos tóxicos que prejudicam o metabolismo microbiano e a produção de etanol. Assim, é importante o conhecimento dos efeitos distintos dos principais inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos no metabolismo de S. stipitis ATCC 58376. Para isso foram realizados cultivos em meio sintético, adicionado de diferentes concentrações dos inibidores furfural, HMF, ácido acético, ácido siríngico e vanilina, seguindo o planejamento fatorial Plackett e Burman com 12 ensaios (7 ensaios a mais em relação ao número de variáveis independentes) e 4 ensaios no ponto central, totalizando 16 ensaios. Os ensaios foram conduzidos sob agitação de 200 rpm, temperatura de 30 °C e pH inicial 5,25 por 96 horas. A análise dos perfis cinéticos obtidos mostrou que o consumo de açúcares, o crescimento celular e a produção de etanol por S. stipitis foram afetados negativamente pela adição de compostos inibidores em meio sintético, promovendo a inibição do crescimento celular e produção de etanol, bem como o retardo no consumo de açúcares (glicose e xilose) de acordo com as concentrações dos inibidores testadas. No entanto, o ácido acético em concentração de 2,0 g/L favoreceu o metabolismo de S. stipitis, nos ensaios 09 (furfural: 0,025 g.L-1; HMF: 0,01 g.L-1; ácido acético 2,0 g.L-1; vanilina: 0,09 g.L-1 e ácido siríngico: 0,75 g.L-1), 10 (furfural: 0,75 g.L-1; HMF: 0,01 g.L-1; ácido acético 2,0 g.L-1; vanilina: 0,09 g.L-1 e ácido siríngico: 0,75 g.L-1) e 02 (furfural: 0,75 g.L-1; HMF: 0,03 g.L-1; ácido acético 2,0 g.L-1; vanilina: 0,09 g.L-1 e ácido siríngico: 0,025 g.L-1), sendo as máximas concentrações de etanol obtidas em 72 horas de 14,3 g.L-1, 12,43 g.L-1 e 10,75 g.L-1,respectivamente, sendo valores superiores ao ensaio controle (10,05 g.L-1), que não possuía inibidores. Nos testes com 6,0 g.L-1 de ácido acético, o metabolismo da levedura foi completamente inibido. A análise estatística para a resposta crescimento celular mostrou que somente o ácido acético foi significativo (p<0,10), mostrando-se o mais potente inibidor. Os demais inibidores também apresentaram efeito negativo, exceto o ácido siríngico, que apresentou efeito positivo em 72 e 96 horas, porém não foram estatisticamente significativos. Para a resposta produção de etanol, entre os fatores avaliados, somente o efeito do furfural não foi significativo (p>0,10). Os mais potentes inibidores foram o ácido acético e o HMF, enquanto vanilina e ácido siríngico promoveram um efeito positivo na produção de etanol. Esses resultados contribuem para a escolha de um método de destoxificação adequado para o hidrolisado hemicelulósico, que vise uma maior remoção dos compostos que realmente afetam o metabolismo de S. stipitis ATCC 58376