Made available in DSpace on 2014-06-12T16:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2152_1.pdf: 961505 bytes, checksum: 26d85508cf7925585f4303ac19a413e7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Streptomyces endofíticos de plantas medicinais vem contribuindo de maneira significativa como uma fonte promissora para descoberta de novos metabólitos bioativos. Este trabalho teve como objetivo selecionar o melhor meio de cultura e tempo de produção de metabólitos secundários bioativos, visando seu isolamento. Foram utilizados na fermentação cinco diferentes meios de cultura, que através do teste de difusão em disco para Bacillus subtilis ATCC 6633 mostraram boa atividade antimicrobiana. A massa celular foi extraída com solventes polares, sendo o extrato etanólico o que apresentou maior halo de inibição, quando comparado aos extratos dos líquidos metabólicos. O extrato etanólico foi submetido à coluna cromatográfica de sílica gel, seguida da purificação da fração ativa por cromatografia em placas preparativas, originando quatro novas frações, das quais apenas a fração A4 apresentou halo de inibição para bactérias Gram-positivas. Desta fração foi determinada a CMI e o melhor resultado obtido foi para Micrococcus luteus ATCC 2225 <12,5 &#956;g/mL. O espectro infravermelho desta fração mostrou a presença de grupos característicos de anima primária alifática, grupos alquila e cetona

Orientadores: Helia Harumi Sato , Lara Durães Sette / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_JulianaAlves_D.pdf: 1354680 bytes, checksum: f0751667b78c8b7e3db22d9ceb16adbf (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A transglutaminase (TGase) (EC 2.3.2.13; proteina-glutamina ?-glutaminiltransferase) é uma enzima capaz de catalisar reações de transferência de grupos acil utilizando resíduos de glutamina das ligações peptídicas de proteínas como doadores de grupos acil, e diversas aminas primárias como receptores. As ligações covalentes cruzadas entre inúmeras proteínas e peptídeos pela transglutaminase promovem mudanças nas propriedades de proteínas de alimentos. Por essa razão, a transglutaminase é amplamente utilizada nas indústrias de processamento de alimentos para o desenvolvimento de novos produtos e modificação de características como: viscosidade, capacidade emulsificante e valores nutricionais. Uma cepa de Actinomyceto, isolada de amostras de solo brasileiro, foi investigada taxonomicamente por uma combinação de técnicas moleculares e morfológicas, resultando na conclusão de que a cepa pertence ao gênero Streptomyces sp. A cepa, chamada de Streptomyces sp. CBMAI 837 produziu transglutaminase quando cultivada a 30°C por cinco dias, em agitador rotatório, no meio de fermentação otimizado, composto por: 0,2% KH2PO4, 0,1% MgSO4.7H2O, 2% farinha de soja, 2% amido de batata, 0,2% glicose, e 2% peptona, atingindo uma atividade enzimática de 1,37 U.mL-1. A transglutaminase foi purificada cerca de 5 vezes através de duas passagens cromatográficas sucessivas em uma coluna de filtração em gel Sephadex G-75, com 17% de recuperação. A purificação da proteína foi comprovada por homogeneidade eletroforética em SDS-PAGE. A massa molar da TGase foi estimada em cerca de 45 kDa. A transglutaminase de Streptomyces sp CBMAI 837, tanto na forma bruta quanto purificada, apresentou atividade enzimática ótima em pH 6,0-6,5, e em 35-40°C. Um segundo pico de atividade ótima foi observado em pH 10,0 na enzima no estado bruto. Ambas as formas da enzima foram estáveis na faixa de pH de 4,5 a 8,0 e até 45°C. A transglutaminase na forma bruta e purificada mostrou-se independente de íons cálcio, mas foi ativada na presença de K+, Ba2+, e Co2+; e inibida por Cu2+ e Hg2; o que sugere a presença de um grupo tiol no sítio ativo da enzima. A TGase purificada apresentou um Km de 6,37 mM e um Vmax de 1,70 U/mL, enquanto a enzima bruta apresentou Km de 6,52 mM e um Vmax de 1,35 U/mL para o substrato N-carbobenzoxi-L-glutaminil-glicina. A influência da transglutaminase de Streptomyces sp CBMAI 837 bruta, nas propriedades de géis ácidos de caseinato de sódio foi investigada, tendo como parâmetro géis preparados com a TGase comercial (Ajinomoto Inc.). Os géis com a enzima comercial tiveram um valor de módulo de elasticidade maior, porém, dependendo da concentração de proteína, estes foram menos deformáveis. Os géis com enzima bruta de Streptomyces sp. CBMAI 837 se mostraram muito mais rígidos e menos elásticos. Resultados da eletroforese indicaram que a enzima comercial promoveu a formação de polímeros de proteínas de massa molecular mais alta do que a enzima de Streptomyces sp. CBMAI 837. Os testes de microscopia eletrônica de varredura e da capacidade de retenção de água mostraram que características particulares de cada um dos géis poderiam estar associadas ao tipo específico de interação promovida por cada uma das amostras enzimáticas testadas / Abstract: Transglutaminase (EC 2.3.2.13; protein-glutamine ?-glutaminyltransferase) is an enzyme that catalysis an acyl transfer reaction using protein or peptide-bond glutamine residues as acyl donors and several primary amines as receptors. The covalent cross-links between a number of proteins and peptides introduced by transglutaminase promote modification of the functional properties of the food proteins. Therefore, transglutaminase are widely used by food-processing industries for the purpose of new product development, modification of the product properties such as viscosity, emulsification foaming and nutritional values. An actinomycete strain, isolated from Brazilian soil, was taxonomically investigated using a combination of molecular and morphological basedmethods, resulting on the conclusion that the strain belongs to the genus Streptomyces sp. The strain, named Streptomyces sp. CBMAI 837, produce transglutaminase when cultivated at 30°C for 5 days at 200 rpm in a rotatory shaker, on the optimized fermentation medium composed of 0.2% KH2PO4, 0.1% MgSO4.7H2O, 2% soybean flour, 2% potato starch, 0.2% glucose, and 2% peptone, with a enzymatic activity of 1.37 U.mL-1. The enzyme purification was performed by of two successive chromatographies on Sephadex G-75 columns with yields of 48% and 17%, respectively. The protein purification was successfully achieved to electrophoretical homogeneity on SDS-PAGE. The molecular mass of the MTGase was estimated to be about 45 kDa. The enzyme from Streptomyces sp., in both crude and pure forms, exhibited optimal activity in the 6.0-6.5 pH range and at 35-40°C. A second maximum of activity was observed at pH 10.0 on the crude Streptomyces sp. enzyme. Both forms of transglutaminase were stable over the pH range from 4.5 to 8.0 and up to 45°C. The activities of all the TGase samples were independent of Ca+2 concentration, but they were elevated in the presence of K+, Ba2+, and Co2+ and inhibited by Cu2+ and Hg2+, which suggests the presence of a thiol group in the TGase¿s active site. The purified enzyme presented Km of 6.37 mM and Vmax of 1.7 U/mL, while the crude enzyme demonstrated Km of 6.52 mM and Vmax of 1.35 U/mL. The influence of the transglutaminase on acid-gel properties was studied. Texture parameters showed that the commercial TGase (Ajinomoto Inc.) gels had greater values of elasticity modulus and could promote the formation of more elastic and soft food systems, while addition of the crude TGase of Streptomyces sp. CBMAI 837 to the gel led to the formation of more rigid and less elastic gels. The electrophoresis showed that the commercial TG enzyme in this system promoted higher molecular mass protein polymers than the enzyme from Streptomyces sp. CBMAI 837. Microscopy and water holding capacity (WHC) observations showed that all the gel characteristics could be associated to specific interactions promoted by each TGase tested / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T14:43:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Janaina Melo.pdf: 5414983 bytes, checksum: a963ac9ef063b643800d3cd3356538ea (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Janaina Melo.pdf: 5414983 bytes, checksum: a963ac9ef063b643800d3cd3356538ea (MD5) Previous issue date: 2013-07-05 / CNPq / Endofíticos são micro-organismos que colonizam o interior das plantas sem aparentemente causar danos ao seu hospedeiro, sendo encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes. Em geral produzem metabólitos secundários de interesse farmacológicos, como também aplicáveis no controle biológico de pragas e doenças. O presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade biológica e a caracterização química dos metabólitos secundários do Streptomyces sp. UFPEDA 3345 endofítico isolado de folhas de Momordica charantia L.. A fermentação em cultivo submerso desta linhagem apresentou como melhores condições para produção de metabólitos bioativos o meio M1 com 72 horas de cultivo em pH alcalino. Os extratos acetoetílico do líquido metabólico (EBLM) e o metanólico da biomassa (EBB) foram submetidos aos ensaios de citotoxicidade frente a células tumorais, à avaliação do potencial hemolítico em eritrócitos de camundongos, toxicidade aguda, determinação da concentração mínima inibitória (CMI) e à prospecção química. O extrato metanólico da biomassa (EBB) foi cromatografado em coluna de sílica gel e a fração F4 foi analisada através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) resultando na obtenção de três subfrações C1, C2 e C3. Para a atividade citotóxica frente às linhagens HT-29 (carcinoma de cólon), HEp-2 (carcinoma de laringe), NCI-H292 (carcinoma de pulmão) e MCF-7 (carcinoma de mama) na dose única de 50 μg/mL, os extratos, frações e subfrações apresentaram percentual de inibição do crescimento celular entre 17 e 93%. Após a administração da dose de 2.000 mg/kg do extrato EBB em camundongos, não foram observados efeitos tóxicos, sinais visíveis de toxicidade sistêmica e morte dos animais. Quanto ao potencial hemolítico dos extratos, estes apresentaram concentração efetiva de CE50 > 500 μg/mL e não promoveram danos à membrana eritrocitária. As amostras apresentaram atividade antimicrobiana para bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, bactéria álcool ácido resistente, fungo filamentoso, leveduras e fitopátogenos. O extrato EBLM apresentou valores de CMI menores para B. subtilis (15,62 μg/mL), M. luteus (7,8 μg/mL) e M. smegmatis (15,62 μg/mL) em comparação ao extrato EBB. A CMI para A. niger, C. albicans e C. krusei os valores variaram de 15,62 a 250 μg/mL. A fração F4 e a subfração C1 apresentaram valores de CMI iguais de 62,5 μg/mL para C. albicans, A. niger e M. smegmatis. Quanto aos valores de CMI dos extratos EBLM e EBB frente a fungos e bactérias fitopatogênicos variaram entre 15,62 a 500 μg/mL. A prospecção química demonstrou a presença de açúcares redutores, compostos fenólicos, mono/sesquiterpenos, triterpenos e esteróides. Os resultados evidenciam que a linhagem endofítica Streptomyces sp. UFPEDA 3345 produz diferentes biomoléculas com diversas atividades biológicas.

Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_RicardoRodriguesde_M.pdf: 1621799 bytes, checksum: 14182717e9ba5de8c1d5014f330c1b6c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Transglutaminase é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações cruzadas intra- e intermoleculares entre proteínas, peptídeos e aminas primárias por meio de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina. Desta forma, transglutaminase pode ser utilizada em diversos setores industriais para o desenvolvimento de novos produtos ou para a modificação de suas características. A linhagem B6 isolada de amostra de solo coletada na região do Estado de Minas Gerais foi identificada como tendo características morfológicas típicas de actinomicetos e pela análise da região 16S rRNA há colocou na subclasse Streptomyces próximo a linhagem Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. A fim de aumentar a produção de transglutaminase (2,75 U/mL) pela linhagem Streptomyces sp. B6, o meio de fermentação foi submetido a processos de otimização. Como primeiro passo da otimização, o crescimento do micro-organismo e a produção da enzima foram estudados através de uma pré-seleção de fontes de carbono, nitrogênio e sais no meio de produção. Após as análises das diferentes fontes, um delineamento experimental do tipo Plackett-Burman foi utilizado para a seleção dos componentes do meio de cultivo que afetam a produção de transglutaminase. Os resultados do delineamento experimental indicaram que a produção de transglutaminase foi influenciada negativamente pela peptona bacteriológica e MgSO4.7H2O, positivamente pelo amido de batata, glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O e não foi influenciada pelo farelo de soja, considerando um nível de confiança de 95%. A concentração de amido de batata foi fixada no maior nível testado no planejamento Plackett-Burman devido à gelificação do meio de fermentação em concentrações maiores. Assim, os três fatores que influenciaram a produção de transglutaminase (glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O) foram otimizados para obter o máximo de produção da enzima utilizando delineamento composto central. Sob a condição otimizada, a qual continha 25 g/L de farinha de soja, 35 g/L de amido de batata, 5 g/L de glicose, 24,5 g/L de peptona de caseína e 8 g/L de KH2PO4.7H2O, a atividade enzimática atingiu 6,13 U/mL, apresentando 125% à mais de atividade em relação á obtida no meio antes da otimização. A transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. B6 exibiu atividade ótima em 45°C e em pH de 6,5 e 11,0. A enzima manteve-se estável na faixa de pH 3,0-11,0 durante 60 minutos à 40°C durante 3 horas. A transglutaminase não foi inibida por Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cisteína e glutationa na concentração de 5 mM, mas foi inibida na presença de Hg2+, Cu2+, Zn2+ e Fe2+ na concentração de 5mM. A linhagem Streptomyces sp. B6 é uma nova fonte de transglutaminase com características interessantes para aplicações biotecnológicas / Abstract: Transglutaminase is an enzyme capable of catalyzing the forming intra-and intermolecular cross-linking between proteins, peptides and primary amines by covalent bonds between lysine and glutamine residues. Thus, transglutaminase can be used in food processing industries to develop new products and modify their characteristics. The B6 strain was isolated from soil sample collected in the region state of Minas Gerais was identified as having morphological characteristics typical of the actinomycetes, and the 16S rRNA analysis placed it in the Streptomyces subclade, closely related to Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. In order to increase the transglutaminase production (2.75 U/mL) from Streptomyces sp. B6 strain, the fermentation medium was subjected to optimization processes. In the first step of optimization, the micro-organism growth and enzyme production were studied through a pre-selection of carbon, nitrogen and salts sources in the culture medium. After analysis of different sources, the Plackett¿Burman experimental design was used for screening the components of the culture medium that affect the transglutaminase production. Results of the experiment indicated that production of transglutaminase was negatively influenced by bacteriological peptone and MgSO4.7H2O, positively influenced by potato starch, glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O and was not influenced by soybean meal, considering 95% of confidence level. The potato starch concentration was fixed at the highest level tested in Plackett¿Burman design due to gelation of the fermentation medium in higher concentrations. Thus, the three factors that influence the transglutaminase production (glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O concentrations) were optimized to obtain the maximum transglutaminase production using central composite design. Under the proposed optimized condition, which contained 25 g/L soybean meal, 35 g/L potato starch, 5 g/L glucose, 24.5 g/L casein peptone and 8 g/L KH2PO4.7H2O, the enzyme activity reached 6.13 U/mL, which was 125% more than the activity in relative obtained medium before optimization. The microbial transglutaminase produced by Streptomyces sp. B6 strain exhibited optimal activity at 45 oC and at pH 6.5 and 11.0. The enzyme remained stable in the pH range from 3.0 - 11.0 for 60 minutes and at 40 oC temperature for 3 hours. The transglutaminase was not inhibited by Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cysteine and glutathione in concentration 5 mM, but was inhibited in the presence of Hg2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ in concentration 5 mM. In conclusion, Streptomyces sp. B6 strain is a new source of transglutaminase with interesting features for biotechnological applications / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Este trabalho descreve o estudo quÃmico e biolÃgico dos extratos das bactÃrias marinhas Pseudoalteromonas sp., Micromonospora sp., Streptomyces sp. e Kocuria sp., visando o isolamento e a elucidaÃÃo estrutural de novos constituintes bioativos. A investigaÃÃo quÃmica realizada com a bactÃria Pseudoalteromonas sp. resultou no isolamento de um pigmento vermelho identificado como prodigiosina e de dois Ãcidos biliares conhecidos como Ãcido desoxicÃlico e Ãcido cÃlico. A prodigiosina foi testada frente a quatro linhagens de cÃlulas tumorais e apresentou valores de IC50 semelhantes ao padrÃo positivo. O estudo quÃmico de Micromonospora sp. resultou no isolamento de quatro novas antraciclinonas: 4,6,11-triidroxi-9-propriltetraceno-5,12-diona; 4-metoxi-9-propiltetraceno-6,11-diona; 7,8,9,10-tetraidro-9-hidroxi-4-metoxi-9-propiltetra-ceno-6,11-diona e 10&#946;-metoxicarbonil-7,8,9,10-tetraidro-4,6,7&#945;,9&#945;,11âpentaidroxiâ9âpropil-tetraceno-5,12-diona. Esses compostos foram avaliados quanto a sua atividade anti-tumoral frente a linhagem celular HCT-8, dois dos quais mostraram citotoxidade moderada com valores de IC50 de 12,74 e 6,18 &#61549;M. O estudo da bactÃria Streptomyces sp. possibilitou o isolamento de uma ditiolpirrolidina cuja estrutura foi estabelecida como 5-oxo-6-(N-metilformamida)-4,5- diidro-1,2-ditiol[4,3-b]pirrol. Esse metabÃlito teve sua atividade citotÃxica testada frente a seis linhagens celulares tumorais, mostrando forte atividade com IC50 de 1,66, 1,05 e 1,52 ÂM para as linhagens de prÃstata metastÃtica, carcinoma de ovÃrio e glioblastoma, respectivamente. O estudo de Kocuria sp. resultou no isolamento de um novo peptÃdeo denominado como kocurina. Esse composto teve sua atividade antimicrobiana testada frente a vÃrias bactÃrias e fungos patogÃnicos, incluindo cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) e cepas de Staphylococcus aureus resistentes a tiazomicina. Kocurina inibiu fortemente o crescimento de MRSA MB5393 com valores de CIM de 0,25Âg/mL, alÃm de exibir atividade antibacteriana contra as bactÃrias Bacillus subtilis e Enterococcus faecium. As estruturas de todos os compostos isolados neste trabalho foram determinadas empregando mÃtodos espectroscÃpicos tais como RMN 1H e 13C (1D e 2D), espectrometria de massas e infravermelho. / This work describe the chemical and biological investigation of the extracts from the marine bacterias Pseudoalteromonas sp., Micromonospora sp., Streptomyces sp. and Kocuria sp., aiming the isolation and structural elucidation of new bioactive constituents. The chemical investigation carried out with the bacteria Pseudoalteromonas sp. lead to the isolation a red pigment identified as prodigiosin and two bile acids derivatives known as deoxycholic acid and cholic acid. The prodigiosin was evaluated against four tumor cell lines showing IC50 values similar to the positive control doxorubicin. The chemical study of Micromonospora sp. Resulted in the isolation of four new anthracyclinones designed as 4,6,11-trihydroxy-9-propryltetracene-5,12-dione; 4-methoxy-9-propyltetracene-6,11-dione; 7,8,9,10 - tetrahydro-9-hydroxy-4-methoxy-9-propiltetra-cene-6,11-dione and 10&#946;-Carbomethoxy-7,8,9,10-tetrahydro-4,6,7&#945;,9&#945;,11-pentahydroxy-9-propyltetracene-5,12-dione . The cytotoxic potential of these compounds were evaluated against HCT-8cell line, two of which showed moderate cytotoxicity with IC50 values of 12.74 and 6.18 M, respectively. From Streptomyces sp. strain was isolated a ditiolpyrrolidin, established as 5-oxo-6-(N-methylformamide) -4,5 - dihydro-1,2-dithiol [4,3-b] pyrrole. This secondary metabolite was tested against six tumor cell lines, shown IC50 values of 1.66, 1.05 and 1.52 mM for the metastatic prostate lines, ovarium carcinoma and glioblastoma, respectively. The study of Kocuria sp. lead to the isolation of a new peptide, which was designed as kocurin. This compound was subjected to the tested its antimicrobial assays against several pathogens bacteria and fungal including Staphylococcus aureus strains methicillin resistant (MRSA) and Staphylococcus aureus strains tiazomicin resistant. Kocurin was strongly active against MRSA MB5393 exhibiting a MIC of 0,25Âg/mL, moreover showed antibacterial activity against Bacillus subtilis and Enterococcus faecium. The structures of all isolated compounds in this work were stabilized employing spectroscopic methods such as 1H and 13C NMR (1D and 2D), mass spectrometry and infrared.

Actinomycetes and fungi were successfully isolated from both New Zealand and Malaysian marine invertebrates and classified as facultatively marine based on their ability to grow on both sea water and non-sea water media. Most of the extracts obtained from selected isolates were cytotoxic. A clear preference of the actinomycetes for solid-state fermentation was observed, however, for fungi no significant preference was seen. Three isolates of Streptomyces spp., four Penicillium spp. and two Paecilomyces spp. whose extracts showed good cytotoxicity were selected for further investigation. A small-scale extract obtained from a solid culture of Streptomyces sp. (LA3L2) showed good cytotoxicity and a new cytotoxic metabolite was isolated from a large-scale extract of Streptomyces sp. (LA3L2). This metabolite was characterized as S-methyl 2,4-dihydroxy-6-isopropyl-3,5-dimethylbenzothioate (5.15) and is only the third compound reported to contain the S-methyl benzothioate group. Two known compounds, montagnetol (5.16) and erythrin (5.18), were isolated from a further large-scale cultivation of Streptomyces sp. (LA3L2) and is the first reported actinomycete to produce these lichen-related compounds. In addition, two known inactive metabolites (bohemamine (5.1) and bohemamine B (5.2)) were identified from the small-scale extract. Streptomyces sp. (LA3L2) was also investigated for the effect of temperature and salinity on growth and cytotoxicity and shown to produce bohemamine only at 20 - 28℃ and 4% sea salt concentration on solid media. This isolate gave a low yield of active metabolite under all conditions. Small-scale extracts of two other Streptomyces spp. yielded three known cytotoxic metabolites. These were thiazostatin B (7.14) from Streptomyces sp. (LA5L4) and chromomycin A2 (7.1), chromomycin A3 (7.2) and chromomycin 02-3D (7.3) from Streptomyces sp. (LA3L1). All four Penicillium spp. produced known metabolites. Penicillium sp. (LY1L5) yielded two known metabolites, cycloaspeptide A (7.4) and α-cyclopiazonic acid (7.5). α-Cyclopiazonic acid (7.5) and three other known metabolites (roquefortine A (7.6), cyclopeptin (7.7) and viridicatin (7.8)) were isolated from Penicillum sp. (KK3T23). Penicillium sp. (KK3T8) produced brefeldin A (7.10), while mycophenolic acid (7.12) and brevianamide A (7.11) were produced by Penicillium sp. (KK4T14b). The effect of salinity on growth and cytotoxicity was investigated for the two Penicillium isolates producing the cytotoxic metabolite, α-cyclopiazonic acid (7.5). Saline conditions were not required for growth but metabolite production differed between the two isolates with respect to salinity. Isolate LY1L5 required saline conditions for α-cyclopiazonic production whereas isolate KK3T23 produced the metabolite under non-saline conditions and in concentrations of sea salt up to 6%. Three known compounds, indole-3-carboxylic acid (7.15), indole-3-carboxylate (7.17) and 5-carboxymellein (7.16) were identified from Paecilomyces sp. (PR5L9). Investigation of a small-scale extract obtained from a solid culture of another Paecilomyces sp. (PR10T2) resulted in the isolation and characterization of a unique structure of a symmetrical cyclic depsipeptide, epi-angolide (NAM 6-1). NAM 6-1 was considered as a new compound based on four homoisomeric configurations (A1, A2, A3 and A4). The value of dereplication procedures with respect to the rapid identification of metabolites and enhancement of in-house metabolite libraries is discussed. Structural elucidation of nine known metabolites (7.1, 7.2, 7.3, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.10 and 7.11) was greatly aided by the in-house dereplication techniques using LC-MS-UV and AntiMarin database. A significant advantage was gained by the use of the CapNMR which enabled NMR characterization of very small quantities of metabolites (<20 µg). Approximately <5 µg of materials were required to perform 1D proton NMR experiments for the dereplication of seven known compounds; bohemamine (5.1), bohemamine B (5.2), thiazostatin B (7.14), indole-3-carboxylate (7.17) and 5-carboxymellein (7.16). Approximately 20 µg of materials were needed to acquire 1D and 2D (HSQC, HMBC and NOE) NMR spectra for structural elucidation of the new metabolite, S-methyl 2,4-dihydroxy-6-isopropyl-3,5-dimethylbenzothioate (5.15). Some 8 µg of materials were sufficient to perform 1D and 2D (COSY, HSQC and HMBC) NMR experiments for complete structural characterization of two known metabolites, montagnetol (5.16) and erythrin (5.18). Approximately 10 µg of materials were needed to acquire 1D and 2D NMR (COSY, HSQC and HMBC) experiments for structural elucidation of the new compound, epi-angolide NAM 6-1 (A1, A2, A3 and A4). Rapid identification of known fungal metabolites enabled the in-house HPLC-UV/Rt library to be enhanced by eight metabolites (7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.10, 7.11, 7.17 and 7.16). An HPLC-UV/Rt library for actinomycete metabolites was successfully established with the insertion of eight known metabolites (5.1, 5.2, 5.16, 5.18, 7.1, 7.2, 7.3 and 7.14).

Actinomycetes and fungi were successfully isolated from both New Zealand and Malaysian marine invertebrates and classified as facultatively marine based on their ability to grow on both sea water and non-sea water media. Most of the extracts obtained from selected isolates were cytotoxic. A clear preference of the actinomycetes for solid-state fermentation was observed, however, for fungi no significant preference was seen. Three isolates of Streptomyces spp., four Penicillium spp. and two Paecilomyces spp. whose extracts showed good cytotoxicity were selected for further investigation. A small-scale extract obtained from a solid culture of Streptomyces sp. (LA3L2) showed good cytotoxicity and a new cytotoxic metabolite was isolated from a large-scale extract of Streptomyces sp. (LA3L2). This metabolite was characterized as S-methyl 2,4-dihydroxy-6-isopropyl-3,5-dimethylbenzothioate (5.15) and is only the third compound reported to contain the S-methyl benzothioate group. Two known compounds, montagnetol (5.16) and erythrin (5.18), were isolated from a further large-scale cultivation of Streptomyces sp. (LA3L2) and is the first reported actinomycete to produce these lichen-related compounds. In addition, two known inactive metabolites (bohemamine (5.1) and bohemamine B (5.2)) were identified from the small-scale extract. Streptomyces sp. (LA3L2) was also investigated for the effect of temperature and salinity on growth and cytotoxicity and shown to produce bohemamine only at 20 - 28℃ and 4% sea salt concentration on solid media. This isolate gave a low yield of active metabolite under all conditions. Small-scale extracts of two other Streptomyces spp. yielded three known cytotoxic metabolites. These were thiazostatin B (7.14) from Streptomyces sp. (LA5L4) and chromomycin A2 (7.1), chromomycin A3 (7.2) and chromomycin 02-3D (7.3) from Streptomyces sp. (LA3L1). All four Penicillium spp. produced known metabolites. Penicillium sp. (LY1L5) yielded two known metabolites, cycloaspeptide A (7.4) and α-cyclopiazonic acid (7.5). α-Cyclopiazonic acid (7.5) and three other known metabolites (roquefortine A (7.6), cyclopeptin (7.7) and viridicatin (7.8)) were isolated from Penicillum sp. (KK3T23). Penicillium sp. (KK3T8) produced brefeldin A (7.10), while mycophenolic acid (7.12) and brevianamide A (7.11) were produced by Penicillium sp. (KK4T14b). The effect of salinity on growth and cytotoxicity was investigated for the two Penicillium isolates producing the cytotoxic metabolite, α-cyclopiazonic acid (7.5). Saline conditions were not required for growth but metabolite production differed between the two isolates with respect to salinity. Isolate LY1L5 required saline conditions for α-cyclopiazonic production whereas isolate KK3T23 produced the metabolite under non-saline conditions and in concentrations of sea salt up to 6%. Three known compounds, indole-3-carboxylic acid (7.15), indole-3-carboxylate (7.17) and 5-carboxymellein (7.16) were identified from Paecilomyces sp. (PR5L9). Investigation of a small-scale extract obtained from a solid culture of another Paecilomyces sp. (PR10T2) resulted in the isolation and characterization of a unique structure of a symmetrical cyclic depsipeptide, epi-angolide (NAM 6-1). NAM 6-1 was considered as a new compound based on four homoisomeric configurations (A1, A2, A3 and A4). The value of dereplication procedures with respect to the rapid identification of metabolites and enhancement of in-house metabolite libraries is discussed. Structural elucidation of nine known metabolites (7.1, 7.2, 7.3, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.10 and 7.11) was greatly aided by the in-house dereplication techniques using LC-MS-UV and AntiMarin database. A significant advantage was gained by the use of the CapNMR which enabled NMR characterization of very small quantities of metabolites (<20 µg). Approximately <5 µg of materials were required to perform 1D proton NMR experiments for the dereplication of seven known compounds; bohemamine (5.1), bohemamine B (5.2), thiazostatin B (7.14), indole-3-carboxylate (7.17) and 5-carboxymellein (7.16). Approximately 20 µg of materials were needed to acquire 1D and 2D (HSQC, HMBC and NOE) NMR spectra for structural elucidation of the new metabolite, S-methyl 2,4-dihydroxy-6-isopropyl-3,5-dimethylbenzothioate (5.15). Some 8 µg of materials were sufficient to perform 1D and 2D (COSY, HSQC and HMBC) NMR experiments for complete structural characterization of two known metabolites, montagnetol (5.16) and erythrin (5.18). Approximately 10 µg of materials were needed to acquire 1D and 2D NMR (COSY, HSQC and HMBC) experiments for structural elucidation of the new compound, epi-angolide NAM 6-1 (A1, A2, A3 and A4). Rapid identification of known fungal metabolites enabled the in-house HPLC-UV/Rt library to be enhanced by eight metabolites (7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.10, 7.11, 7.17 and 7.16). An HPLC-UV/Rt library for actinomycete metabolites was successfully established with the insertion of eight known metabolites (5.1, 5.2, 5.16, 5.18, 7.1, 7.2, 7.3 and 7.14).

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cÃncer à caracterizado por ser um conjunto de doenÃas que envolve crescimento descontrolado, surgimento e espalhamento de cÃlulas anormais, e à considerada uma das principais causa de morte por doenÃa no mundo. AscÃdias e microorganismos marinhos sÃo profÃcuos produtores de substÃncias com atividade citotÃxica e antitumoral. Estudos preliminares com a ascÃdia Eudistoma vannamei, endÃmica do nordeste brasileiro, identificaram uma potente atividade anticÃncer de seu extrato e, a partir dele, isolaram-se esteuroporinas inÃditas. Curiosamente, tais molÃculas sÃo comumente produzidas por bactÃrias. No presente trabalho, os extratos dos microorganismos isolados da ascÃdia foram testados quanto a sua citotoxicidade e o mais potente deles foi selecionado e indentificado como actinomiceto pertencente ao gÃnero Streptomyces sp. A partir da purificaÃÃo desse extrato, foi isolada uma ditiolpirrolona citotÃxica que apresentou valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃdia variando de 1,05 a 6,39 &#956;M, em diferentes linhagens tumorais. Estudos realizados em cÃlulas de carcinoma prostÃtico humano metastÃtico indicaram que a ditiolpirrolona causou despolarizaÃÃo mitocondrial e induziu o aparecimento de figuras mitÃticas, apÃs 24 e 48 horas de tratamento. AlÃm disso, detectou-se alteraÃÃo no ciclo celular, como atraso nas fases final do ciclo, S e G2/M. A ditiolpirrolona alterou a expressÃo de algumas proteinas relacionadas ao ciclo celular e principalmente à citocinese, como Prc1, Plk-1 e RhoA, tais proteÃnas estÃo diretamente envolvidas com a formaÃÃo do anel contrÃtil, imprescindÃvel para a conclusÃo da divisÃo celular / Ascidians and marine microorganisms are prolific producers of cytotoxic and antitumor compounds. As part of a study to examine Brazilian species, we examined microbiota associated with ascidian, Eudistoma vannamei as potential sources for active natural product leads Earlier revisions with this specie showed a potent anticanceractivity of its extract; and two unpublished staurosporines were isolated. Curiously, these classes of compounds are generally produced by bacteria. So, in order to evaluate the biomedical potential of these compounds the microbiota associated to the ascidian Eudistoma vannamei was investigated. From this effort we isolated a number of bacterial strains and after screening for cytotoxicity using a panel of tumor cell lines, we identified a Streptomyces sp.,that presented significant bioactivity. Using bioactivity fractionation, we identified the active compound as, dithiolopyrrolone N-(4,5-dihydro-5-oxo-1,2- dithiolo[4,3-b]pyrrol-6-yl)-N-methyl-formamide also know as VD846. The compound presented IC50 values ranging from 1.1 to 6.4 &#956;M across a panel of cell lines. Further biological studies, indicated that this compound induced cell cycle arrest during mitosis, an observation that was confirmed by evaluating the effects on a series of cell lines using mitotic index analyses, flow cytometry, and confocal microscope. Western blot analyses indicated that cells treated with VD846 resulted in reduced expression of Plk1 and RhoA, proteins that are necessary for cleavage furrow assembly and exit from cytokinesis.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:11:22Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vanessa Couto - CCB.pdf: 1379075 bytes, checksum: 22dec4476e89d6b363739f14fc25766e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T13:11:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Vanessa Couto - CCB.pdf: 1379075 bytes, checksum: 22dec4476e89d6b363739f14fc25766e (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE / O gênero Streptomyces produz cerca de 70% dos antibióticos de origem natural utilizados na prática médica. Com o advento e ampla utilização dos antibióticos β-lactâmicos no tratamento de infecções bacterianas, logo surgiram cepas resistentes a estes fármacos, sendo um dos principais mecanismos de resistência microbiana a produção de enzimas β-lactamases, capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico do antibiótico tornando a droga inativa. Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases produzido por espécies de actinobactérias do gênero Streptomyces em processos fermentativos. O sucesso de tais processos depende, sobretudo, dos substratos e dos nutrientes fornecidos ao micro-organismo no meio de cultivo. Em fermentações extrativas, são adicionados ao meio de cultivo os sistemas de duas fases aquosas (SDFA) compostos por polímero/sal que propiciam uma simultânea produção e recuperação da biomolécula de interesse. Neste contexto, torna-se fundamental a investigação de compostos com atividade antimicrobiana de fontes diversas e, o presente trabalho teve como objetivo produzir e recuperar AC por processo de fermentação em frascos agitados através de fermentação extrativa por Streptomyces sp. DPUA 1542 isolado de liquens da Região Amazônica. A linhagem de Streptomyces sp. foi inicialmente cultivada com farinha de soja (20 g/L), extrato de soja (20 g/L) e milhocina (20 g/L) como fontes de nitrogênio (FN) e glicerol (10 g/L) como fonte de carbono (FC) em agitação orbital de 250 rpm em cultivo submerso por 144 horas a 28ºC. Sendo a melhor produção de AC verificada com o uso de farinha de soja, foi realizada uma segunda fermentação utilizando um planejamento fatorial 23 com quatro pontos centrais a fim de avaliar a influência das variáveis independentes concentração de farinha de soja - FN (10, 20, 30 g/L), concentração de glicerol - FC (5, 10 e 15 g/L) e pH (6,3, 6,8 e 7,4) na produção da biomolécula . A mais alta produção de AC (63,93 mg/L) ocorreu em 96 horas de cultivo no ensaio do planejamento fatorial que utilizou pH 6,3 e as maiores concentrações de farinha de soja e glicerol, 30 e 15 g/L, respectivamente. Em adição, foi realizado um ensaio para atividade antimicrobiana da linhagem de Streptomyces frente Staphylococcus aureus multirresistente, sendo evidenciado halo de inibição de 33 mm de diâmetro. As melhores condições definidas no primeiro planejamento fatorial foram empregadas em um planejamento fatorial subseqüente 23 com quatro pontos centrais que avaliou a simultânea produção e extração da molécula de AC em fermentação extrativa com SDFA – Polietilenoglicol (PEG)/sais fosfatos – integrado ao meio de cultura. As variáveis independentes testadas foram massa molar do PEG (MPEG 400, 1.000 e 8.000 g/mol), concentração de PEG (CPEG 15, 20 e 25 m/m%) e concentração dos sais fosfatos (CSAL 15, 20 e 25 m/m%). As maiores concentrações de AC foram obtidas nos ensaios 3 e 5, respectivamente, na fase rica em sal (69,56 mg/L) com as condições (MPEG 400 g/mol; CPEG 25 m/m% e CSAL 15 m/m%) e na fase PEG (54,88 mg/L) nas condições (MPEG 400 g/mol; CPEG 15 m/m% e CSAL 25 m/m%) em 120 horas de cultivo. Os maiores valores do coeficiente de partição (K=3,27) e rendimento (Y=63,2%), foram obtidos no ensaio 5, indicando que o AC particionou, sobretudo, para a fase superior rica em PEG, e ficou concentrada em maior quantidade em percentual. Pelos resultados demonstrados, Streptomyces sp. DPUA 1542 apresentou efetiva produção de AC utilizando como FN e FC, farinha de soja e glicerol, respectivamente, além de ter apresentado atividade biológica contra bactéria patogênica. A produção e simultânea purificação de AC por fermentação extrativa nas condições testadas pode representar uma alternativa promissora para o emprego em processos de produção do inibidor de β-lactamases a nível comercial.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-30Bitstream added on 2014-06-13T20:06:05Z : No. of bitstreams: 1 bernardo_era_dr_botfca.pdf: 350867 bytes, checksum: 5ac2bf8356b892e6a8597025678f2c2e (MD5) / O Brasil é o maior produtor de laranja e o maior exportador mundial de suco concentrado. A pinta preta dos citros, causada por Guignardia citricarpa, é uma doença de grande importância econômica, principalmente para o Estado de São Paulo. O interesse no controle biológico de fitopatógenos, como alternativa de controle e como forma de reduzir os problemas ocasionados pelo uso intensivo de fungicidas, tem levado ao desenvolvimento de técnicas alternativas para uma agricultura mais sustentável. O trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de agentes de controle biológico (Bacillus subtilis e Trichoderma harzianum) e produtos alternativos (biofertilizantes e leite) no controle da pinta preta dos frutos cítricos em cultivos convencional e orgânico. Além disso, foi avaliado o efeito de Bacillus subtilis, Paenibacillus lentimorbus e Streptomyces sp. no controle de G. citricarpa e Penicillium digitatum em pós-colheita. Os experimentos em campo foram realizados em pomar de laranja`Valência´ e `Pêra´, localizadas nos municípios de Conchal e Santa Eudóxia, SP, respectivamente. Em cultivo convencional de `Valência´ foram avaliados dois biofertilizantes (Microgeo® e Bio2), nas safras 2003/2004 e 2004/2005, com 15 repetições por tratamento, sendo uma planta por repetição. As árvores foram pulverizadas em intervalos de 28 dias, sendo o início em 08/12/03, para a safra 2003/2004 e 08/11/2004, para a safra 2004/2005. Na safra 2003/2004 as concentrações utilizadas do biofertilizante Microgeo® foram 0; 10; 20; 30 e 40%. Na safra 2004/2005 foram repetidos os mesmos tratamentos dasafra anterior e incluído tratamento com o biofertilizante Bio2 nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%. Para as avaliações foram utilizadas uma escala de notas de 1=0,5% a 6=49% da área do fruto atacada. Os biofertilizantes apresentaram comportamento... / Brazil is the worldwide biggest producer and exporter of orange and orange juice. The citrus black spot (CBS), caused by Guignardia citricarpa, is a disease of great economic importance, mainly for the São Paulo State. The interest in biological control of plant pathogens, as mitigation of the problems caused by intensive use of fungicides, has led to development of alternative techniques for a more sustainable agriculture. The objective of this work was to evaluate the effects of biocontrol agents (Bacillus subtilis and Trichoderma sp.) and other biocompatible products (cow milk and biofertilizers) for managing CBS in organic and conventional systems. Besides, the effect of B. subtilis, Paenibacillus lentimorbus and Streptomyces sp. for control of G. citricarpa and Penicillium digitatum, in post-harvest was also evaluated. The filed experiments were carried through in trees of `Valencia' and `Pera´, located in Conchal and Santa Eudóxia, SP, respectively. In `Valencia´ conventional system were evaluated two biofertilizers (Microgeo® and Bio2). The experiments were conducted at harvests 2003/2004 and 2004/2005. The trees were sprayed in 28 days intervals, and the first was in 08 December 2003 in 2003/2004 harvest, and 08 November 2004 in 2004/2005 harvest.