La salinité du sol affecte la croissance des plantes glycophytes telle que Arabidopsis thaliana et le riz. Chez les plantes vasculaires, les racines sont composées de divers types de cellules organisées en cercles concentriques. Chaque type de cellules racinaires possède une fonction biologique spécifique et coordonnée avec les autres cellules qui composent cette même racine. Il est probable que la réponse des gènes au stress salin soit spécifique du type cellulaire, ce qui ne peut être révélé par des études à l'échelle de l'organe entier. Afin d'étudier les réponses spécifiques, notre approche a été de générer des profils de transcriptome pour deux types de cellules racinaires chez les plantes modèles, Arabidopsis et riz. Les deux types de cellules étudiées ont été choisis en raison de leur rôle possible soit dans le stockage du sodium dans les cellules corticales, soit dans son transport dans les cellules du péricycle chez Arabidopsis ou du cylindre central chez le riz. Des plantes exprimant la protéine fluorescente verte (GF) spécifiquement dans un type de cellule racinaire furent utilisées pour cette analyse. Les cellules ont donc pu être isolées chez le riz et Arabidopsis grâce à la technique de cytométrie en flux.L'analyse du transcriptome des cellules du péricycle et du cylindre central montrent que les cellules corticales sont plus réactives au stress salin et qu'une large majorité des gènes est sous–exprimée chez les deux plantes modèles. D'après les analyses d'expression des cellules du cortex d'Arabidopsis, trois voies métaboliques sont significativement sous-exprimées en réponse au stress salin: la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes, le transport de l'eau and le métabolisme secondaire. La régulation de gènes impliqués dans le transport de l'eau et des nutriments démontre l'importance des cellules corticales dans le mouvement des solutés. Chez le riz, les profils des deux types cellulaires étudiés révèlent une forte réaction de défense ; en effet le métabolisme protéique et la régulation de la transcription sont fortement sous-exprimés dans les cellules corticales alors que les cellules du cylindre central modifient et activent les gènes correspondant à divers catégories fonctionnelles telles que la réplication de l'ADN et le transport. Des gènes candidats ont été sélectionnés dans les deux types cellulaires d'Arabidopsis. Des lignées mutantes n'exprimant pas ces gènes ont été testées en stress salin dans des conditions hydroponiques. Les résultats ont révélé un phénotype accumulant moins de sodium dans les parties aériennes (20% par rapport au génotype sauvage) pour certaines de ces lignées mutantes. Ce travail est la première étude de transcriptome utilisant des types spécifiques de cellules racinaires chez le riz. L'identification de gènes et voies métaboliques répondant au stress salin dans le cortex et le cylindre central de la racine ouvre de nouveaux axes de recherche et va permettre d'élucider la complexité des processus biologiques d'adaptation au stress salin. / Soil salinity reduces the growth of glycophytic plants such as Arabidopsis thaliana and rice. In vascular plants, roots are organized into concentric layers of cells and each layer has a specific biological function coordinated with other cell types in the root. Therefore, genes differentially expressed in response to a salt stress are also likely to be changing only in specific cell types, and thus may not be revealed at the organ level. In order to identify novel salt-responsive genes, cell-type specific transcriptomic approaches were undertaken in Arabidopsis thaliana and rice, with application of physiologically reasonable salt stress (50mM) over 48 hours. Two cell-types from the root were chosen in both species for their potential role in salt storage and transport: cortical and pericycle/stelar cells respectively. Cell-types of interest expressing specifically Green Fluorescent Protein (GFP) were isolated from the rest of the root using fluorescence-activated cell sorting (FACS).The outer layer of the root was found to be responding more than the inner part of the root after 48 hours of salt stress, with an overall down-regulation in both rice and Arabidopsis. Arabidopsis cortical cells responding to salt seem to regulate the cell wall biosynthesis, which may modulate the shape of the cells or alter the apoplastic movements of solutes in response to salt. Genes related to transport were affected by salt in Arabidopsis, with the crucial role of cortical cells in the movement of solutes being evident. Rice cortical cells respond to salt by showing a more extreme defence reaction in changing the protein metabolism and the regulation of transcription. The response of the inner part of the rice root to 48 hours of mild salt stress showed up-regulation of genes implicated in broader functional categories. The biological relevance of genes revealed using cell-type specific transcriptomics was demonstrated in a salt assay using knock-out (KO) lines of candidate genes from both cell-types in Arabidopsis thaliana. Three KO mutant lines showed 20% reduction in shoot sodium after 5 weeks of salt stress and were also able to maintain a higher shoot dry weight. These transcriptomic studies of isolated stelar and cortical cells in response to a mild salt stress have revealed salt responsive genes and pathways, indicating new areas for further study, and contributing to our understanding of the complex responses of plants to their environment at the cellular level.

Les systèmes de sécrétion de NO3– de la membrane plasmique des cellules végétales jouent un rôle important dans l'activité stomatique et la réponse des plantes à des stress biotiques et abiotiques. Malgré quelques avancées récentes, ces systèmes restent mal connus sur le plan moléculaire. Mon travail de thèse a consisté à caractériser le rôle physiologique de NAXT2, un membre du sous-groupe NAXT (NitrAte eXcretion Transporter) de la famille des transporteurs NRT1/PTR chez Arabidopsis thaliana. Mes résultats montrent que NAXT2 est un transporteur de NO3– et qu'il est principalement exprimé dans les cellules du péricycle de la racine, au voisinage des vaisseaux xylémiens. Sous contrainte saline et comparativement aux plantes sauvages (WT), un mutant knock-out pour NAXT2 (naxt2-1) présente un défaut de distribution du NO3– vers les feuilles et de sécrétion du NO3– dans la sève xylémienne, qui se traduisent par une diminution des teneurs en NO3– foliaires. NAXT2 est donc impliqué dans la charge du xylème en NO3– sous contrainte saline. Aucune des différences phénotypiques mises en évidence entre le mutant et WT sous contrainte saline n'a été observée sous stress osmotique ou en condition standard, suggérant que NAXT2 est essentiellement impliqué dans la réponse à la composante ionique du stress salin. Enfin, après un traitement salin prolongé, la biomasse foliaire de naxt2-1 est inférieure à celle de WT, ce qui indique que NAXT2 joue un rôle important dans l'adaptation des plantes aux contraintes salines modérées. Dans l'ensemble, ce travail suggère que NAXT2 est impliqué dans une fonction physiologique majeure, la translocation du NO3–, point de contrôle de la distribution du nitrate, et dans l'adaptation de la plante aux contraintes salines. / NO3– secretion systems at the plasma membrane of plant cells play an important role in stomata activity and plant response to biotic and abiotic stresses. Despite of few recent advances, these systems are still poorly known at the molecular level. During my thesis, I worked on the characterization of the physiological role of NAXT2, a member of the NAXT (NitrAte eXcretion Transporter) sub-group from the large NRT1/PTR transporters family in Arabidopsis thaliana. The results presented here show that NAXT2 is a NO3– transporter and that it is mainly expressed in root pericycle cells, close to the xylem vessels. Under salinity constraint and relatively to wild type plants (WT), a NAXT2 knock-out mutant (naxt2-1) displayed a defect in NO3– distribution towards the shoots and in NO3– secretion into the xylem sap, which lead to a decrease in shoot NO3– content. Thus, NAXT2 is involved in NO3– xylem loading under salinity constraint. None of the phenotypic differences described in this work between WT and mutant was observed under osmotic stress or standard culture conditions, suggesting that NAXT2 is specifically involved in response to the ionic component of salt stress. Finally, after a prolonged salt treatment, naxt2-1 shoot biomass was lower than that of WT, indicating that NAXT2 plays an important role in plant adaptation to mild salinity constraint. Altogether, this work suggests that NAXT2 is involved in a major physiological function, the NO3– translocation, control point of nitrate distribution and in plant adaptation to salinity constraint.

Le remodelage de la chromatine et la modification des histones jouent des rôles très importants dans l’établissement et la reprogrammation de l’état de l’expression génique. Il reste largement inconnu concernant les mécanismes de la régulation de ces processus chromatiniens dans le contrôle de l’expression génique impliquée dans le développement de la plante et son adaptation à l’environnement. Mon sujet de thèse se focalise sur l’analyse fonctionnelle d’un facteur de remodelage de la chromatine de type Chromodomain/Hélicase/DNA-binding 1 (CHD1) d’Arabidopsis, appelé CHR5 et une histone démethylase qui est spécifiquement impliquée dans la démethylation de l’histone H3 lysine 4 (H3K4), appelée JMJ15. Dans la première partie de cette étude, nous avons montré que le gène CHR5 est activé au cours de l’embryogénèse et que son expression se maintient élevé dans les tissues/organes en développement. L’analyse de mutants révèle que la perte de fonction de ce gène fait réprimer l’expression de gènes régulateurs de la maturation de l’embryon tels que LEC1, ABI3 et FUS3 pendant le développement des graines, et fait baisser l’accumulation des protéines de réserve. L’analyse de double mutants a permis de démontrer une fonction antagoniste entre CHR5 et PKL, une protéine du groupe « CHD3 », dans l’activité du promoteur de gènes régulateurs du développement de l’embryon et l’accumulation de réserve de graine. Nous avons montré que la protéine CHR5 s’associe directement avec les promoteurs d’ABI3 et FUS3 et que la mutation du gène CHR5 conduit à l’augmentation de présence de nucléosome dans la région du départ de transcription. Ces résultats suggèrent que CHR5 est impliquée dans le positionnement de nucléosome pour stimuler l’expression de gènes de la maturation de l’embryon, ce qui est contrebalancé par l’action de PKL au cours du développement de l’embryon. La deuxième partie de cette étude a permis de montrer que l’expression du gène de l’histone démethylase JMJ15 manifeste une forte spécificité tissulaire. L’analyse de mutants du gène a permis de l’identification de 2 allèles de gain de fonction (avec surexpression du gène), et un allèle de perte de fonction. La surexpression du gène réduit la croissance d’hypocotyle et de tige de la plante avec accumulation de lignine dans la tige, mais le perte de fonction du gène ne produise pas de phénotype apparent. Par ailleurs, la surexpression du gène renforce la tolérance de la plante au stress salin, alors la perte de fonction du gène rend la plante plus sensible. L’analyse du transcriptome a révélé beaucoup plus de gènes réprimés qu’activés par la surexpression du gène JMJ15. Ces gènes réprimés sont préférentiellement marqué la H3K4me2 ou H3K4me3, parmi lesquels beaucoup codent de facteurs de transcription. Ces données suggèrent que l’induction de JMJ15 pourrait réguler le programme de l’expression génique qui coordonne la restriction de la croissance de la plante et la tolérance au stress. Ces travaux de thèse a permis ‘identifier quelques nouveaux éléments dans la compréhension de la fonction de régulateurs chromatiniens dans l’expression génique de la plante. / Chromatin remodeling and histone modification play important roles in the establishment and dynamic regulation of gene expression states. However, little is known regarding to the regulatory mechanism of chromatin modification and remodeling that control gene expression involved in plant development and responses to environmental cues. My thesis work concerns functional analysis of an Arabidopsis Chromodomain/Helicase/DNA-binding 1 (CHD1) type chromatin remodeling gene known as CHR5 and a histone demethylase gene that specifically removes methyl groups from methylated histone H3 lysine 4 (H3K4me), called JMJ15 in regulating chromatin structure or in resetting chromatin modifications that control the expression of plant developmental and stress responsive genes. In the first part of the study we found that CHR5 expression is activated during embryogenesis and remained to be expressed in developing organs/tissues. Analysis of mutants revealed that loss-of-function of the genes led to decreased expression of key embryo maturation genes LEC1, ABI3 and FUS3 in developing seeds and reduced seed storage protein accumulation. Analysis of double mutants revealed an antagonistic function between CHR5 and PKL, a CHD3 gene, in embryo gene promoter activity and seed storage protein accumulation. CHR5 was directly associated with the promoters of ABI3 and FUS3 and chr5 mutations led to increased nucleosome occupancy near the transcriptional start site. The results suggest that CHR5 is involved in nucleosome occupancy to regulate embryo identity genes expression, which is counterbalanced by PKL during embryo development. The second part of this study showed that expression of JMJ15 was restricted to a few tissues during vegetative growth. The jmj15 gain-of-function mutations reduced the length of seedling hypocotyls and inflorescence stems with higher accumulation of lignin in the stem, while the loss-of-function mutants did not show any visible phenotype. The gain-of-function mutants enhanced salt tolerance, whereas the loss-of-function mutants were more sensitive to salt. Transcriptomic analysis revealed a much higher number of genes down-regulated in JMJ15 over-expression plants, which are highly enriched for H3K4me3 and H3K4me2. Among the down-regulated genes, many encode transcription regulators of stress responsive genes. The data suggest that increased JMJ15 levels may regulate the gene expression program that may coordinate plant growth restrains and enhances stress tolerance. Taken together, my thesis work brought a few new elements to the current understanding of chromatin regulators function in plant gene expression.

Dans les cellules végétales, les canaux et les transporteurs anioniques sont essentiels pour les fonctions clés telles que la nutrition, l'homéostasie ionique et la tolérance aux stress biotiques ou abiotiques. Chez Arabidopsis thaliana, les membres de la famille CLC (pour ChLoride Channel), situés sur le tonoplaste, sont requis pour l'homéostasie du nitrate (AtCLCa et AtCLCb) ou impliqués dans la tolérance au sel (AtCLCc).Dans mon travail de thèse, j’ai identifié et caractérisé un canal chlorure, AtCLCg, chez A. thaliana. L'étude de la protéine fusion AtCLCg::GFP a révélé que cette protéine est localisée sur le tonoplaste. Deux lignés mutants indépendants d’insertion ADN-T, atclcg ont été sélectionnés. Les études physiologiques sur ces deux lignés ont démontré qu’AtCLCg joue un rôle dans le passage de chlorure mais pas dans l'homéostasie du nitrate au travers du tonoplaste. En effet, aucune différence de contenu en nitrate (NO3-) racinaire et foliaire n’a été observée entre le sauvage et les mutants dans nos conditions. Par contre, les plantes mutantes présentent un phénotype par rapport au sauvage lorsqu'elles se développent sur milieu de croissance contenant 75 mM NaCl: (i) une diminution de 20% de la masse fraîche ; (ii) une diminution de 16% de la longueur de racines primaires et une réduction de 19% du nombre de racines secondaires ; (iii) une sur-accumulation de 21% et 26% de chlorure et sulfate foliaire, respectivement. Ces phénotypes sont abolis chez les lignés complétées avec 35S::AtCLCg. De plus, les mutants atclcg présentent un phénotype similaire à la présence de 75 mM KCl, mais aucune différence n'est détectée en réponse à 140 mM mannitol. Ce résultat suggère que le phénotype d'hypersensibilité des mutants atclcg dépend du chlorure et non du l'effet osmotique du stress salin.Sachant qu’AtCLCg et AtCLCc partagent un haut degré d'homologie, environ 75% d'identité au niveau des protéines, et que les deux sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, nous avons généré le double mutant atclcc/atclcg. L’analyse phénotypique a montré que le double mutant ne présente pas un phénotype additif sur milieu de stress 75 mM NaCl. En parallèle, l'analyse de l'expression des gènes a montré qu’AtCLCg est réprimé dans le fond mutant atclcc, et inversement. Par ailleurs, l'analyse de l'expression de gène rapporteur démontre que PAtCLCg::GUS est fortement exprimé dans les cellules du mésophylle alors qu’une forte expression de PAtCLCc::GUS dans les cellules de garde et le pollen est observé. Ainsi, l’ensemble de ces résultats montrent que ces deux protéines AtCLCc et AtCLCg sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, mais elles n’ont pas de fonction redondante. / In plant cells, anion channels and transporters are essential for key functions such as nutrition, ion homeostasis and, resistance to biotic or abiotic stresses. In Arabidopsis thaliana, members of the ChLoride Channel (CLC) family located on the tonoplast have been shown to be required for nitrate homeostasis (AtCLCa, AtCLCb) or involved in salt tolerance (AtCLCc). In this study, we identified and characterized the chloride channel AtCLCg in A. thaliana. Use of an AtCLCg:GFP fusion revealed the localization of this protein on the tonoplast. Studies on the disruption of the AtCLCg gene by a T-DNA insertion in two independent lines demonstrated that AtCLCg is involved in response to salt stress and not in nitrate homeostasis in our conditions. Although no difference in shoot and root NO3- content is observed, mutant plants show a phenotype compared to wild-type when they are grown on 75 mM NaCl: (i) a decrease by 20% of total plant fresh weight; (ii) a diminution by 16% of primary root length and a reduction by 19% of secondary root number; (iii) an over-accumulation of chloride and sulfate in shoots by 21% and 26% respectively. These phenotypes are abolished in complemented lines with 35S::AtCLCg. atclcg mutants show a similar phenotype in the presence of 75 mM KCl, but no difference is detected in response to 140 mM mannitol. This result suggests that the hypersensitivity phenotype of atclcg mutant depends on the ionic component and not on osmotic effect of salt stress.Knowing that AtCLCg and AtCLCc share a high degree of homology, approximately 75% of identity at protein level, and both are involved in response to salt stress, we generated a clcc/clcg double mutant. Phenotypic analysis showed that the two KO mutations do not have additive effect under salt stress of 75 mM NaCl. In parallel, gene expression analysis showed that AtCLCg is repressed in the clcc mutant background, and conversely. Expression analysis of reporter gene displayed a different pattern for PAtCLCg::GUS, strongly expressed in mesophyll cells, compared with a strong expression of PAtCLCc::GUS in guard cells and pollen. Altogether these results demonstrate that both AtCLCc and AtCLCg are involved in response to salt stress but they are not functionally redundant.

Les plantes dans leur milieu naturel, sont constamment soumises à de multiples contraintes environnementales de nature biotique ou abiotique qui sont à l'origine de nombreuses pertes de rendement. Afin de répondre à ces stress, les plantes mettent en place des réponses adaptées qui reposent sur l'activation de voies de signalisations. L'une des voies importantes est celle impliquant la phosphorylation des protéines par les Mitogen Activated Protein Kinase (MAPKs). La régulation de l'activité des MAPKs est indispensable et dépend en partie de protéines phosphatases telles que les MAPK Phosphatases (MKPs). Ce travail a consisté à étudier les mécanismes de régulation de l'activité phosphatase de TMKP1, la seule MKP connue de blé dur, par les calmodulines et les protéines 14-3-3. Dans un premier temps, nous avons montré que l'activité phosphatase de TMKP1 est stimulée en présence des ions K+, Li+, Mg 2+ et surtout par le Mn2+. Des expériences de GST pull dawn ont permis de mettre en évidence une interaction, calcium dépendante, entre TMKP1 et la calmoduline (CaM) et nous avons démontré que l'activité de TMKP1 est inhibée par le complexe CaM/Ca2+. En revanche, ce même complexe stimule l'activité de TMKP1 en présence des ions Mn 2+. Ce mode de régulation d'une MKP par CaM/Ca2+ dépendant des ions Mo2+ est décrit ici pour la première fois. Dans un second temps, la présence au niveau de la séquence de TMKP1 d'un domaine de liaison aux protéines 14-3-3s, nous a incité à mener des essais d'immunoprécipitation à l'issue desquelles nous avons montré que TMKP1 pourrait interagir avec les 14-3-3s chez le Blé et que celles-ci stimulent l'activité phosphatase de TMKP1 in vitro. Enfin, l'implication de TMKP1 dans la réponse des plantes aux stress biotiques et abiotiques a été évaluée. Les tests de gennination ont révélé que la sur-expression de TMKP1 chez Arabidopsis permet une meilleure tolérance à la salinité. Ces mêmes plantes semblent également être plus résistantes à une infection bactérienne causée par Pseudomonas syringae que des plantes sauvages. Ces données suggèrent que TMKP1 agirait comme régulateur positif de la réponse d'Arabidopsis au stress salin et à l'infection P. syringae. L'ensemble des résultats obtenus ici a permis de dévoiler de nouvelles propriétés jamais décrites chez une MKP végétale et offre une nouvelle vision sur le rôle de ces phosphatases dans le contrôle des voies de signalisations MAPKs impliquées dans la réponse des plantes aux stress de l'environnement. / Due to their sessile lifestyle, plants are constantly subjected to a variety of biotic and abiotic stresses causing tremendous yield losses. To survive under these conditions, plants have evolved different sigualing pathways allowing efficient stress responses. The Mitogen Activated Protein Kinase (MAPKs) are key sigual transduction molecules, which respond to varions external stimuli. However, the activity of MAPKs has to be strictly regulated by protein phosphatase such as MAPK Phosphatase (MKPs). ln the present study we describe the regulation ofTMKPI, a wheat MKP, by Calmodulins (CaM) and 14-3-3 proteins. We fust showed that phosphatase activity oTMKP1 is stimulated by K\ Li\ Mg2+ and especially by Mo2+. Using GST pull dawn assays, we demonstrated that TMKP1 binds to CaM in a Ca2+-dependent manner. Moreover, the CaM/Ca2+ complex inhibits the catalytic activity of TMKP1 in a CaM-dose dependent marmer. However, in the presence of Mo2+, this activity is enhanced by CaM/Ca2+ complex. Such effects were not reported so far, and raise a possible role for CaM and Mo 2+ in the regulation of plant MKPs during cellular response to extemal siguals. Moreover, a fine sequence analysis ofTMKPl revealed the presence of a conserved 14-3-3 mode 1 binding site. This finding incited us to perfonn co-immunoprecipitation assays on wheat protein extracts through which we provide proof-of-concept evidence for interaction of TMKP1 with 14-3-3 proteins. Interestingly, the phosphatase activity of TMKP1 was shawn to be enhanced by several plant and yeast 14-3-3 isoforms. Finally, the involvement of TMKP1 in plant stress responses was evaluated. Our data showed that the overexpression of TMKP1 in Arabidopsis resulted in a higher tolerance to salt stresses and to bacterial infection caused by P. syringae. Such findings suggest thal TMKP1 may act as a positive regulator of Arabidopsis responses to salt stresses and P. syringae infection. All together, our results provide novel functional properties for plant MKPs, and should add new knowledge to our understanding of the raie of these phosphatases in the control of MAPK signaling pathways controlling plant responses to various environmental stresses.

Chez les végétaux supérieurs, la régulation des mouvements stomatiques permet de contrôler les échanges de CO2 et la montée de la sève brute tout en limitant les pertes excessives d'eau par transpiration. Ce contrôle est assuré par des variations rapides de la turgescence des deux cellules de garde formant le stomate dues à l'activité de nombreux canaux et transporteurs ioniques. Nous avons identifié un nouveau membre de la famille des CLC chez A. thaliana, AtCLC-c exprimé dans la cellule de garde. L'étude de l'expression d'AtCLC-c et du phénotype de mutants invalidés ont permis de démontrer son rôle dans l'ouverture stomatique à la lumière et la fermeture en réponse à l'ABA. Les mutants clcc accumulent moins d'ions Cl- dans leurs cellules de garde par rapport aux plantes sauvages et sont hypersensibles à un stress salin. Enfin, nous avons confirmé par des études d'électrophysiologie la sélectivité d'AtCLC-c aux ions Cl-. L'ensemble de ce travail montre l'importance du transporteur vacuolaire d'ions Cl- AtCLC-c dans les mouvements stomatiques et la tolérance au stress salin. / In plants, the high turgor is assured by ion transport and involves the creation and maintenance of a large vacuolar volume. In recent years, various chloride channels and transporters have been identified to be involved in specific functions such as plant nutrition, stomatal movements or metal tolerance. We have characterized a new member of the CLC family in A. thaliana, AtCLC-c, highly expressed in guard cell and up-regulated by ABA and salt treatment in the whole plant. Knock-out mutants in AtCLC-c are impaired in light-induced stomatal opening and ABA-induced stomatal closing correlated to a large decrease in guard cell Cl- content. Furthermore, clcc mutants are hypersensitive to salt stress compared to wild-type. Finally, using electrophysiological studies, we demonstrated that AtCLC-c is selective to Cl-. Altogether, this work shows that AtCLC-c is a tonoplastic Cl- transporter involved in stomatal movements and salt tolerance.

Le stress salin est l'un des principaux facteurs environnementaux limitant la croissance des plantes et entraînant des pertes de rendement des cultures céréalières. Il est ainsi impératif de développer des variétés plus tolérantes à la salinité afin d’augmenter leurs rendements et assurer la sécurité alimentaire. La voie signalétique reliant la perception du stress salin à la réponse cellulaire, encore peu connue, a été abordée ici par l’étude des protéines RSS1-like conservées chez les plantes. La protéine RSS1 (Rice Salt Sensitive 1) du riz joue un rôle primordial dans la tolérance au stress salin en agissant à l’interface entre la perception des stress et le contrôle du développement et de la division dans les méristèmes. Lors de ce travail, l'homologue de RSS1 nommé TdRL1 (Triticum durum RSS-Like 1) a été isolé à partir de la variété tunisienne de blé dur “Oum Rabiaa“. Nous avons démontré que TdRL1 porte les motifs D et DEN-Box conservés impliqués dans la régulation post-traductionnelle de la protéine. En outre nous avons apporté la preuve que TdRL1 est l’homologue fonctionnel de RSS1 puisqu'il est capable de complémenter le mutant de perte de fonction rss1, hypersensible au stress salin. En outre, l’expression hétérologue de TdRL1 améliore la tolérance au stress salin chez la levure ainsi que chez Arabidopsis et ce par l’augmentation du pouvoir germinatif et la réduction de l’accumulation des espèces oxygénées réactives. Nos études cytologiques ont montré que la protéine TdRL1 est cytoplasmique en interphase et se localise au niveau des microtubules kinétochoriens pendant la mitose. Remarquablement, TdRL1 change de localisation cellulaire sous stress salin et montre une accumulation partielle dans le noyau, soulignant le caractère multifonctionnel de cette protéine dans la réponse au stress salin. L’ensemble des données suggère que sous contrainte saline, TdRL1 joue un rôle dans la régulation du cycle cellulaire en relation avec le réseau microtubulaire. L‘étude de la famille RSS1-like multifonctionnelle permettra ainsi d’aborder de nouvelles voies de recherche pour la création variétale de blé plus résilientes aux stress de l'environnement. / Salt stress is one of the main environmental factors limiting plant growth and yield in cereal crops. It is therefore imperative to develop varieties more tolerant to salt stress in order to increase yield and ensure food security. The signaling pathway linking salt stress perception to cellular response was addressed here by studying RSS1-like proteins in plants. RSS1 (Rice Salt Sensitive 1) protein plays an important role in salt stress tolerance. It acts at the interface of stress perception and developmental control and division in meristems. During this work, the RSS1 counterpart named TdRL1 (Triticum durum RSS-Like 1) was isolated from the durum wheat Tunisian variety "Oum Rabiaa". We have demonstrated that TdRL1 carries the conserved D and DEN-Box motifs involved in the post-translational regulation of the protein. In addition, we show that TdRL1 is the functional homologue of RSS1 since it was able to complement the loss-of-function mutant rss1, hypersensitive to salt stress. In addition, heterologous expression of TdRL1 enhances salt stress tolerance in yeast and in Arabidopsis by increasing germination and reducing the accumulation of reactive oxygen species. Our cytological studies have shown that the TdRL1 protein is cytoplasmic in interphase and is localized at the spindle during mitosis. Remarkably, TdRL1 changes its subcellular localization under salt stress treatment and shows a partial accumulation in the nucleus, highlighting the multifunctional nature of this protein during salt stress response. Our data suggest that under salt stress, TdRL1 plays a role in the regulation of the cell cycle in relation with the microtubule network. Pursuing the study of RSS1-like multifunctional proteins will open up new research areas for the creation of wheat varieties that are more resilient to environmental stresses.

Dans les cellules végétales, les canaux et les transporteurs anioniques sont essentiels pour les fonctions clés telles que la nutrition, l'homéostasie ionique et la tolérance aux stress biotiques ou abiotiques. Chez Arabidopsis thaliana, les membres de la famille CLC (pour ChLoride Channel), situés sur le tonoplaste, sont requis pour l'homéostasie du nitrate (AtCLCa et AtCLCb) ou impliqués dans la tolérance au sel (AtCLCc).Dans mon travail de thèse, j'ai identifié et caractérisé un canal chlorure, AtCLCg, chez A. thaliana. L'étude de la protéine fusion AtCLCg::GFP a révélé que cette protéine est localisée sur le tonoplaste. Deux lignés mutants indépendants d'insertion ADN-T, atclcg ont été sélectionnés. Les études physiologiques sur ces deux lignés ont démontré qu'AtCLCg joue un rôle dans le passage de chlorure mais pas dans l'homéostasie du nitrate au travers du tonoplaste. En effet, aucune différence de contenu en nitrate (NO3-) racinaire et foliaire n'a été observée entre le sauvage et les mutants dans nos conditions. Par contre, les plantes mutantes présentent un phénotype par rapport au sauvage lorsqu'elles se développent sur milieu de croissance contenant 75 mM NaCl: (i) une diminution de 20% de la masse fraîche ; (ii) une diminution de 16% de la longueur de racines primaires et une réduction de 19% du nombre de racines secondaires ; (iii) une sur-accumulation de 21% et 26% de chlorure et sulfate foliaire, respectivement. Ces phénotypes sont abolis chez les lignés complétées avec 35S::AtCLCg. De plus, les mutants atclcg présentent un phénotype similaire à la présence de 75 mM KCl, mais aucune différence n'est détectée en réponse à 140 mM mannitol. Ce résultat suggère que le phénotype d'hypersensibilité des mutants atclcg dépend du chlorure et non du l'effet osmotique du stress salin.Sachant qu'AtCLCg et AtCLCc partagent un haut degré d'homologie, environ 75% d'identité au niveau des protéines, et que les deux sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, nous avons généré le double mutant atclcc/atclcg. L'analyse phénotypique a montré que le double mutant ne présente pas un phénotype additif sur milieu de stress 75 mM NaCl. En parallèle, l'analyse de l'expression des gènes a montré qu'AtCLCg est réprimé dans le fond mutant atclcc, et inversement. Par ailleurs, l'analyse de l'expression de gène rapporteur démontre que PAtCLCg::GUS est fortement exprimé dans les cellules du mésophylle alors qu'une forte expression de PAtCLCc::GUS dans les cellules de garde et le pollen est observé. Ainsi, l'ensemble de ces résultats montrent que ces deux protéines AtCLCc et AtCLCg sont impliquées dans la réponse au stress salin de la plante, mais elles n'ont pas de fonction redondante.

Deux espèces sauvages de tournesols Helianthus annuus et H. petiolaris ont donné naissance il y a plusieurs milliers d'années à une espèce hybride H. paradoxus inféodée à des marais salins. Ma thèse a consisté à caractériser les bases génétiques de l'adaptation de H. paradoxus à ce milieu extrême.<br />J'ai recherché des signatures de sélection à deux échelles : à l'échelle du génome et à une échelle plus fine comprise entre 20 et 90 cM. Pour cela j'ai analysé les patrons de diversité génétique pour des marqueurs microsatellites dans trois populations naturelles de H. paradoxus et des deux espèces parentales, autour de trois QTL de survie et ailleurs dans le génome. A l'échelle du génome, une baisse de diversité autour de ces QTL a été mise en évidence chez l'espèce hybride et non chez ses parents indiquant qu'il est possible de détecter une signature de la sélection à cette échelle chez cette espèce. A l'échelle plus fine, le patron de diversité est en mosaïque. L'ordre des marqueurs n'étant pas connu avec certitude chez l'espèce hybride, une méthode basée sur le déséquilibre de liaison entre des marqueurs génotypés dans des populations naturelles a été développée. Cette méthode permet de regrouper sur une carte des marqueurs en fort déséquilibre de liaison. La correspondance entre carte de déséquilibre de liaison et carte génétique varie selon les populations et l'échelle génétique.<br />Parallèlement une étude physiologique et d'expression génique visant à comprendre le mécanisme d'adaptation à la salinité de H. paradoxus a été conduite. L'espèce hybride est très plastique, mais se porte mieux en milieu salin, ses feuilles sont plus succulentes, avec une concentration en sodium et sulfate très élevée dans ses tissus. Plusieurs gènes candidats, impliqués dans différentes voies de réponse à la salinité, et dont certains sont cartographiés dans les régions des QTL, sont différentiellement exprimés chez l'espèce hybride et chez ses parents. Ces résultats confirment qu'ils sont des candidats potentiels importants dans l'adaptation de H. paradoxus aux marais salins et donc impliqués dans le processus de spéciation.

Ce travail de thèse s'inscrit dans un projet régional, initié par le Parc du Lubéron et en collaboration avec le Laboratoire de Pharmacognosie et d'Ethnopharmacologie de l’Université de Marseille. Il avait pour objectif d'étudier la possibilité de domestiquer une plante sauvage, Inula montana L. (Asteraceae) connue dans la pharmacopée provençale pour ses effets anti traumatiques semblables à ceux d'Arnica montana L. et de la proposer comme nouvelle production agricole. Inula montana produit notamment des lactones sesquiterpènes, identifiées comme les métabolites secondaires responsables de ses aptitudes biologiques anti inflammatoires. Il s’est agit dans cette étude1) de déterminer les caractéristiques de croissance et de développement de la plante sauvage largement inconnue et d’identifier en conditions naturelles les facteurs les plus favorables à la production de métabolites secondaires, 2)d’étudier sa capacité à se multiplier végétativement in vitro et à former des cultures cellulaires aptes à synthétiser les molécules d’intérêt 3), de proposer un itinéraire technique applicable agronomiquement et 4) de tester les effets de divers facteurs environnementaux (fertilisation, apport de NaCl, modification du rythme circadien de l’éclairement,rayonnement UVB, ablation de feuilles, application de méthyl jasmonate ) sur la production qualitative et quantitative des lactones sesquiterpènes et des composés phénoliques. Les traits phénologiques de la plante sauvage sont impactés par l’altitude qui induit un retard dans la croissance végétative et la phase reproductrice ainsi que des modifications physiologiques et morphologiques. Les teneurs en métabolites secondaires (certaines lactones sesquiterpènes, les polyphénols totaux et flavonoïdes) varient en fonction de la saison et sont plus importantes dans le site qui présente les conditions climatiques les plus contraignantes du point de vue hydrique (sol drainant,température plus élevée et présence d’une période sèche en été). L’observation microscopique a indiqué la présence de deux types de trichomes : glandulaires (bisériés) et non glandulaires (des poils) qui sont potentiellement les structures porteuses des molécules d’intérêt. I. montana est apte à former des cals in vitro à partir d’explants racinaires, foliaires et caulinaires sur lesquels des pousses feuillées se forment. La domestication d’Inula a été réussie à partir de semences issues des plantes sauvages et en conditions agronomiques, les teneurs en lactones sesquiterpènes (costunolide, artémorine, eldarine et hydrocostunolide) et en composés phénoliques sont généralement plus élevées que chez les plantes sauvages. Les différentes contraintes appliquées pour tester les effets des facteurs environnementaux sur la production des métabolites ont montré : 1) qu’il ne peut pas être établi de corrélation entre la présence d’un stress oxydatif et une augmentation des teneurs en métabolites chez Inula 2) que l’accumulation des lactones et composés phénoliques semblent principalement favorisée lorsque la plante dispose d’un surplus de squelettes carbonés, non utilisés pour la croissance 3) enfin, les deux conditions les plus favorables à l’accumulation des métabolites chez Inula, sont : dans les feuilles, une alternance rapide de lumière et d’obscurité durant la photopériode et dans les capitules, l’application de méthyl jasmonate. Ce travail augure de bonnes perspectives en termes de valorisation d’Inula dans le secteur pharmaco-cosmétologique. Il reste à poursuivre la description du profil phytochimique de la plante et à localiser précisément les organes et/ou sous structures anatomiques concentrant les composés considérés. Ayant démontré que cette plante présente une bonne réponse à la domestication, il est également proposé de poursuivre l’étude des leviers environnementaux susceptibles d’influencer positivement et significativement le profil chimique d’Inula. / This thesis work is part of a regional project, initiated by the Luberon Park and in collaboration with the Laboratory of Pharmacognosy and Ethnopharmacology of the University of Marseille. It aimed to study the possibility of domesticating a wild plant, Inula montana L. (Asteraceae) known in the Provençal pharmacopoeia for its anti-traumatic effects similar to those of Arnica montana L. and to propose it as a new agricultural production. Inula montana produces lactones sesquiterpenes, identified as the secondary metabolites responsible for its biological anti-inflammatory properties. In this study, 1) to determine the growth and development characteristics of the largely unknown wild plant and to identify under natural conditions the most favorable factors for the production of secondary metabolites, 2) to study its characteristics. ability to multiply vegetatively in vitro and to form cell cultures able to synthesize the molecules of interest 3), to propose an agronomically applicable technical itinerary and 4) to test the effects of various environmental factors (fertilization, NaCl supply, modification circadian rhythm of illumination, UVB radiation, ablation of leaves, application of methyl jasmonate) on the qualitative and quantitative production of sesquiterpene lactones and phenolic compounds. The phenological characteristics of the wild plant are impacted by the altitude which induces a delay in the vegetative growth and the reproductive phase as well as physiological and morphological modifications. Levels of secondary metabolites (certain sesquiterpene lactones, total polyphenols and flavonoids) vary according to the season and are more important in the site which has the most water-constraining climatic conditions (draining soil, higher temperature and presence of a dry period in summer). Microscopic observation indicated the presence of two types of trichomes: glandular (biseriate) and non-glandular (hair) which are potentially the carrying structures of the molecules of interest. I. montana is able to form calli in vitro from root, foliar and shoot explants on which leafy shoots are formed. The domestication of Inula has been successful from seed from wild plants and under agronomic conditions, sesquiterpene lactone (costunolide, artemorine, eldarin and hydrocostunolide) and phenolic compounds are generally higher than in wild plants. The different constraints applied to test the effects of environmental factors on the production of metabolites have shown: 1) that there can be no correlation between the presence of oxidative stress and an increase in metabolite levels in Inula 2) that the accumulation of lactones and phenolic compounds seems mainly favored when the plant has a surplus of carbon skeletons, not used for growth; 3) finally, the two most favorable conditions for the accumulation of metabolites in Inula, are: in the leaves, a rapid alternation of light and darkness during the photoperiod and in the flower heads, the application of methyl jasmonate. This work augurs good prospects in terms of valuation of Inula in the pharmaco-cosmetological sector. It remains to continue the description of the phytochemical profile of the plant and to precisely locate the organs and / or anatomical substructures concentrating the compounds in question. Having demonstrated that this plant has a good response to domestication, it is also proposed to continue the study of environmental levers likely to positively and significantly influence the chemical profile of Inula.